全 文 ：Vol. 32 No. 6
Jun. 2012
第 32卷 第 6期
2012年 6月
中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
Journal of Central South University of Forestry & Technology
收稿日期：2012-01-17
基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项项目“蛇皮果栽后遮荫和灌溉技术研究”(编号：RITFKYYW2010-02)；国家
林业局 948引进项目“蛇皮果栽培品种及配套栽培技术引进”（编号：2007-4-11）
作者简介：李建光 (1984—)，男，河北廊坊人，硕士研究生，主要从事种苗培育理论与技术研究
通讯作者：李荣生 (1975—)，男，福建仙游人，博士，副研究员，主要研究蛇皮果和棕榈藤的种质资源收集及其评估、育种和培育
理论及技术；E-mail:fjlrs@tom.com
蛇皮果 Salacca zalacca (Gaertner) Voss ex. Vilm.
（=S. edulis Reinw）为棕榈科 Palmae蛇皮果属果树，
具有果实外形奇异、果肉铁钙含量高、林下作业
不晒和经营期长等优点，可在我国海南和云南热
带地区栽培 [1-2]。
有性繁殖是蛇皮果繁殖的重要方式，然而雌
雄异株的蛇皮果通过有性繁殖生产的实生苗难以从
形态上区分性别，而性别不分的实生苗造林后容易
产生雌株分布不均、单产低和调整成本高等问题。
因此蛇皮果实生苗性别鉴定是蛇皮果栽培亟需解决
的问题之一。目前在银杏和大麻上已可利用基因
蛇皮果基因组 DNA提取及其 RAPD 条件优化
李建光，李荣生，李发根，尹光天，杨锦昌，邹文涛
（中国林业科学研究院 热带林业研究所，广东 广州 510 520）
摘 要：以蛇皮果顶梢嫩叶为材料，比较了 CTAB法、改良 CTAB法、CTAB-free法和 SDS法对基因组 DNA
的提取效果，并对蛇皮果 RAPD反应体系进行优化。结果表明，CTAB法、改良 CTAB法和 CTAB-free法均能
提取出蛇皮果基因组 DNA，其中 NaCl浓度为 5 mol/L的改良 CTAB法因可更有效地去除多糖及酚类物质，并能
满足 PCR扩增的要求而被认为是蛇皮果基因组 DNA提取的最适方法；在 15 μL的 PCR扩增体系中，Mg2+、
dNTPs和 Taq DNA聚合酶的最优浓度分别为 1.4 mmol/L、0.12 mmol/L和 0.12 U/μL；P CR反应程序的最适退
火温度为 39 ℃。
关键词：蛇皮果；DNA提取；RAPD优化
中图分类号：S789.5 文献标志码：A 文章编号：1673-923X(2012)06-0110-05
DNA extraction and RAPD Condition optimization
for Salacca edulis Reinw
LI Jian-guang, LI Rong-sheng, LI Fa-gen, YIN Guang-tian , YANG Jin-chang, ZOU Wen-tao
(Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520, Guangdong, China)
Abstract: By taking the tender leaves on top-shoots of Salacca edulis as tested materials, the extraction effects of CTAB, improved
CTAB, CTAB-free and SDS on the genomic DNA of salak were investigated and compared. And the reaction system of salak RAPD
was optimized. The results show that CTAB, improved CTAB, CTAB-free all could extracted out genomic DNA from s alak, of them,
the improved CTAB with NaCl concentration of 5 mol/L could more effectively remove polysaccharides and polyphenols than the other
two methods, and meet the requirement of PCR amplifi cation, so it is the best method. The optimal concentrations of Mg2+, dNTPs, Taq
DNA polymerase and the annealing temperature are 1.4 mmol/L、0.12 mmol/L, 0.12 U/μL and 39 ℃ respectively for the PCR progress
for salak.
Key words: Salacca edulis; salak; DNA extraction; RAPD optimization
组 DNA分子标记技术鉴定实生苗性别 [3-4]，理论
上基因组 DNA分子标记技术也可用于蛇皮果实生
苗性别鉴定。基因组 DNA分子标记技术的首要工
作是植株基因组 DNA提取及其 PCR扩增。然而
目前如何提取蛇皮果基因组 DNA及其 PCR扩增
却还不清楚。有鉴于此，本研究以蛇皮果叶片为
材料，筛选出蛇皮果基因组 DNA的提取方法和
RAPD(Random Amplifi ed Polymorphic DNA，随机
扩增多态性 DNA)反应体系最佳条件，从而为开
发 RAPD分子标记鉴定蛇皮果性别和蛇皮果分子
生物学研究提供技术支撑。
DOI:10.14067/j.cnki.1673-923x.2012.06.026
111第 32卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
CTAB法相同。
1.2.4 SDS法
SDS法主要是将 CTAB法中的提取液换成 2
％ SDS提取液，其它步骤与 CTAB法相同 [7]。
1.3 PCR扩增方案的优化
1.3.1 扩增体系的优化因子
扩增体系的优化因子包括Mg2+浓度、dNTPs
浓度和 Taq DNA聚合酶浓度（见表 1）。PCR扩
增体系的优化以改良 CTAB法提取的蛇皮果基因
组 DNA为材料，利用随机引物 S2007、S2008、
S2009、S2010、S2011、S2074、S2075、S2076、
S2077、S2078、S2081、S2082、S2083、S2084、
S2085进行 (引物序列见表2，均购自Sangon公司 )。
15 μL扩增反应体系基本组成为：1.5 μL 10×缓冲
液 [Tris-HCl 100 mmol/L(pH 9.0)、KCl 100 mmol/
L、NP-400.5 %、(NH4)2SO4 80 mmol/L]、0.2
mmol/L dNTPs、0.1 U/μL Taq DNA 聚 合 酶、1.8
mmol/L Mg2+、1.0 μmol/L RAPD引物、12 ng DNA
模板，补加 ddH2O至 15 μL。
表1　蛇皮果PCR扩增体系的优化设计
Table 1 The optimization design of salak PCR
amplification system
水平 Mg
2+

/(mmol·L-1)
dNTPs
/(mmol·L-1)
Taq DNA聚合酶
/(U·μL-1)
1 0.6 0.04 0.03
2 1.0 0.08 0.06
3 1.4 0.12 0.09
4 1.8 0.16 0.12
表2 蛇皮果基因组DNA扩增优化所用RAPD 随机引物
名称及其碱基序列
Table 2 The RAPD random primers and base sequences
of this study
扩增体系优化所用引物 扩增程序优化所用引物 优化结果检验所用引物
引物
编号
碱基序列
(5′→ 3′)
引物
编号
碱基序列
(5′→ 3′)
引物
编号
碱基序列
(5′→ 3′)
S2007 GGGTCGCATC S2093 TCGGTGAGTC S23 AGTCAGCCAC
S2008 CCACAGCCGA S2094 CTTTGCGCAC S24 AATCGGGCTG
S2009 GGAACTCCAC S2095 TTCGGCGATG S25 AGGGGTCTTG
S2010 GGACGTTGAG S2096 CTCCACGACT S26 GGTCCCTGAC
S2011 CCACCTTCAG S2097 GGGAAAAGCC S27 GAAACGGGTG
S2074 TCCCTGTGAG S28 GTGACGTAGG
S2075 TGTCGTGGTC S29 GGGTAACGCC
S2076 GAACTCCCAG S30 GTGATCGCAG
S2077 GTTCGCTCCC S31 CAATCGCCGT
S2078 ACGCACACTC S32 TCGGCGATAG
S2081 CACTCCTGGT
S2082 ACGCCTGTAG
S2083 TGGACTCGGT
S2084 CCCAAGCGAA
S2085 GGAACGCTAC
1 材料与方法
1.1 采样
采样果林位于海南省定安县黄竹镇南海农场
试验场，20世纪 90年代中期种植，种源来自印度
尼西亚。采集时间为 2011年 5月，共选择 20棵
长势健康的植株，采集植株中上部叶子的中上部
新鲜的叶片，采下后用卫生纸除去表面灰尘及水
分，每棵用塑料袋单独封装，一起用冰袋保鲜，
带回实验室后在 -70 ℃下保存。
1.2 基因组 DNA提取方法
1.2.1 CTAB法
采用 CTAB法进行蛇皮果叶片的总 DNA提
取，具体步骤如下：预先在 10 mL离心管中加入 4
mL 2％ CTAB提取液（CTAB 20 g/L，NaCl 81.816
g/L，EDTA 9.306 g/L，Tris-HCl 12.114 g/L，pH
8.0），65 ℃保温。称取蛇皮果叶片 1.2 g，剪碎，
放入研钵，加液氮研磨至粉末状。将研磨好的粉
末状叶样加入预热的提取液中，封口，65 ℃保
温 60 min，每隔 10 min 摇动 1 次。将样品在
离心机上用 11 000 r·min-1离心 10 min，然后取
上清液。往上清液中加入氯仿∶异戊醇（24∶ 1）
混合液 4 mL，摇匀，再 11 000 r·min-1 离心
10 min，取上清液；重复 1次本步骤。向上清液中
加入 4 ℃冷藏的 2 mL异丙醇，轻轻晃动混匀，在
-20 ℃下静置 1 h以上。取冷冻液，11 000 r·min-1
离心 10 min，倒掉上清液，加入 2 mL无水乙醇洗
两次，洗后将管倒置于卫生纸上吸干，在真空浓
缩仪中干燥 5 min左右。加入 1 mL 1×TE，溶解
沉淀的 DNA，弹动或震荡以充分溶解，放入冰箱
备用。DNA浓度通过与 100 bp DNA Ladder（购自
Sangon公司）的 500 bp片段亮度对比进行 [5]。
1.2.2 改良 CTAB法
改良的 CTAB法是在 2％ CTAB提取液中加
入了 2％ β-巯基乙醇和 5％ PVP-40，而且在加入
4℃冷藏的 2 mL异丙醇之前加入 2 mL浓度为 5
mol/L的 NaCl，其它步骤与 CTAB法相同。
1.2.3 CTAB-free法
CTAB-free法首先将研磨好的蛇皮果叶样加
入到 4 mL CTAB-free 提取液（PVP 15 g/L，NaCl
81.816 g/L，EDTA 9.306 g/L，Tris-HCl 12.114 g/L，
pH 8.0）和 2％ β-巯基乙醇中，在冰上冰浴 10 min，
然后 7 000 r·min-1离心 10 min，去掉上清液 [6]。在
沉淀中加入 3％ CTAB提取液，其它步骤与改良
李建光，等：蛇皮果基因组 DNA提取及其 RAPD条件优化112 第 6期
1.3.2 扩增程序的优化
PCR扩增程序的优化是在优化的扩增体系
的基础上，以改良 CTAB法提取的蛇皮果基因
组 DNA 为材料，利用 S2093、S2094、S2095、
S2096和 S2097共 5个随机引物进行 (引物序列
见表 2)。基本扩增程序为：94 ℃预变性 2 min；
再 40个循环：94 ℃变性 30 s，36 ℃退火 30 s和
72 ℃延伸 2 min；最后 72 ℃延伸 10 min。扩增
程序的优化主要是针对退火温度的调节，退火温
度设置为 34 ℃、36 ℃、38 ℃、40 ℃、42 ℃、
44 ℃。PCR扩增仪为 GeneAmp PCR System 2700
(Applied Biosystem Co.) 。扩增产物用含有 0.05
μL/mL Gold ViewTM（购自北京赛百盛基因技术
有限公司）的 1.2 %琼脂糖凝胶在 0.5×TBE缓冲
液中电泳分离检测，电泳结果通过WD-9403F紫
外仪成像。
1.3.3 优化结果的检验
在完成 1.3.1和 1.3.2内容后总结出优化的扩
增体系参数，利用蛇皮果 1个 DNA样品，采用该
扩增体系和编号为 S23-32的随机引物 (引物序列
见表 2) 进行扩增，观察扩增后的电泳谱带，检验
优化体系的适用性。
2 结果与分析
2.1 DNA提取方法
4种方法提取的 DNA的电泳如图 1所示。
由图可以看出，改良 CTAB 法、CTAB-free 法
和 CTAB法均能提取出蛇皮果的基因组 DNA，
而 SDS法提取的效果较差。然而 3种可提出基因
组 DNA的方法中，CTAB-free法跑出的条带比较
分散，CTAB法跑出的条带有拖尾现象，而改良
CTAB法提取的蛇皮果基因组 DNA在质量和数量
上均能满足大量 PCR扩增的需要，可以作为优先
选用的方法。
2.2 PCR扩增体系的优化
2.2.1 Mg2+的最佳浓度
不同Mg2+浓度扩增后的电泳结果见图 2，图
中 11～ 15谱带比M除外的其它谱带清晰，其对
应的Mg2+浓度为 1.4 mmol/L，即此浓度为蛇皮果
基因组 DNA扩增体系中Mg2+的最佳浓度。
2.2.2 dNTPs最佳浓度
图 3显示 dNTPs 浓度在 0.12 mmol/L产生的
条带比较清晰，因而此浓度为蛇皮果基因组 DNA
扩增体系中 dNTPs的最佳浓度。
2.2.2 Taq DNA聚合酶浓度
Taq DNA聚合酶浓度在 0.09 U/μL时条带已经
很清晰（见图 4），但引物 S2078在 0.12 U/μL时
才扩增出了条带，为了最大限度的扩增出条带将
Taq DNA聚合酶浓度定在 0.12 U/μL。
2.2.3 退火温度
对于 PCR扩增程序中退火温度的调节（见图
5），从图中可看到在较大片断（1 500 bp） 的扩增中，
6个温度梯度的清晰度差异并不太大。而扩增出的
较小片段中，38 ℃和 40 ℃得到的条带更清晰些，
取其中间值为 39 ℃。
2.2.4 优化结果的检验
利用上述优化的扩增体系和扩增程序对蛇皮
果 1个样品 10个随机引物的扩增表明 (见图 6)，
多数条带清晰，扩增背景比较干净，扩增片断的
大小范围也较大。所以，最终确定蛇皮果 RAPD
注：M：100 bp DNA标准分子量；Mg2+浓度 1～ 5：0.6 mmol/L；6～ 10：1.0 mmol/L；11～ 15：1.4 mmol/L；16～ 20：1.8 mmol/L。每个浓度梯度下
5个泳道从左到右依次是引物 S2007、S2008、S2009、S2010、S2011对 1个蛇皮果样品的扩增产物。
图 2 不同Mg2+浓度的蛇皮果基因组 DNA扩增体系扩增的 DNA的电泳谱带
Fig. 2 The RAPD PCR results with different concentrations of Mg2+
注：M：100 bp DNA标准分子量；1、2：CTAB-free法；3、4：改良
CTAB法；5、6：CTAB法；7、8：SDS法。
图1 蛇皮果不同方法提取的基因组DNA的电泳结果
Fig. 1 Pattern of genome DNA by different methods
113第 32卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
技术的 PCR扩增体系为 15 μL体系：10×buffer
1.5 μL，0.12 mmol/L dNTPs，0.12 U/μL Taq DNA
聚合酶，1.4 mmol/L Mg2+，1.0 μmol/L RAPD引物，
12 ng DNA模板。PCR扩增程序为：94 ℃预变性
2 min；再 40个循环：94 ℃变性 30 s，39 ℃退火
30 s和 72 ℃延伸 2 min；最后 72 ℃延伸 10 min。
3 结论与讨论
目前，对基因组DNA提取方法研究报道很多，
但较难解决的是多糖类物质的去除。由于多糖的
许多理化性质与核酸相似，因此用氯仿抽提、选
注：M：100 bp DNA标准分子量；dNTPs浓度 1～ 5：0.04 mmol/L；6～ 10：0.08 mmol/L；11～ 15：0.12 mmol/L；16-～ 20：0.16 mmol/L。每个浓度梯度
下 5个泳道从左到右依次是引物 S2081、S2082、S2083、S2084、S2085对 1个蛇皮果样品的扩增产物。
图 3 不同 dNTPs浓度的蛇皮果基因组 DNA扩增体系扩增的 DNA的电泳谱带
Fig.3 The RAPD PCR results with different concentrations of dNTPs
注：M：100 bp DNA标准分子量；Taq DNA 聚合酶浓度 1～ 5：0.03 U/μL；6～ 10：0.06 U/μL；11～ 15：0.09 U/μL；16～ 20：0.12 U/μL。每个浓度梯度下
5个泳道从左到右依次是引物 S2074、S2075、S2076、S2077、S2078对 1个蛇皮果样品的扩增产物。
图 4 不同 Taq DNA聚合酶浓度的蛇皮果基因组 DNA扩增体系扩增的 DNA的电泳谱带
Fig. 4 The RAPD PCR results with different concentrations of Taq DNA polymerase
注：M：100 bp DNA标准分子量；退火温度 1～ 5：34 ℃；6～ 10：36 ℃；11～ 15：38 ℃；16～ 20：40 ℃；21～ 25：42 ℃；26～ 30：44 ℃。每个退火
温度下 5个泳道从左到右依次是引物 S2093、S2094、S2095、S2096、S2097对 1个蛇皮果样品的扩增产物。
图 5 不同退火温度下蛇皮果基因组 DNA扩增的 DNA的电泳谱带
Fig. 5 The RAPD PCR results with different annealing temperature
注：M：100 bp DNA标准分子量；1-10泳道依次为 1个蛇皮果样品对引物
S23、S24、S25、S26、S27、S28、S29、S30、S31、S32的扩增。
图 6 优化方案对 10个随机引物 PCR的 DNA的电泳谱带
Fig. 6 The RAPD PCR results of salak genomic DNA
李建光，等：蛇皮果基因组 DNA提取及其 RAPD条件优化114 第 6期
择性沉淀等常规方法不能有效地去除多糖。由于
多糖可以抑制许多酶活性 [8]，有多糖污染的 DNA
样品纯度较低，无法顺利进行 PCR扩增，因此必
须尽量避免提取过程中的多糖污染。蛇皮果富含
多糖和酚类物质，过多的多糖将影响后期 PCR扩
增效果，所以多糖的去除是本实验的关键步骤。
本实验首先采用 CTAB法和 SDS法进行基因组
DNA的提取，由于未采取去除多糖的措施，故所
得 DNA沉淀为一团胶状物，而且加入 1×TE进行
溶解 DNA时需要很长的时间，通过电泳检测可以
看出（见图 1）受多糖和杂质的影响两种方法跑出
的效果都不好，CTAB法的拖尾现象比较严重，而
SDS法只有一条很模糊的条带。采用 CTAB-free
法提取的基因组 DNA虽然无拖尾现象而且条带比
较清晰，但由于在第一步除多糖的过程中同时也
洗去部分的基因组 DNA，从而造成基因组 DNA
量的减少，同时有少量 DNA降解，造成跑出的电
泳条带比较分散。改良的 CTAB法首先在缓冲液中
加入了 β-巯基乙醇和聚乙烯基吡咯烷酮（PVP），
β-巯基乙醇能抑制酚类物质的氧化，PVP作为酚
类物质结合剂，可吸附多酚分子上的氢键，形成水
不溶性复合物 [9]，从而有效的去除蛇皮果当中的酚
类物质。同时，PVP作为澄清剂，具有吸附作用
[10]，能吸附多糖将其除去。提高 NaCl浓度是去除
多糖的一种有效方法，周诗捷等 [11]对华南五针松
成熟针叶提取基因组 DNA时，将 NaCl浓度提高
到 2 mol/L并取得较好的提取效果。但在本实验中
只有将 NaCl浓度提高到 5 mol/L 时才能有效去除多
糖。通过上述分析以及电泳检测结果最终选用改良
CTAB法作为蛇皮果的基因组 DNA提取方法。
通过对蛇皮果 RAPD反应体系优化的研究，
有利于建立有效的扩增体系和扩增程序，为蛇皮
果分子生物学研究提供技术支持。在扩增体系中，
Mg2+浓度会影响到酶的活性、合成的忠实性、引
物与模板的结合效率和退火温度等方面 [12]。从试
验设置的 4个浓度梯度来看，随着Mg2+浓度的增
加，PCR扩增所产生的条带越来越清晰，而且产
生的带型也逐渐的增多。但是，当浓度增加到一
定程度时会导致非特异性扩增和引物二聚体的形
成。根据电泳检测的结果最终确定了Mg2+浓度为
1.4 mmol/L。扩增体系中 dNTPs浓度过高会导致
Taq DNA聚合酶错误掺入，而且还会与反应混合
液中的 Taq DNA聚合酶竞争Mg2+，抑制酶的活性。
所以 dNTPs 浓度和 Taq DNA聚合酶浓度需要达到
一定的平衡状态。一般 RAPD技术中 PCR扩增的
退火温度都在 35℃～ 40℃之间 [13]，温度过高会抑
制 PCR扩增。但是 Parasnis[14]研究番木瓜时使用
的退火温度达到 45℃，而且李发根等 [15]对棕榈藤
研究的退火温度也达到 45℃，说明采用 RAPD技
术进行分子标记研究时，退火温度范围较大。本
实验的退火温度从 34℃到 44℃设置了 6个梯度，
从电泳图中可以看出不同的退火温度之间的差异
并不太大，这佐证了 RAPD技术中 PCR扩增程序
退火温度适宜范围较广，也证明了 RAPD反应在
退火温度上具有较高的稳定性和可重复性。
致谢：中国林业科学研究院热带林业研究所研究员甘四明
博士和硕士生于晓丽对本研究给予建议和实验协助，特此感谢！
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