全 文 :广 西 植 物 Guihaia 30(3):416~ 421 2O1O年 5月
矮晚柚的组织培养与快速繁殖
毛艳萍 一,苏智先 ,邹利娟1一,余阿梅1一,曾艳1,2,程昌凤3
(1.西华师范大学 生命科学学院,四川 南充 637002;2.四川省生态与环境技术重点实验室,
四JI绵阳 621000;3.重庆江津果树研究所,重庆 江津 402260)
摘 要:以矮晚柚种子萌发的无菌苗为实验材料 ,利用茎尖和上胚轴诱导丛生芽的发生 ,利用丛生芽获得再
生植株。实验表明:矮晚柚成熟和未成熟种子在 1/2MS、MS上均能萌发,萌发率最高可达 96 ,成熟种子萌
发的无菌苗更利于后期的分化 。最适外植体为无菌苗的上胚轴 ,筛选出丛生芽最佳增殖培养方案为 MS+6一
BA 2.0 mg·L‘+NAA 0.1 mg·L- +蔗糖 4O g·L‘+靠近茎尖上胚轴,最高增殖系数达 8.4,最佳生根培
养基为 ~/2MS+NAA 0.2 mg·L +IBA 0.2 mg·L +活性炭0.2 g·L一1,生根率达 9o 以上。移栽至蛭
石+珍珠岩+营养土(1:l:2)的营养石奉上 ,成活率可达 80 。
关键词 :矮晚柚 ;丛生芽诱导;组织培养 ;快速繁殖。
中图分类号:Q943.1 文献标识码:A 文章编号 :1000—3142(2OlO)03—0416-06
Tissue culture and rapid propagation
of dwarf-late pomelo
MA0 Yan-Ping ,SU Zh卜Xian2 ,ZOU Li—Juan1,2,
YU A-Mei 一,ZENG Yan 一,CHENG Chang-Feng。
(1.Collegeof Life Science,China West Normal University,Nanchong 637002,China;2.Sichuan
Provincial Key Laboratory of Ecology and Environmental Technology,Mianyang 621000,
China;3.Chongqing jiangjin Fruit Tres Institute,Chongqing 402260,China)
Abstract:Aseptic seeding of dwarf-late pomelo were used as the materials in the study,We induced cespitose buds
from meristem and epicoty]of the seedlings,then regenerated plants from the induced shoots,and results showed that
both mature and immature seeds could be germinate on 1/2MS and MS medium,the highest germination rate could
reach 96 ,and the aseptic seeding from mature seeds were more suitable for the further differentiation.The epicotyl
was found to be the optimal explants,the optimal protocol for cespitose buds proliferation was to culutre upicotyl on
MS medium with 2.0 mg·L 6-BA,0.1 mg·L- NAA and 40 g·L sucrose,and the achieved multiplication coefi—
c’lent was 8.4.The optimal rooting medium was 1/2MS medium with 0.2 mg·L NAA,0.2 mg·L- IBA 0.2 g·L-
AC,from which 90% rooting rate was obtained.After ransplanted to nutrition bowl,80 plants sur~ved.
Key words:dwarf—late pomelo;cespitose buds induction;tissue culture;rapid proliferation
矮晚柚 (Citrus grandis)系台湾晚 白柚 的芽变
品种,是一种较新的柚类品种,属芸香科(Rutaceae)
柑橘属(Citrus)柚类植物。该品种的果实品质上
等,适应性广 ,是 目前生产 中最矮化 的柚子品种,可
做为盆景的优良观赏树种(李盛先等,1998)。矮晚
柚具有健胃、润肺、补血、清肠、利便等功效,对败血
收稿日期:2009—03—1 6 修回日期:2009一10—15
基金项 目:国家 自然科学基金(30670209);四川省教育厅重点项目(2003A175)[-Supported by the National Natural Science Foundation of China
(30670209) Key Item of Education Department of Sichuan Provinee(2003A1 75)]
作者简介:毛艳萍(1985一),女,四JI绵阳人,硕士 ,主要从事植物组织培养及植物生理方面的研究工作,(E—mail)yanping_mao@126.corn。
通讯作者(Author for correspondence,E—mail:zxsu2008@163.com)
3期 毛艳萍等 :矮晚柚的组织培养与快速繁殖 417
症等有良好的辅助疗效 ,柚皮含有生理活性物质柚皮
甙,可降低血液的黏滞度 ,减少血栓的形成,故而对脑
血管疾病,如脑血栓、中风等也有较好的预防作用。
目前 ,我 国学者在研究柚类组培方面的试材已
有沙田柚(韩美丽等,2004;董高峰等,2001)、砧板柚
(梁倩华 等,I994)、文旦柚 、下 河蜜柚 (邹金美 等,
2006)和酸柚(王任翔等,1996)等,但尚未见矮晚柚
的组织培养快速繁殖的研究报道。利用传统的方式
进行繁殖,存在播种发芽率低,嫁接发芽率高但成本
高等很多弊端,不能适应市场对 良种柚类的大量需
求。通过高效组织培养再生体系的建立,能有效克
服上述弊端,为柚类的原体苗木快速繁殖、遗传育
种、基因转化提供了一条新的途径。本研究以矮晚
柚的无菌苗为试材,对比研究了不同外植体及其放
置方式、不同的激素配比对丛生芽增殖的影响,筛选
出矮晚柚的最佳繁殖体系,试图为芸香科其他物种
的快速繁殖提供参考 。
1 材料与方法
1.1试材
2008年 9月,在重庆市江津果树研究所采集矮
晚柚种子,取用成熟及未成熟的种子萌发的无菌苗。
1.2方法
1.2.1相关化学试剂的配制 75 酒精,0.1%升汞,
l mg/mL 6-BA及 l mg/mI NAA的配制均参照王玉
英等(2006)的方法进行 。
1.2.2种子的消毒 取矮晚柚成熟和未成熟的新鲜
种子,用自来水洗去表面胶质,晾干后剥去外种皮,
75 9/6酒精消毒 3O S,无菌水冲洗 2~3次,然后在
0.1%升汞溶液中消毒 10 min,无菌水冲洗3~5次。
1.2.3启动培养 种子消毒后,用无菌滤纸吸去多
余水分,剥去内种皮,接种于不同类型的启动培养基
上 ,分光照与黑暗两种方式培养 ,选取适宜的种子类
型和光照条件 。
1.2.4丛生芽诱导培养 无菌苗长至 8~10 cm时,
取无菌苗的三部分作为外植体:①靠近茎尖的上胚
轴;②靠近子叶的上胚轴;③茎尖,每种外植体切成
2~3cm。外植体放置方式为:①,②外植体按照 十
(形态学上端在上);+(形态学下端在上),一(平
放);③外植体按照切口端在下,接种于丛生芽诱导
培养基上,30 d后统计增殖系数及出芽率。增殖系
数一增殖芽总个数/出芽的外植体总数,出芽率=
(出芽的外植体数/接种的外植体总数)×100 9,6。
1.2.5生根培养及移栽 选取生长良好的幼苗转接
至含有不同浓度激素的 1/2MS培养基上,诱导生
根。当根长约4 cm时开盖炼苗,然后移栽。除启动
培养基外,其他基本培养基均为 MS培养基,pH调
至 5.9~6.0,培养温度 为(25±2)℃ ,光照强度 36
mol·m ·s。左右,光照培养时间 12h·d一,每种
培养基接种外植体 30个,重复 3次。
2 结果与分析
2.1不同类型种子与培养条件对种子萌发及后期分
化的影响
将成熟与未成熟种子接种于不加激素的 1/2MS、
MS的固体和半固体启动培养基上,光照与黑暗两种
条件下培养,正交设计 L8不同培养组合与直观分
析结果见表 1。
表 1 种子萌发的直观分析结果及生长情况
Table 1 Visual analysis of seed germination and the growth conditions
418 广 西 植 物 3O卷
表 2 种子萌发方差分析
因素
Factors
平方和 自由度 F比
SS df F ratio
F临界值 显著性
F critical Signi~
valBe ficance
注:接种 15 d后统计 ,口一0.05。
Note:Data were recorded after 15 days of culture,a=0.05
表 3 外植体不同放置方式对丛生芽诱导的影响
Table 3 Effect of different ways of explant placeing
on the induction of clustered shoots
试验表明:黑暗条件下,种子在接种 3d后开始
萌发;光照条件下,种子接种 5d后开始萌发;光照条
件下培养的种子后期生长更加良好,无黄化苗出现。
种子萌发后,固体培养基上的无菌苗生长更为健壮,
且在分化能力更强,相同条件下的出芽数和出芽率
较半固体培养基上萌发的无菌苗更高。后期分化芽
中,未成熟种子萌发出的外植体分化出芽早,但是芽
长势不佳,成熟种子萌发出的外植体分化稍晚,长势
更加良好。从表 1可以看出,光照条件下,种子萌发
的最佳方案是未成熟种 子在 固体 MS培养基上培
养。方差分析表明,在 a一0.05水平下,基本培养基
的类型对种子萌发的影响达到显著水平,其他因素
的影响均不显著(表 2)。综上所述,成熟种子在半
固体的 MS培养基培养发苗,于黑暗条件下启动培
养,待种子开始萌发后,转至固体 MS于光照条件下
培养更有利于最佳试验材料的获得。
2.2不同放置方式与不 同激素配比对丛生芽诱导的
影响
2.2。1不同放置方 式对 出芽的影响 以成熟种子
的上胚轴为 I材料,三种方式放置,分别接种于 MS
+6一BA 2.0 mg·L +NAA 0.5 mg·L +蔗糖 30
g·L 上,结果见表 3。培 养 7 d后,外植体与培养
基接触端开始膨大,2O d后,十上端, 下端,一一
端已有芽长出。 十上端芽长势较好,叶片平展呈绿
色; 下端芽畸形芽较多,芽矮小且叶片弯曲;一一
端出芽少,叶片小。30 d后统计结果 ,放置方式以形
态学上端在上(十)最好,其出芽率和增殖系数最高。
2.2.2不 同激素配比对丛生芽诱导的影响 将无菌
苗的上胚轴(①,②)和茎尖 (③)剪下 ,分别接种于不
同的诱导培养基上。正交设计 L9与试验结果见表
3。结果表明,接种 7 d后,三种外植体插入培养基端
均出现愈伤化,15 d后①上胚轴 1上端开始出现芽
点,2O d后丛生芽开始长出。由此看出出芽率和增殖
系数呈正相关,因此只对增殖系数进行方差分析。
表 4 丛生芽诱导正交设计表及结果
Table 4 Induction of cespitose bud and its orthogonaI design
1.O
1.0
1.0
2.0
2.0
2.0
’ 3.0
3.O
3,O
4.433
6.753
6.200
2.32O
0.1
0.2
O.5
O.1
O.2
0.5
0.1
0.2
0.5
6.813
5.040
5.533
1.773
①
②
③
⑧
①
②
②
③
①
6。867
4.387
6.133
2.48O
6.34
2.56
4.40
8.40
6.96
4.90
5.70
5.6O
7.30
总和=52.16
最佳点 A2B1C2D1
82.76
42.86
54.56
100.00
83.33
66.67
77.78
72.72
83.33
注:kl、k2、ks表示增殖系数的水平均值,R表示增殖系数的极差,30 d后统计出芽情况。
Note:kl,k2 and k3 stand for the level averages of muhiplication coeficient.R stands for range,data was recorded after 30 days of culture.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 。| q R
3期 毛艳萍等:矮晚柚的组织培养与快速繁殖 419
直观分析(表 4)表明,四种因素的极差大小依
次是:D>A>B>C,四种因素对外植体出芽影响大
小依次是:外植体的种类>6一BA的浓度>NAA的
浓度>蔗糖的浓度。经方差分析表明,在 a=0.05
水平下,6-BA与外植体种类对丛生芽的增殖有显著
影响 ,其他因素均未达到显著水平 ,因此 6-BA浓度
与外植体种类是丛生芽增殖影响的主要因素。综上
所述,丛生芽增殖最优组合为 AzB CzD ,即 MS+
6一BA 2 mg·L +NAA 0.1 mg·L +蔗糖 4O g·
十靠近茎尖的上胚轴。
表 5 丛生芽增殖方差分析表
Table 5 Proliferation of cespitose bud
and analysis of variance
2.3单因素对出芽的影响
2.3.1 6-BA对丛生芽发生的影响 表 4表明,除外
植体外,细胞分裂素 6-BA对出芽的影响是最大的。
对 6-BA进行作图分析(图 1):出芽率和增殖系数在
整体上的变化趋势是较一致的;较低浓度的 6-BA
时,出芽率和增殖系数都明显较低;6-BA浓度增大
时,出芽率和增殖系数都明显增大。当 6-BA浓度
在2.0 mg·L 时,出芽率和增殖系数均达最大值,
浓度继续增大,出芽率和增殖系数开始出现降低的
趋势,与前面正交分析的结果相符。说明加入适当
浓度的 6一BA对出芽率和增殖系数有一定的促进作
用,当浓度大于 2.0 mg·L 时,就会在一定程度上
抑制出芽和芽的生长,这与董高峰等(2006)的结论
一 致。因此,6一BA的最适浓度是 2.0 mg·L- 。
2.3.2 NAA 对丛生 芽发生 的影响 由正 交分析
(表 4)可以得出,NAA对出芽的影响仅次于 6一BA,
从图2看出,NAA对增殖系数和出芽率的影响也较
为明显。当 NAA浓度为 0.01 mg·L 时,丛生芽
的增殖系数和出芽率分别达到了 4.56和 50.4%。
随着 NAA的浓度升高,增殖系数和出芽率都有一
定的增长,当 NAA浓度达到 0.1 mg·L 时,增殖
系数和出芽率均达到了最大值。NAA浓度大于
0.1 mg·L ,丛生芽增殖系数和出芽率开始降低。
一 般来说,高浓度的细胞分裂素和低浓度的生长素
更有利于丛生芽的生长 (李群 等,2004),NAA的添
加浓度应低于 1.0mg·L 。因此,NAA的最适 浓
度是 0.1 mg·L- (李 国平等 ,2005)。
簌
磐
士H
≤l
‘ 0.01 0.05 0.1 0.2 0.5
NAA浓度
The cono~ntrat on of NAA
图 1 不同浓度 6-BA对丛生芽诱导的影响
Fig.1 Effect of different concentrations of 6-BA
on sprouting rate of cespitose bud
薹
6一BA浓度
The concentat i on of 6-BA
图 2 不同浓度 NAA对丛生芽诱导的影响
Fig.2 Effect of different concentrations of NAA
on sprouting rate of cespitose bud
2.4植株的生根
选取生长 良好的丛生芽,转接到附加活性炭
0.2 g·L 的生根培养基上诱导生根,10 d后,各培
养基内的芽均有根长出,其中以 1/2Ms+NAA 0.2
mg·L‘+IBA 0.2 mg·L。+活性炭 0.2 g·L- 诱
导出的根系最为发达,根较长,利于炼苗成功(李国
平等,2005),生根率 9O 以上。根长至 3~4 cm
时,开盖炼苗,湿度保持在 8O 以上,3 d后,将根上
的培养基洗去,移栽至蛭石+珍珠岩+营养土(1:l
:2)的营养碎上 ,10 d后统计成活率,可达 8O 9/6。
3 讨论
3.1培养基类型对种子萌发的影响
一 般,固体 1/2MS培养基是常用于种子萌发的
0 孵L c一 可3∞
一邑斛敞丑柢州
∞ ∞ ∞∞们 ∞{寻 0
仃L c~ 3∞
一 斛 习抓州
知 ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ 0
42O 广 西 植 物 3O卷
培养基。矮晚柚在种子萌发阶段 中,种子在半 固体
培养基比固体培养基更容易启动萌发,这可能与半
固体培养基有更好的流动性有关,使营养成分能与
种子充分的接触,更容易充分吸收营养。MS培养
基作为组培常用的培养基,其上萌发出的无菌苗比
l/2MS培养基上萌发的无菌苗更粗壮,这可能与
MS含有较高含量的无机元素有关。发苗的最佳方
案是成熟种子在半固体 1/2Ms于黑暗条件下葫发
图版I 矮晚柚快速繁殖与植株 生过程 A.矮晚柚种子;B.无荫菡;C.差尖分化出丛生芽;D.上胚轴分化出丛生芽;E.再生植株; 移栽
20 d后的再生植株。
Plate I The whole course of tissue culture and rapid propagation of dwarfqate pomelo A.Seeds of the dwarf-late pomelo;B.Plant;C.Diferentia-
ted eespitose buds from shoot apex;D.Differentiated cespitose buds from hypoeotyl;E.Regenerative plant;F.Regenerative plant 2O days after trans-
plantation.
后,转至固体 MS上于光照条件下培养。
3.2植物激素对丛生芽诱导的影响
在植物组织培养中,器官的发生是一个极其复
杂的过程,受内源和外源激素 的调节(谭文澄等,
1991),同时外植体的来源也是影响植物快繁成功的
重要因素之一(林小桦等,2007)。本试验通过不同
外植体丛生芽诱导能力的比较,丛生芽增殖的最适
外植体是靠近茎尖的上胚轴,在适宜的诱导培养基
上,增殖系数可达 7.3,这可能与其有较强的分生组
织有关。和上胚轴相比,茎尖的增殖系数稍低,推测
是由于茎尖具有顶端优势,本身就有较高的内源激
素,在加入外源激素后,使得激素总体水平提高,过
高的激素水平反而会抑制芽的生长。最适合芽增殖
的培养基是 MS十6一BA 2.0 mg·L。+NAA 0.1
mg·L。+蔗糖 40 g·L 。
3.3上胚轴放置方式对丛生芽诱导的影响
外植体放置方式对丛生芽增殖的影响已有部分
研究,均以形态学上端在上的方式最佳。矮晚柚上
胚轴三种放置方式中,都只有一端有丛生芽长出,且
同样以按形态学上端在上(牛)的增殖系数和出芽率
最高,这与外植体内源激素的分布和再分配的能力
有关(徐晓峰 等,2002)。植物生长素有极性运输和
非极性运输两种运输方式,而在茎段和根的运输方
式属于极性运输,即生长素在植物体内从形态学的
一 端向形态学的另一端单向运输(夏石头等,2003)。
上胚轴最终会发育成茎段,根据植物生长素的极性
运输,对上胚轴而言形态学一端本身就具有更高的
生长素浓度,更具有出芽的优势,因此各种放置方式
都只有一端有芽的长出。矮晚柚上胚轴的最佳放置
方式是以形态学上端在上。最适合生根的培养基为
1/2 MS+NAA 0.2 mg·L- +IBA 0.2 mg· +
AC 0.2 g·L ,活性炭的添加有利于根的伸长和生
长,这与 Bach(1998)的结论是一致的。
致谢 在此特别感谢导师苏智先教授的悉心指
3期 毛艳萍等:矮晚柚的组织培养与快速繁殖 42l
导,感谢邹利娟、余阿梅、曾艳、杨敬天在研究过程中
给予的帮助 ,同时还要 感谢重庆江津果树研 究所对
本研究的大力支持。
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