全 文 ：书广 西 植 物 Ｇｕｉｈａｉａ　３２（５）：６６９－６７３　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２０１２年 ９ 月 　
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－３１４２．２０１２．０５．０１９
石牌广藿香原生质体的分离及培养研究
莫小路，曾庆钱，黄珊珊，陈瑜珍，严　振＊
（广东省中药研究所，广州５１０５２０）
摘　要：以石牌广藿香悬浮细胞为材料，对影响其原生质体分离和培养的酶浓度、作用时间、溶液渗透压和材
料的生理状态等因素进行了研究。结果表明：以０．５％的果胶酶、０．２％离析酶和０．８％的纤维素酶组合处理
继代培养３～１１ｄ的悬浮细胞８ｈ，渗透压调节剂为９％甘露醇，原生质体产量达１．６５×１０６　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ·ｍＬ－１
ＰＣＶ，活力超过８６％。在原生质体的液体浅层培养中，细胞分裂频率为１３．５％。
关键词：石牌广藿香；原生质体分离；原生质体培养
中图分类号：Ｑ９４３．１　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１０００－３１４２（２０１２）０５－０６６９－０５
＊ Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ
Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎｃａｂｌｉｎｃｖ．Ｓｈｉｐａｉｅｎｓｉｓ
ＭＯ　Ｘｉａｏ－Ｌｕ，ＺＥＮＧ　Ｑｉｎｇ－Ｑｉａｎ，ＨＵＡＮＧ　Ｓｈａｎ－Ｓｈａｎ，
ＣＨＥＮ　Ｙｕ－Ｚｈｅｎ，ＹＡＮ　Ｚｈｅｎ＊
（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｄｅ　ｏｆ　ＴＣＭ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，５１０５２０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｃｅｌ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｏｌｇｏｓｔｅｍｏｎ　ｃａｂｌｉｎ　ｃｖ．
Ｓｈｉｐａｉｅｎｓｉｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ．Ｔｈｅ　ｓｕｓｐｅｎｔｉｏｎ　ｃｅｌｓ　ｇｒｅｗ　３－１１ｄａｙｓ　ａｆｔｅｒ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ　ｗａｓ　ｉｎｃｕｂａｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｎ－
ｚｙｍｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ　ｏｆ　０．５％ （ｗ／ｖ）ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ　Ｙ－２３，０．２％ （ｗ／ｖ）ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ　Ｒ－１０ａｎｄ　０．８％ （ｗ／ｖ）
ｃｅｌｕｌａｓｅ　Ｒ－１０ｉｎ　９％ （ｗ／ｖ）ｍａｎｎｉｔｏｌ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｗｉｔｈ　０．１％ ＭＥＳ　ａｎｄ　０．０２％ＣａＣｌ２，ｆｏｒ　８ｈ，ｔｈｅ　ｙｉｅｌｄ　ｗａｓ　１．６５
×１０６　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ·ｍＬ－１　ＰＣＶ（Ｐａｃｋｅｄ　Ｃｅｌ　Ｖｏｌｏｕｍｅ）ａｎｄ　ｔｈｅ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｗａｓ　ａｂｏｖｅ　８６％．Ｉｎ　ｔｈｉｎ　ｌａｙｅｒ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ
ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　１３．５％．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｐｏｌｇｏｓｔｅｍｏｎ　ｃａｂｌｉｎ　ｃｖ．Ｓｈｉｐａｉｅｎｓｉｓ；ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ
　　广藿香（Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ　ｃａｂｌｉｎ）为唇形科刺蕊草属
植物，原产于东南亚各国，现在我国南方各省都有栽
培。中药广藿香为广藿香植物的干燥地上部分，是
广东省的道地药材之一，具有芳香化浊、开胃止呕、
发表解暑（广东中药志编委会，１９９４）并兼有抑菌抗
病毒、抗螺旋体等功效（任守忠等，２００６），是“藿香正
气水”、“抗病毒口服液”等多种中成药的重要原料。
广藿香主要产于广东省的石牌、高要、湛江地区
及海南省的万宁地区，因产地的自然环境条件、种植
习惯、栽培管理、采收加工等的不同，其产品形态、气
味、质量差异较大（李薇等，２００２；罗集鹏等，２００３），
药材生产传统上认为产于广州石牌地区的广藿香
（俗称“牌香”）品质最好（徐颂军等，２００３；吴友根等，
２０１０），然而由于城市发展耕地消失以及农艺性状不
佳等原因，目前石牌广藿香已濒临灭绝，为保护这一
种质资源，本项目组开展了广藿香原生质体分离培
＊ 收稿日期：２０１２－０３－１９　　修回日期：２０１２－０５－２５
基金项目：广东省科技厅粤港关键领域重点突破项目 （２００９Ａ０３０９０１０１１）；广州市科技计划基础研究项目 （２００９Ｊ１－Ｃ２０１）［Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ　ｂｙ　Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ
Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｓｃｉｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｋｅｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｐｒｏｇｒａｍ　ｏｆ　Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　ａｎｄ　Ｈｏｎｇｋｏｎｇ（２００９Ａ０３０９０１０１１）；
ｔｈｅ　Ｂａｓｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｊｅｃｔ　ｏｆ　Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｂｕｒｅａｕ（２００９Ｊ１－Ｃ２０１）］
作者简介：莫小路（１９６７－），女（壮族），广西柳州人，博士，教授，从事生物技术与药用植物资源研究。
＊通讯作者：严振，男，教授，从事中药资源研究，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｙａｎｚ＠ｇｄｙｚｙ．ｅｄｕ．ｃｎ。
养再生植株及体细胞融合方面的研究。原生质体培
养是进行细胞杂交、转基因及植株再生的研究基础，
在多种植物上已获得了成功（秦永华等，２００６；肖望
等，２００８），而在广藿香原生质体培养方面，仅有
Ｋａｇｅｙａｍ等（１９９５）从叶肉细胞分离到原生质体，经
海藻酸钠包埋形成微球并采用看护培养，获得了再
生植株，国内尚无相关研究报道。原生质体分离的
产量和活力是后续培养成功的关键，而用于原生质
体分离材料的生理状态、酶解条件、分离和纯化的方
法等是影响原生质体产量和活力的主要因素（Ｇｒｅｚ－
ｅｓ，１９９４；许智宏，１９９７），本文对石牌广藿香原生质
体分离和培养影响因素的研究，为后续的体细胞融
合及优质高产细胞系筛选提供技术支持。
１　材料与方法
１．１材料
石牌广藿香悬浮细胞：由本所实验室保存培养
的石牌广藿香无菌苗叶片（莫小路等，２００８）在含
０．０５ｍｇ·Ｌ－１的２，４－Ｄ和０．５ｍｇ·Ｌ－１　ＫＴ的 ＭＳ
培养基上诱导出愈伤组织，经２次继代培养后，转入
含０．０５ｍｇ·Ｌ－１的２，４－Ｄ和１．０ｍｇ·Ｌ－１　ＢＡ的
ＭＳ液体培养中，１个月后建立的悬浮细胞培养体
系，悬浮细胞每２０ｄ继代１次，接种量为２ｇ　ＦＷ·
５０ｍＬ－１。果胶酶（Ｐｅｃｔｉｎａｓｅ，Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ　Ｙ－２３）、离
析酶（Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ　Ｒ－１０）、纤维素酶（Ｃｅｌｕｌａｓｅ　Ｒ－
１０）、甘露醇（Ｍａｎｎｉｔｏｌ），聚蔗糖（Ｆｉｃｏｌ）、植物凝胶
（Ｐｈｙｔａｇｅｌ）、ＭＥＳ和ＦＤＡ（二乙酸荧光素）均购自广
州威佳生物技术有限公司；主要仪器：低速摇床；Ｏ－
ｌｙｍｐｕｓ倒置显微镜，Ｌｅｉｃａ荧光显微镜及电子拍照
系统。
１．２．方法
１．２．１原生质体的分离　取继代培养５ｄ的悬浮细
胞用６０目的不锈钢筛网过滤，除去大的细胞团，将
滤过的悬浮细胞以１　０００ｒ·ｍｉｎ－１离心２ｍｉｎ，分别
将沉淀的悬浮细胞与不同组合的酶液按细胞密实体
积（Ｐａｃｋｅｄ　Ｃｅｌ　Ｖｏｌｏｕｍｅ，ＰＣＶ）∶酶液体积＝１∶
２５的比例混合后，于（２６±１）℃，置低速摇床上以
转速５０ｒ·ｍｉｎ－１避光培养１０ｈ，从４ｈ开始，每隔２
ｈ检查一次原生质体产量，确定原生质体分离的最
佳酶液组合和酶解时间。酶液的组合见表１，所有
酶液均用含９％甘露醇、０．１％ ＭＥＳ，０．０２％ ＣａＣｌ２
的溶液配制，ｐＨ５．７，过滤除菌。
　　确定酶解时间和酶浓度后，分别用含甘露醇
５％、７％、９％、１１％ 和 １３％ 的溶液配制酶溶液
（ｐＨ５．７）进行酶解实验，考察渗透压调节剂甘露醇
浓度对原生质体产量和活力的影响。按上述实验确
定的最佳酶液组合、酶解时间和甘露醇的浓度对继
代时间为３、５、７、９、１１、１５、１９ｄ的悬浮细胞进行酶
解，确定取得原生质体最高产量的继代时间。
表１　用于石牌广藿香原生质体分离的酶组合
Ｔａｂｌｅ　１　Ｅｎｚｙｍｅ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ
ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ　ｃａｂｌｉｎ　ｃｖ．Ｓｈｉｐａｉｅｎｓｉｓ
酶液编号
Ｎｏ．ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ
果胶酶
Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ
Ｙ－２３（％）
离析酶
Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ
Ｒ－１０（％）
纤维素酶
Ｃｅｌｕｌａｓｅ
Ｒ－１０（％）
１　 ０．１０　 ０．２　 ０．８
２　 ０．２５　 ０．２　 ０．８
３　 ０．５０　 ０．２　 ０．８
４　 １．００　 ０．２　 ０．８
５　 ０．５　 ０．２　 １．０
６　 ０．５　 ０．２　 １．５
７　 ０．５　 ０．２　 ２．５
１．２．２．原生质体纯化　采用沉淀法对原生质体进
行纯化。酶解结束后，依次用２００目和４００目不锈
钢滤网过滤除未解离的细胞团，滤液以转速５００ｒ·
ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎ，沉淀用溶解酶的溶液洗涤２次，每
次以转速５　００ｒ·ｍｉｎ－１离心３ｍｉｎ。沉淀的原生质
体用一定体积的原生质体培养液（附加０．０５ｍｇ·
Ｌ－１的２，４－Ｄ和１．０ｍｇ·Ｌ－１　ＢＡ的ＭＳ液体培养基，
含７％甘露醇和０．１％ＭＥＳ）悬浮，５　００ｒ·ｍｉｎ－１离
心３ｍｉｎ，沉淀再次用原生质体培养液悬浮。
１．２．３原生质体产量和活力测定　原生质体的数量
以血球计数板统计，每个样品计数３次，取平均值，
计算出每１ｍＬ溶液中的原生质体的数量，按下式
计算原生质体产量：原生质体产量（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ·
ｍＬ－１ＰＣＶ）＝每１ｍＬ溶液中的原生质体数量（ｐｒｏ－
ｔｏｐｌａｓｔｓ·ｍＬ－１）×所得原生质体悬液的总体积
（ｍＬ）／分离原生质体所用材料的细胞密实体积（ｍＬ
ＰＣＶ）
原生质体活力测定：采用荧光显色法，将
０．０１％的ＦＤＡ溶液于一定浓度的原生质体溶液混
合后，在荧光显微镜下观察发绿色荧光的细胞数量。
按下式计算原生质体活力：原生质体活力＝有荧光
的原生质体数量／总原生质体的数量×１００％。
１．２．４原生质体培养 　原生质体培养采用下列两
种方法：（１）液体浅层培养法。将纯化后的广藿香原
生质体用原生质体培养液调整成１×１０５～１０×１０５
０７６ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３２卷
ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ·ｍＬ－１的密度，于直径６ｃｍ的培养皿内
浅层培养；（２）固－液双层培养法。在直径６ｃｍ的
培养皿内倒入３ｍＬ融化的含０．５ｍｇ·Ｌ－１　ＢＡ的
ＭＳ固体培养基（凝固剂为植物凝胶Ｐｈｙｔａｇｅｌ），待
冷凝后在上面加入２ｍＬ原生质体溶液。
培养第５天时计算原生质体分裂频率，培养２０
ｄ时计算原生质体形成肉眼可见细胞团率。每个培
养处理至少重复３次。
原生质体分裂频率＝分裂一次或以上的原生质
体数／总的原生质体接种数×１００％
细胞团率＝细胞团数（细胞数目１０个以上的细
胞团）／总的原生质体接种数×１００％
图１　用于分离原生质体的悬浮细胞
Ｆｉｇ．１　Ｓｕｓｐｅｎｄ　ｃｅｌｓ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
Ｂａｒ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ　５０μｍ．Ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｂｅｌｏｗ．
２　结果与分析
２．１酶液组成和酶解时间的影响
在植物原生质体分离中最常用的酶是果胶酶和
纤维素酶，在广藿香悬浮细胞原生质体分离中，如果
仅用果胶酶和纤维素酶，生成的原生质体往往不能
从细胞团中游离出来（图２），添加低浓度的离析酶
可以促进原生质体的解离（图３），因此，我们试验了
不同浓度果胶酶Ｙ－２３，离析酶Ｒ－１０和纤维素酶Ｒ－
１０的酶液组合对广藿香悬浮细胞原生质体产量的
影响。结果显示：在同一纤维素酶浓度下，原生质体
的产量随着果胶酶浓度的增加而提高（图４，酶液１－
４）；而在同一果胶酶浓度下，纤维素酶浓度的升高对
原生质体产量没有提高，并且随着酶解时间的加长，
原生质体产量还略有降低（图４，酶液５－７）。
　　在所试验的７个酶液组合中，３号酶液作用８ｈ
图２　未游离的原生质体
Ｆｉｇ．２　Ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ
图３　悬浮细胞解离的原生质体
Ｆｉｇ．３　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｓｕｓｐｅｎｄ　ｃｅｌｓ
图４　酶组合和酶解时间对原生质体分离的影响
Ｆｉｇ．４　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍｅ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ　ａｎｄ
ｅｘｐｏｓｕｒｅ　ｔｉｍｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｙｉｅｌｄ
后，原生质体的产量最高，达到１．６５×１０６　ｐｒｏｔｏ－
ｐｌａｓｔｓ·ｍＬ－１　ＰＣＶ。酶解时间超过１０ｈ，则因原生
１７６５期　　　　　　　　　莫小路等：石牌广藿香原生质体的分离及培养研究
质体破裂而使产量降低，因此，确定３号酶液组合
（含果胶酶０．５％，离析酶０．２％和纤维素酶０．８％）
作用８ｈ是广藿香悬浮细胞原生质体分离的最佳条
件，在以后的原生质体分离中都采用这个酶组合和
酶解时间。
２．２渗透压调节剂浓度的影响
采用５％～１３％的甘露醇附加０．１％ ＭＥＳ、
０．０２％Ｃａ２＋为渗透压调节剂，比较其对原生质体产
量及活力的影响。表２结果表明，甘露醇的浓度过
高或过低都对原生质体的产量和活力有影响。当甘
露醇浓度为１１％时，原生质体的产量最高，达１．７０
×１０６　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ．ｍＬ－１　ＰＣＶ；而原生质体活力在甘
露醇浓度为９％时最大，达８６．４％（表２）；低浓度的
甘露醇虽然能获得一定产量的原生质体，但原生质
体的活力很低，不利于后续的培养，综合考虑原生质
体产量和活力，确定适合广藿香悬浮细胞原生质体
分离的渗透压调节剂甘露醇的浓度为９％。
表２　甘露醇浓度对悬浮细胞原生质体产量和活力的影响
Ｔａｂｌｅ　２　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｍａｎｎｉｔｏｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｙｉｅｌｄ
ａｎｄ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｓｕｓｐｅｎｄ　ｃｅｌｓ
甘露醇浓度
Ｍａｎｎｉｔｏｌ
ｃｏｎｃｅｒｎｔｒａｔｉｏｎ
（％）
原生质体产量
Ｙｉｅｌｄ
（１０６　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ·
ｍＬ－１　ＰＣＶ）＊
原生质体活力
Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ
（％）
５　 ０．８５±０．０６　 ８０．２±０．９５
７　 １．０５±０．０８　 ８１．５±１．２２
９　 １．６５±０．１０　 ８６．４±１．０５
１１　 １．７０±０．０６　 ８４．５±１．５０
１３　 １．４５±０．１１　 ７６．５±２．１０
　＊ Ｍｅａｎ±ＳＤ　ｏｆ　３ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ．Ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｂｅｌｏｗ．
表３　继代时间对原生质体产量和活力的影响
Ｔａｂｌｅ　３　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｇｒｏｗｔｈ　ｔｉｍｅ　ａｆｔｅｒ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｎ　ｔｈｅ
ｙｉｅｌｄ　ａｎｄ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　ｆｒｏｍ　ｓｕｓｐｅｎｄ　ｃｅｌｓ
继代时间 （ｄ）
Ｇｒｏｗｔｈ　ｔｉｍｅ
ａｆｔｅｒ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ
原生质体产量
Ｙｉｅｌｄ（１０６　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ·
ｍＬ－１　ＰＣＶ）＊
原生质体活力
Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ
（％）
３ １．２±０．０９８５．５±１．０５
５ １．６５±０．１５８６．５±１．１３
７ １．６０±０．１６８５．０±１．４２
９ １．２５±０．１０８４．０±１．１１
１１ １．０±０．１１８２．５±０．８５
１５ ０．５±０．０５７５．５±２．１５
１９ ０．０８±０．０２６２．５±１．９２
２．３继代培养时间对原生质体的影响
悬浮细胞继代培养的时间对原生质体产量的影
响很大。在继代时间不超过１１ｄ时，都能获得较高
的原生质体产量，１１ｄ后，细胞活力有所下降，原生
质体的产量和活力都降低（表３），并且在解离的原
生质体溶液中的细胞碎片很多。
图５　液体浅层培养３ｄ的原生质体
Ｆｉｇ．５　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　ｉｎ　ｌｉｑｕｉｄ　ｌａｙｅｒ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｆｔｅｒ　３ｄａｙｓ
Ｂａｒ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ　１００μｍ
表４　培养方法对原生质体分裂频率
和细胞团形成率的影响
Ｔａｂｌｅ　４　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ’
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｃｅｌ　ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｅｌ　ｃｏｌｏｎｙ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ
培养方法
Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｍｅｔｈｏｄｓ
原生质体密度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
（１０５　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ
·ｍＬ－１）＊
培养５ｄ时原
生质体的
分裂频率
Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｒａｔｅ
（％）＊
培养２０ｄ时
原生质体形
成细胞团率
Ｃｅｌ　ｃｏｌｏｎｙ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｒａｔｅ（％）
液体浅层培养 １０．５　 １３．５±０．０８　 ０
固－液双层培养 １．５　 ０．３±０．０７　 ０
　＊ Ｍｅａｎ±ＳＤ　ｏｆ　３ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ
２．４纯化方法对原生质体活力的影响
酶解结束后，经４００目不锈钢滤网过滤，由悬浮
细胞解离的原生质体即悬浮在酶溶液中。由于用悬
浮细胞分离到的原生质体含的杂质不多，本试验采
用简单的下沉法对分离的原生质体进行纯化，在此
过程中，离心的转速对原生质体活力的影响很大，以
转速５００ｒ·ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎ，可以使大部分原生质体
沉淀下来而杂质浮在上清液中，纯化后的原生质体活
力达到９０％；而转速为８００ｒ·ｍｉｎ－１离心２ｍｉｎ，则原
生质体很易破裂，沉淀下来的都是碎片杂质。
２．５原生质体密度及培养方法对原生质体分裂频率
的影响
　　本试验采用了液体浅层培养法和固－液双层培
养法进行广藿香原生质体培养研究。培养２～３ｄ
后，显微镜观察可见细胞体积增大，形态由圆开始拉
２７６ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３２卷
长，部分细胞进行第一次分裂（图５）。在双层培养
中，在固体培养基上层的原生质体密度为１．５×１０５
ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ·ｍＬ－１，培养５ｄ后观察到的分裂频率
仅为０．３％，而在液体浅层培养法中采用的细胞培
养密度较大，约为１０６　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ·ｍＬ－１，在液体浅
层培养第２～３天时，可以看到细胞进行第一次分
裂，分裂频率为１３．５％，但之后没有再看到第二、三
次分裂。表４结果表明，原生质体密度是影响细胞
分裂能力的重要因素。两种培养方法均未见到多次
分裂形成的细胞团。
３　结论与讨论
本研究从广藿香悬浮细胞中分离到了高产量、
高活力的原生质体，并且分离的原生质体杂质少、纯
度高，表明了广藿香悬浮细胞是分离原生质体的较
好材料。对影响广藿香原生质体产量和活力的多种
因素的研究结果表明，最佳酶溶液组合为：果胶酶
０．５％、离析酶０．２％和纤维素酶０．８％，渗透压调节
剂为９％甘露醇；酶解最佳时间为８ｈ；用于分离原
生质体的悬浮细胞的继代生长时间也是影响产量和
活力的重要因素之一，采用继代后３～１１ｄ的悬浮
细胞为材料，分离到的原生质体产量都能达到１０６
ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ·ｍＬ－１　ＰＣＶ，原生质体的活力达到８２％
以上，可以满足原生质体进一步培养的要求。
在原生质体培养过程中，影响细胞的分裂及进
一步分化形成再生植株的因素有很多，除了细胞生
长所需的营养和生长调节剂，培养方法也有重要影
响。在本研究中采用的两种培养方法均未能观察到
细胞团的形成，与Ｋａｇｅｙａｍ等（１９９５）的研究中采用
浅层培养的结果一样，因此，广藿香原生质体与培养
环境的相互作用可能是影响其生长和分化的重要因
素，下一步将探索原生质体固定化培养的方法，以提
高分裂频率和细胞团形成率，最终获得再生植株。
参考文献：
广东中药志编委会．１９９４．广东中药志（第１卷）［Ｍ］．广州：广
东科技出版社：１　３２１６
任守忠，靳德军，张俊清，等．２００６．广藿香药理作用研究进展
［Ｊ］．中国现代中药，８（８）：２７－２９
许智宏，卫志明．１９９７．植物原生质体培养与遗传操作［Ｍ］．上
海：上海科学出版社：１１－１９
Ｇｒｅｚｅｓ　Ｊ．１９９４．Ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍＣｏｆ－
ｆｅａ　ａｒａｂｉｃａｃｅｌｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｔｉｓｓ　Ｏｒｇ　Ｃｕｌｔ，３６：９１－９７
Ｋａｇｅｙａｍ　Ｙ，Ｈｏｎｄａ　Ｙ，Ｓｕｇｉｍｕｒａ　Ｙ．１９９５．Ｐｌａｎｔ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ
ｐａｔｃｈｏｕｌｉ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ　ｉｎ　ａｌｇｉｎａｔｅ　ｂｅａｄｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌ　Ｔｉｓｓ　Ｏｒｇ　Ｃｕｌｔ，４１：６５－７０
Ｌｉ　Ｗ（李薇），Ｐａｎ　ＣＭ（潘超美），Ｘｕ　Ｌ（徐良），ｅｔ　ａｌ．２００２．Ｔｈｅ
ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ　ｃａｂｌｉｎｆｒｏｍ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
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ｖａｔｅｄ　ｉｎ　Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ（药用植物广藿香的品种
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３７６５期　　　　　　　　　莫小路等：石牌广藿香原生质体的分离及培养研究