全 文 ：食用菌学报 2010.17(3):20 ～ 24
收稿日期:2010-03-23原稿;2010-07-09 修改稿
基金项目:公益性行业科研专项(编号:nyhyzx07-008)、湖北省科技攻关重点项目(编号:2007AA201B01)的部分研
究内容
作者简介:樊晓琳(1984-), 女 , 2009年毕业于华中农业大学植物科学技术学院微生物专业 , 硕士研究生 ,主要从事
蕈菌遗传育种方面研究。
＊本文通讯作者　E-mail:bianyinbing@mail.hzau.edu.cn
文章编号:1005-9873(2010)03-0020-05
双孢蘑菇菌株 As2796的提纯复壮
樊晓琳 , 叶绿笋 , 边银丙＊
(华中农业大学应用真菌研究所 ,湖北武汉 430070)
摘　要:采用原生质体分离 、菌丝尖端分离和组织分离 3 种方法对双孢蘑菇(Agaricus bisporus)As2796 的退
化菌株进行分离 , 应用灰色关联度分析法综合评价不同分离株的农艺性状 ,筛选综合性状优于 As2796 退化菌
株的提纯复壮菌株。结果表明 , 3 种分离方法均能获得提纯复壮的菌株 ,其中原生质体分离株 P28 的提纯复壮
效果最好。
关键词:双孢蘑菇;原生质体分离;组织分离;菌丝尖端分离;提纯复壮;灰色关联度
　　双孢蘑菇(Agaricus bisporus)栽培菌株
As2796是目前我国使用最广泛的商业菌株之
一 ,该菌株是由异核体菌株 02(国外引种)和 8213
(国内保留种)通过同核不育单孢杂交育成的 ,其
子实体单生 ,菌盖直径 3.0 ～ 3.5 cm ,盖厚 2.0 ～
2.5 cm ,菌柄粗短 ,外形圆整 ,组织结实 ,色泽洁
白 ,无鳞片 ,但该菌种经过长期使用后 ,表现出菌
丝吃料能力减弱 ,出菇稀疏 ,菌盖薄 ,菌柄细长 ,
产量下降等现象。为确保双孢蘑菇稳产高产 ,对
栽培菌株进行提纯复壮尤为重要[ 1] 。本研究以
生产中使用多年的 A s2796商业菌株作为出发菌
株 ,采用原生质体分离 、组织分离和菌丝尖端分
离等方法获得分离株 ,并应用灰色关联度分析法
对分离株进行评价 ,试图从中获得提纯复壮的优
良菌株。
1　材料与方法
1.1 供试菌株
　　双孢蘑菇(A.bisporus)菌株 As2796试管种
由华中农业大学菌种实验中心提供。
1.2 培养基
　　AH 培养基:琼脂 20 g ,水 1000 mL。
PDA 、PDPY培养基 、麦粒种培养基 、粪草料
培养基按文献[ 2 ,3]配制 。
1.3 出发菌株提纯复壮的分离方法
1.3.1 原生质体分离
　　原生质体的制备 、再生和分离参照文献[ 4]
进行 。挑取再生培养基上出现的星芒状的微小
再生菌落至 PDPY斜面于 25 ℃培养。每天挑取
1次 ,直至平板中不再出现微小菌落为止 ,从而获
得原生质体分离菌株。
1.3.2 菌丝尖端分离
　　取栽培菌株 As2796的试管种菌丝接种于直
径 9 cm的 AH 平板中 , 25 ℃培养 10 d ,在放大镜
下从菌落边缘的菌丝尖端取 2 mm×1 cm 的接种
块转接至 PDPY平板中 , 25 ℃培养 10 d ,采用相
同方法从 PDPY 平板取菌块接至 AH 平板中 ,
25 ℃培养 10 d后再按相同方法将菌丝尖端接种
块转接到新的 PDPY 平板中于 25 ℃培养 ,获得
菌丝尖端分离株。
1.3.3 组织分离
　　将供试菌株按照文献[ 5] 的方法栽培出菇 ,
选取菇形圆整 、菇膜未破 、无病虫害 ,菌盖直径
3.0 ～ 3.5 cm 的子实体进行组织分离 。选取子实
体菌盖和菌柄交接处的菌髓部位 ,切取 5 mm ×
5 mm×5 mm 的组织块置于 PDA 斜面上 , 25 ℃
培养 10 d后将菌丝尖端转移至另一 PDA 斜面 ,
25 ℃培养获得组织分离株 。
1.4 菌丝生长速度测定
　　取直径为 8 mm 的各分离株的接种块接于直
第 3 期 樊晓琳 ,等:双孢蘑菇菌株 As2796 的提纯复壮
径为 9 cm 的 PDPY平板中 ,25 ℃培养 7 d ,采用
十字交叉法测定菌丝生长速度 ,设 3个重复 。以
出发菌株 As2796为对照 ,选出菌丝生长速度快
于出发菌株的原生质体菌株用于以下的实验 。
取直径为 8 mm 的各分离株的接种块分别接
至装有麦粒种培养基(1.8 cm×18 cm ,含 15 g麦
粒培养基)和粪草料培养基(2 cm ×20 cm ,含
15 g粪草料培养基)的试管中 , 25 ℃培养15 d 。
采用划线法测量菌丝生长速度 ,设 3个重复 。以
出发菌株 As2796为对照 ,对各分离株的菌丝生
长速度进行统计分析[ 6] ,筛选在上述两种培养基
上菌丝生长速度快的分离株作为初筛菌株。
1.5 出菇试验
　　出发菌株和初筛菌株的栽培种按文献[ 2]制
备 ,培养料的制备和出菇管理方法按文献[ 5]进
行。于 2008年 9月 20日采用撒播法播种 ,播种
量为每平方米 750 mL 麦粒种 , 发菌期温度约
22 ～ 28 ℃, 40 d后进入出菇期 , 2009年 4 月 11
日出菇结束 ,共收获 4潮菇(出菇期间温度为 5 ～
18 ℃),各分离株的出菇潮次基本一致 。采用随
机区组 设计 , 每个 菌株 重复 栽培 1.54 m2
(1.4 m ×1.1 m),设 3个重复 ,各小区随机排列 ,
每个重复排列在不同层架的不同层中。在子实
体菌盖未开 、菌膜未破裂时采收。每个分离株每
潮菇随机采收 20个子实体观测其农艺性状 。采
用带状采样法计算每平方米的产量。每个重复
在除去边缘 20 cm 的 0.7 m2(1 m×0.7 m)面积
内 ,选取 3个 0.7 m ×0.2 m 的条带采样 ,采收每
一条带中所有的头潮菇测定重量 。由每个重复
的 3 个条带中的头潮菇鲜菇总重量计算出头潮
菇每平方米的产量。按头潮菇产量占总产量的
23%计算得到每个分离菌株的总产量[ 7] 。
1.6 供试菌株农艺性状的灰色关联度分析
　　选择双孢蘑菇的菌盖直径 、菌盖厚度 、菌柄
直径 、菌柄长度 、单菇重 、每平方米的产量 、栽培
种菌丝满瓶时间 7 个主要农艺性状作为供试菌
株评价指标。按照栽培菌株 As2796典型的性状
特征构造参考菌株(见表 1),形成参考数列 X 0;
用各分离株的栽培试验结果构建比较数列 Xi
(k), i表示不同的分离株 ,k表示不同的性状 。此
外 ,赋予各性状不同的权重W(k)(见表 1),以区
分各性状不同的重要性 ,形成双孢蘑菇复壮菌株
主要农艺形状的灰色指标评估体系。灰色关联
度分析步骤见文献[ 8] 。
表 1　双孢蘑菇参考菌株主要性状的假定值与权重指数
Table 1　Presumed values and weighting coefficients for selected fruit body and cultivation characteristics
of an ideal A.bis porus strain
K1(mm) K2(mm) K3(mm) K4(mm) K5(g) K6(kg/m2) K7(d)
参考菌株 X0
Proje cted ideal str ain
42.0 24.0 20.0 15.0 28.0 8.5 30
权重指数Wk
Weigh ting coef ficient
0.15 0.12 0.08 0.15 0.12 0.3 0.08
K1:菌盖直径 , K2:菌盖厚度 , K3 :菌柄直径 , K4 :菌柄长度 , K5 :单菇重量 , K6:每平方米的产量 , K7:栽培种菌丝满瓶时间
K1:Cap diameter , K2:Cap th ick ness , K3 :Stipe diameter , K4 :Stipe length , K5 :Average fr uit b ody weigh t , K6:Yield per squar e meter ,
K7:Per iod required for subs tr ate colon izat ion
　　根据各分离株与参考菌株的灰色关联度的
大小 ,筛选出综合性状优良的分离株 。将 3 种分
离方法获得的表现较好的代表性菌株在武汉市
新洲区双孢蘑菇示范基地按文献[ 5]的方法进行
扩大栽培试验 ,进一步考察这些分离菌株的农艺
性状 ,每个菌株栽培 100 m2 。
2　结果与分析
2.1 分离菌株初步筛选
　　经过原生质体再生分离 、菌丝尖端分离和组
织分离分别得到 130个原生质体分离株(编号为
P1 ～ P130)、10个菌丝尖端分离株(编号为 Tip1
～ Tip10)和 14 个组织分离株(编号为 TI1 ～
T I14)。PDPY 培养基上生长速度测定结果表
明 ,出发菌株 A s2796菌丝长速为 2.15 mm/d ,有
40个原生质体分离株中的菌丝生长速度快于出
发菌株 ,在 2.14 ～ 2.65 mm/d 之间 。10个菌丝
尖端 分 离 株 的 菌 丝 生 长 速 度 在 1.52 ～
2.10 mm/d之间 ,14个组织分离株的菌丝长速在
1.77 ～ 2.25 mm/d之间。
测定 40个原生质体再生菌株 、10个菌丝尖
端分离菌株和 14个组织分离菌株在麦粒种和粪
草料培养基中的生长速度 。DUNCAN 多重比较
结果表明 ,27个原生质体再生菌株在上述 2种培
21
食　用　菌　学　报 第 17 卷
养基中的菌丝生长速度均优于出发菌株A s2796;
T I2 、TI6 、TI12 、TI13 、TI14的生长速度显著优于
其它组织分离株 ,且与出发菌株差异较小;Tip2 、
Tip9 、Tip5 、Tip8之间差异不显著 ,但在两种培养
基质中生长速度较其它菌丝尖端分离菌株略快 。
因此 ,将上述 27个原生质体再生菌株 、TI2 、TI6 、
T I12 、TI13 、TI14 、Tip2 、Tip9 、Tip5 、Tip8 作为提
纯复壮的初筛菌株进行栽培试验 。
2.2 栽培试验结果与灰色系统关联分析法综合
评价分离菌株
　　通过栽培试验考察分离菌株和出发菌株
As2796的农艺性状并进行灰色系统关联分析 。
栽培试验所得各参试菌株农艺性状值见表 2。灰
色系统关联分析结果见表 3。根据各分离株与参
表 2　分离株的主要农艺性状
Table 2　Agronomic characteristics of isolated strains
菌株 Str ain K1(mm) K2(mm) K3(mm) K4(mm) K5(g) K6(kg/m2) K7(d)
参考菌株
P roje cted ideal str ain
42.0 24.0 20.0 15.0 28.0 8.5 30
P2 48.7 23.6 18.5 15.0 27.0 7.2 30
P7 37.4 18.8 13.0 9.3 16.8 4.8 40
P9 42.2 20.7 16.4 15.1 22.0 6.7 39
P11 45.9 23.9 19.1 18.2 27.2 7.0 30
P14 42.3 22.8 17.9 17.4 23.0 6.3 40
P15 44.8 24.8 17.3 23.9 25.2 5.9 40
P28 42.7 22.6 18.5 17.3 21.8 8.4 30
P30 43.5 23.8 16.9 14.4 21.2 5.8 32
P38 45.2 22.8 18.5 19.2 25.1 5.3 35
P39 43.9 22.6 18.0 20.7 23.0 7.5 40
P50 41.9 21.8 15.8 15.6 21.9 7.0 30
P51 42.3 20.8 14.8 15.9 19.6 6.6 38
P54 45.7 21.3 17.0 21.8 24.9 6.2 37
P55 43.9 21.8 17.2 18.1 25.8 5.4 40
P57 36.8 18.5 11.9 10.9 17.6 5.8 36
P59 44.3 23.1 19.8 20.5 23.0 6.4 37
P63 43.1 21.2 15.6 14.4 21.8 6.1 40
P65 41.4 21.0 16.4 19.7 20.3 5.9 43
P77 44.2 22.5 18.7 17.8 24.5 5.4 38
P89 43.3 21.9 16.5 21.0 23.0 7.8 35
P92 44.2 21.4 17.6 16.0 22.1 6.8 41
P93 45.2 20.8 18.9 17.6 24.9 6.9 35
P94 46.6 23.0 18.1 16.1 24.6 7.0 44
P98 41.5 22.2 15.6 14.3 21.1 7.2 41
P102 43.5 22.1 17.2 17.7 22.9 6.4 40
P106 44.2 22.0 17.4 16.4 23.5 5.5 33
P111 43.5 22.2 17.7 18.1 21.9 7.1 40
Tip2 45.0 23.0 17.1 20.7 24.1 7.5 40
Tip5 44.9 23.4 16.8 18.4 25.1 6.4 30
Tip8 43.5 22.1 19.4 17.9 23.1 6.6 30
Tip9 43.0 21.8 16.0 20.0 22.3 6.1 30
TI2 44.4 23.4 18.7 20.1 25.0 6.5 34
TI6 40.2 19.7 14.4 16.9 18.3 6.5 32
TI12 46.7 24.2 20.2 17.3 28.2 6.8 32
TI13 45.4 23.1 19.1 17.3 25.0 7.2 37
TI14 47.4 24.2 19.0 19.4 23.1 6.4 33
As2796 39.8 21.3 17.7 20.7 19.9 7.4 32
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第 3 期 樊晓琳 ,等:双孢蘑菇菌株 As2796 的提纯复壮
考菌株的灰色关联度的大小 ,有 20 个分离菌株
的关联序排在出发菌株 As2796之前 。表明 ,3种
复壮方法均有提纯复壮的效果。
P28 、P2与参考菌株的加权关联度分别为
0.8195 、0.7731 ,高于其它的原生质体分离株 ,其
中 P28 产量位居第一位 ,比出发菌株的产量高
14%。TI12与参考菌株的关联度为 0.7277 ,高
于其它的组织分离菌株。 Tip8与参考菌株的关
联度为 0.6685 ,高于其它的菌丝尖端分离菌株 。
因此选择 P28 、TI12 、Tip8 这 3个菌株作为每种
分离复壮方法的代表性菌株 。
3种分离复壮方法获得的表现较好的代表
性菌种(P28 、TI12 、Tip8)的扩大栽培试验结果
表明 ,与出发菌株 As2796相比 , P28 、TI12的子
实体更为结实 ,菇柄更短更粗 。P28和 TI12的
产量较生产中常规使用的 As2796 菌种提高约
10%,其中原生质体分离株 P28提纯复壮效果
最好。
表 3　栽培试验菌株与参考菌株的关联度及关联序
Table 3　Ranking of A.bisporus isolates and ideal strain
菌株
Stra in
关联序
Ranking
加权关联度
Weighting coeff icient
菌株
Str ain
关联序
Ranking
加权关联度
Weighting coef ficient
P28 1 0.8195 P111 20 0.6237
P2 2 0.7731 As2796 21 0.6230
TI12 3 0.7277 TI14 22 0.6190
P11 4 0.7255 P59 23 0.6189
P50 5 0.7103 P51 24 0.6175
TI13 6 0.6765 P63 25 0.6089
Tip8 7 0.6685 P106 26 0.6083
P98 8 0.6660 Tip9 27 0.6062
P9 9 0.6638 P102 28 0.6009
P30 10 0.6633 P77 29 0.5948
P89 11 0.6617 P38 30 0.5885
Tip5 12 0.6552 P55 31 0.5835
P94 13 0.6496 TI6 32 0.5806
P39 14 0.6417 P15 33 0.5744
Tip2 15 0.6373 P54 34 0.5501
TI2 16 0.6365 P65 35 0.5448
P14 17 0.6312 P57 36 0.4633
P93 18 0.6310 P7 37 0.4266
P92 19 0.6266
3　讨论
　　菌种退化是指菌种突然或逐渐丧失原有的
生活力和丰产性能的现象。提纯复壮是针对已
发生混杂 、退化的菌种进行分离改良的技术 。提
纯是对混杂而言 ,复壮是对退化而言。原生质体
的制备过程是通过裂解细胞壁后 ,将菌丝内的原
生质体机械性的分离。可能是由于变异的细胞
核和未变异的细胞核分布到不同的原生质体中 ,
经过原生质体再生之后 ,通过一系列测定和观
察 ,可以将优良的菌株从原生质体再生菌株中筛
选出来。研究表明 ,在植物芽尖或根尖组织细胞
中病毒粒子极少或没有 ,采用组织尖端细胞组织
分离生产无毒苗木已经在许多经济作物中应
用[ 9] 。菌丝体内也可能存在病毒颗粒 ,它们可在
菌丝细胞内大量复制 ,使菌丝活力降低 ,出菇少 ,
产量低 ,畸形菇增多。尽管没有进行双孢蘑菇菌
丝尖端病毒的检验 ,但本试验采用菌丝尖端分离
也是借鉴了植物脱毒苗生产的原理和方法 。组
织分离是获得食用菌菌种的常规途径之一 。由
于种菇的菇体品质 、菇龄 、携带病毒与否或携带
病毒多少 、分离部位 、个人操作经验等不同 ,而导
致组织分离菌株的性状表现并不完全相同 。本
试验采用原生质体分离 、菌丝尖端分离和组织分
离这 3种方法对双孢蘑菇退化菌株 A s2796进行
菌种再分离 ,结果有 14株原生质体分离株 、3 株
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食　用　菌　学　报 第 17 卷
组织分离株和 3 株菌丝尖端分离株综合性状优
于出发菌株 As2796 ,其中原生质体再生菌株 P28
的产量高于退化的 As2796出发菌株 14%。朱宏
发等在平菇中采用原生质体技术进行复壮 ,获得
了类似的结果[ 10] 。
菌株经提纯复壮分离后 ,怎样在众多的分离
株中筛选出性状优良的菌株是提纯复壮工作的
重点 。灰色关联度分析法主要用于作物新品种
的综合评价 ,能充分综合各品种的不同性状表
现 ,对优良品种的筛选具有一定的指导意义和应
用价值 ,已在香菇优良杂交子的筛选中得到应
用[ 11] 。利用灰色关联度分析方法对各菌株进行
综合评价时 ,构造的参考菌株的性状值和各性状
权重系数 ,对客观公正评价供试菌株的优劣至关
重要 ,应从筛选目标 、市场需求等多方面考虑才
能客观地筛选出综合性状优良的菌株。本试验
以筛选优质双孢蘑菇菌株为目标 , 根据市场需
求 ,要求菇体大小适中 ,盖厚柄短 , 产量高 ,菌龄
适中 ,以此为依据确定参考菌株的性状指标和权
重系数 ,用灰色关联度分析法评价各分离株的农
艺性状 ,从中筛选出综合性状优于出发菌株的优
良菌株。不同的筛选目标所考察的性状指标不
一定相同 ,权重系数也不同 ,因此在实践中应根
据不同的筛选目标来确定参考菌株的性状指标
和权重系数[ 11] 。
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[本文编辑] 　朱丽娜
Isolation of Rejuvenated Strains of
Agaricus bisporus As2796
FAN Xiaol in , YE Lǜsun , BIAN Yinbing＊
(I nstitute of Applied Mycology , H uazhong Agr icultur al University , Wuhan , H ubei 430070 , China)
Abstract:Protoplast , tissue and hyphal tip isolation methodologies were used to isolate re juvena ted strains
from the r etrogr essive str ain Agaricus bisporus As2796.Mycelia growth r ates on potato-dextrose-peptone-
yeast(PDPY)medium , wheat spawn medium and composted substr ate were determined and used to select
27 , f ive and four str ains , isolated by protoplast , tissue and hyphal tip isola tion me thodologies , respectively
for fruiting tests.Seven agronomic tra its (cap diameter and thickness , stipe diameter and length , ave rage
fruit body weight , yield per square meter and pe riod r equired for substr ate coloniza tion)were evalua ted by
gray cor rela tion analysis.Comparison of weighting coeff icient values revealed that isola tes P28 , Tip8 and
TI12 exhibited the most f avourable fruit body and cultivation char acter istics among the r ejuvena ted strains
obt ained using protoplast , tissue and hyphal tip isolation methodologies , r espectively.Overall , these strains
r anked 1s t , 7 th and 3 rd , r espectively among the 36 sele cted rejuvenated isolates.
Key words:Agaricus bisporus;protoplast isola tion;tissue isolation;hyphal tip isolation;purification and
re juvena tion;grey cor re la tion analysis
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