全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 30(1)：112— 116 2010年 1月
唐古特大黄 ISSR—PCR反应条件的优化
胡延萍 一，谢小龙1一，王 莉 ，杨 建 一，李 毅1
(1．中国科学院 西北高原生物研究所 高原适应与进化重点实验室，西宁 810001；2．中国科学院 研究生院，北京 100049)
摘 要：利用单因素试验对影响唐古特大黄 ISSR—PCR扩增的重要参数进行优化，以期建立其最佳反应条件。
结果如下 ：2O L反应体系包括 1．5×PCR buffer(15 mmol／L Tris—HCI，75 mmol／L KCI)，1．00 mmol／L
MgC12，0．6U Taq DNA聚合酶，0．125 mmol／L dNTP，0．5~mol／L引物和 3O ng模板 DNA；引物 UBC888适
宜的退火温度为 57．4℃。ISSR反应条件的建立为利用分子标记技术研究唐古特大黄居群遗传多样性奠定
了良好基础。
关键词：唐古特大黄；ISSR—PCR；优化
中图分类号：Q943 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2010)01—0112—05
Establishment and optimization 0f ISSR-PCR
· ■ ● · ● 一 11 1 0
reaction conOitionS tor J}c ， tanguttcum
HU Yan-Ping 一，XIE Xiao-Long 一，Ⅵ NG Li ，
YANG Jian1，2．LI Yil*
(1．Key Laboratory of Adaptation and Evolution of Plateau Biota，No~hwest Institute of
Plateau Biology，Chinese Academy of Sciences，Xining 810001，China；2．Graduate
University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China)
Abstract：Inter-Simple Sequence Repeats(ISSR)is a good molecular marker for revealing genetic diversity．Reaction
system difered in different species，SO optimization of ISSR-PCR reaction is very important．Factors which afect the
ISSR—PCR amplification，such as the concentration of Mg抖 ，Taq DNA polymerase，dNTP，primer and template DNA
with different annealing temperatures，were optimized and selected by using the genomic DNA of Rheum tanguticum
as materia1．Optimal PCR(20 L)mix contained 1．5×PCR bufer(15 mmol／L Tris—HCI，75 mmol／L KCI)，1．00
mmol／L MgCI2，0．6 U Taq DNA polymerase，0．125 mmol／L dNTP，0．5／*mol／L primer and 30ng template DNA．
The suitable annealing temperature was 57．4℃ for primer UBC888．Establishment of the PCR reaction conditions
could favor further studies on the genetic diversity of R．tanguticum by using ISSR molecular marker techniques．
Key words：Rheum tanguticum ；ISSR-PCR；optimization
ISSR(Inter—simple Sequence Repeats)标记，即
简单重复序列区间 DNA标记 ，是 由加拿大蒙特利
尔大学 Zietkiewicz等于 1994年创建的一种基于
PCR的分子标记技术。基本原理是：利用基因组中
存在的简单重复序列(Simple Sequence Repeats，
SSR)本身设计引物，在 SSR的 3 或 5 端加锚 1～4
个随机碱基，然后以此为 3 或 5 引物，对两侧具有
反向排列 的 SSR间 的基 因组 片段进 行扩增。与
RAPD相同，ISSR具有操作简单 ，所需 DNA量少，
无需预知研究对象基因组序列等优点，但 ISSR标
记产物多态性远比 RFLP、SSR、RAPD丰富，可提
供更多关于基因组的信息，且由于其引物较长、退火
收稿日期 ：2008—04—14 修回日期 ：2009—03—15
基金项目：国家科技支撑计划项目(2007BAD64B04)[Supported by National Key Technology R＆D Program(2007BAD64B04)]
作者简介；胡延萍(1981一)，女 ，山东定陶人，博士研究生，主要从事植物生物技术研究，(E-mail)huyanpingqfnu@163．com。
通讯作者(Author for correspondence，E—mail：liyi@nwipb．ae．cn)
1期 胡延萍等 ：唐古特大黄 ISSR—PCR反应条件的优化 113
温度较高，使其多态性和稳定性 明显优于 RAPD标
记技术，现已广泛应用于动植物的种质资源鉴定、遗
传连锁图谱的构建、基因定位、分类、进化和遗传多
样性 等方 面 的研 究 (王建 波 ，2002；周延 清 ，2005；
Nagaoka等，1997；Ammiraju等 ，200l；Sankar等 ，
2001；Kim 等 ，2002)。由于 ISSR 技 术 也 是 基 于
PCR的一种分子技术，所以同其它标记一样，其最
终结果易受 多种 因素 的干扰 ，如 Mg抖、Taq DNA
聚合酶、模板 DNA、dNTP和引物等都能影 响扩增
的结果 ，甚至其中一个 因子的改变都会导致扩增条
带弥散 、消失及位置的改变 ，从而严重影响整个实验
结果，因此，在研究时都应先建立合适的反应体系并
对其进行优化(李文表等 ，2006；顾奇萍等 ，2007)。
唐古特大黄(Rheum tanguticum)，又名鸡爪大
黄，为蓼科 (Po1ygonaceae)大黄属 (Rheum)多年生
草本植物，分布在西藏东部、青海 、甘肃，生于海拔在
1 700~4 300 m的山坡林缘、灌丛及半阴坡石堆中
(中国科学院西北高原生物研究所，1991)，是我国的
特有种(李安仁，1998；吴玉虎，2004)。其干燥根及
根茎人药，性寒，昧苦；具有泻热通肠，凉血解毒，逐
瘀通经之功效；为“正品大黄”之一(国家药典委员
会 ，2005)。迄今为止 ，对唐 古特 大黄 的药用化学成
分提取，HPLC指纹图谱 (郑俊华，1991；李磊等，
2005)，有效成分的药理作用(李淑娟等，2005)，组织
培养(董相军等 ，2004)和细胞学(胡延萍等，2007)进
行了大量研究 。有关唐古特大黄的分子生物学研究
甚少 ，文献报道仅见杨美华 (2001)以 RAPD标记鉴
别三种正品大黄；采用 ISSR分子标记来研究唐古
特大黄植物 ，至今未见报道 。
本文以唐古特大黄基因组 DNA为模板，建立
了条带清晰、重复性好 的唐古特 大黄 ISSR—PCR反
应体系，为进一步利用该技术进行唐古特大黄种质
资源鉴定及遗传多样性研究奠定了良好技术基础。
1 材料和方法
1．1材料
来源 ：唐古特大黄幼嫩叶片采 自青海省果洛州，
硅胶干燥后于一2O℃ 冰箱保存。主要试剂：ISSR引
物采用加拿大哥伦 比亚大学 (University of British
Columbia)提供的序列，由上海生工生物工程技术
服务有 限公 司合 成。Taq DNA 聚合 酶，dNTP，
MgC12，200bp DNA Ladder Marker均购 自宝生物
工程Ck连)有限公 司。
表 1 ISSR-PCR体 系的因素与水平
Table l Factors and levels used in ISSR—PCR reaction system
MgCI2(mmol／I )
Taq DNA聚合酶(u／2oi )
dNTP(rnmol／I )
Primer(p．mol／I )
DNA(ng／201 )
1．00
0．4
0．050
0．1
50
1．25
0．6
0．075
0．2
40
1．50
0．8
0．100
0．3
30
1．75
1．O
0．125
0．4
20
2。OO
l_2
0．15O
0．5
1O
1．2方 法
1．2．1 DNA提取与检测 基因组 DNA提取采用改
进 CTAB法 (Doyle等 ，1987；杨美 华 ，2001)。用
0．8％琼脂糖 凝胶对 DNA 质 量进 行 电泳检测 ，以
DNA／HindⅢ 为对 照，检测 DNA 片段 的长 度和
DNA浓度。
1．2．2 PCR反应与产物检测 ISSR—PCR原初反应
体系为20 L PCR反应体积中，1．5×PCR buffer
(15 mmol／L Tris—HCJ，75 mmol／L KC1)，1．875
mmol／L MgC12，0．075 mmol／L dNTP，0．3#mol／L
引物，0．9 U TaqDNA聚合酶，2O ng模板 DNA。
扩增 反应在 DyadDiseipleTM Peltier Thermal Cy—
cler型 PCR仪上进行。扩增程序为 94℃变性 5
min，然后进行 38个循环 ：94℃变性 20 S，55℃复性
60 S，72℃延伸 80 S，循环结束后 72℃延伸 6 min，4
℃保存 。扩增产物在 1．5 的琼脂糖凝胶 (含 0．5
／~g／mL EB)中电泳 ，电泳缓冲液为 1×TAE，电压 3
～ 5 V／cm，UVP Biolmaging System紫外成像系统
拍照记录电泳结果。
1．2．3 ISSR反应体系的优化 ISSR—PCR扩增反应
体系的优化采用单因素试验，试验因素及水平见表
1，每个水平重复 2次，每一因素的合适条件确定后
作为后续因素研究的基础。
1．2．4退火温度的确定 采用梯度 PCR模式：在
l14 广 西 植 物 3O卷
UBC888引物 Tm(53．8℃)值上下设 置 12个温度
梯度 (50．0、50．3、50．9、51．7、52．8、54．3、56．0、
57．4、58．5、59．3、59．8、60．0℃)进行筛选，其余
PCR扩增程序同 1．3．2。
2 结果与讨论
2．1 Me 浓度对 ISSR扩增的影响
Mg 浓度是影响 PCR扩增的一个主要 因素。
作为 Taq DNA聚合酶的辅助因子，Mg抖浓度不仅
影响 Taq DNA聚合 酶的活性 ，还能与反应液 中的
dNTP、模板 DNA及引物结合 ，影响引物与模板的
结合效率、模板与 PCR产物的解链温度以及产物的
特异性和引物二聚体的形成 (林万 明，1993)。本试
验对 5个 Mg 浓度梯度(表 1)进行比较，结果(图
1)显示不同浓度间扩增结果差异较大：Mg。 浓度的
变化不仅影响 ISSR条带的数量，还影响其强弱及
有元。Mg抖浓度大子等于 1．50 mmol／L时，出现
非特异性模糊条带且泳道背景较深；Mg抖浓度为
1．25 mmol／L时，两个重复不一致，2号扩增在 600
bp和 800 bp之间出现一条模糊条带 ，且大于 1 400
bp处也有模糊条带 ；Mg。 浓度为 1．O0 mmol／L时，
扩增条带清晰，稳定性好，因此，Mg 浓度选用
1．00 mmol／L。
图 l Mg +对 ISSR扩增的影响(引物 UBC888)
Fig．1 Effect of Mg0+ concentration on ISSR
amplification(Primer UBC888)
1-5 为1—5的重复，1-5：M 浓度分别为 1．00、1．25、1．50、1．75、
2．00 mmol／L；M：200 bp标准分子量参照物，下同。
2．2 Taq DNA聚合酶对ISSR扩增的影响
Taq DNA聚合酶是 PCR扩增反应的关键因
素。在实验过程中，为了保持扩增反应的稳定性，应
尽量使用同一厂家同一批次的 Taq DNA聚合酶。
Taq DNA聚合酶为 0．4 U时(图 2)，扩增条带少，
重复性差；Taq DNA聚合酶大于等于 0．8U时，扩
增条带数量增多 ，但 出现模糊条带，不易辨认 ；唯有
Taq DNA聚合酶为 0．6U时 ，扩增条带清晰且稳定
性好。2O L反应体 系 Taq DNA 聚合酶 的量以
0．6 U较为适宜 。
图2 Taq DNA聚合酶对ISSR扩增的影响
Fig．2 Effect of Taq DNA polymerase
on ISSR amplification
1 一5 为 I一5的重复，1-5：Taq DNA聚合酶的量
分别为：0．4、0．6、0．8、1．0、1．2 U。
图 3 dNTP对 ISSR扩增的影响
Fig．3 Effect of dNTP concentration
on ISSR amplification
1-5 为 1—5的重复，1—5：dNTP浓度分别为 0．050、
0．075、0．100、0．125、0．150 mmol／L。
2．3 dNTP浓度对 ISSR扩增的影响
dNTP是 PCR反应的原料。dNTP浓度过低
会导致扩增带产率低，过高会产生错误掺入。当
dNTP浓度为0．050 mmol／L和0．100 mmol／L时，
扩增条带少，且位于 1 400~2 000 bp之间的条带模
糊不易辨认；当dNTP浓度为0．150 mmol／L时，两
次重复不一致；当dNTP浓度为 0．075 mmol／L时，
1 600 bp左右的条带有些模糊，且800~1 000 bp之
间出现一条非特异性带。dNTP浓度为 0．125
mmol／L时，产物丰富，条带清晰，重复性好。从整
1期 胡延萍等：唐古特大黄 ISSR—PCR反应条件的优化 115
图 4 模板 DNA对 ISSR扩增的影响
Fig．4 Effect of template DNA concentration
on ISSR amplification
1-5 为 1—5的重复，1-5：模板 DNA用量
分别为 5O、4O、3O、2O、1O ng。
体上看 ，dNTP的适宜浓度为 0．125 mmol／L。
2．4模板 DNA量对 ISSR扩增的影响
从图 4所示的 5个模 板梯度扩增结 果可 以看
出：当模板用量大于等于 4O ng时，有模糊条带，不
易辨认；模板用量越大，产物越多，条带越亮。当用
量小于等于 20 ng时，出现一些模糊条带和非特异
性带 ，且扩增条带不稳定 。模板用量为 3O ng时，条
带稳定且清晰，亮度适 中，是最适模板 DNA用量 。
图 5 引物浓度对 ISSR扩增的影响
Fig．5 Effect of primer concentration
on ISSR amplification
1 一5 为 1-5的重复，1-5：引物浓度分别
为 o．1、o．2、o．3、o．4、o．5,umol／L。
图 6 UBC888退火温度梯度
Fig．6 The gradient of annealing temperature in UBC888
1 ～12 为 1-12的重复 ，1—12退火温度分别为 ：50．0、5O．3、50．9、51．7、52．8、54．3、56．0、57．4、58．5、59．3、59．8、60．0。
2．5引物浓度对 ISSR扩增的影响
当引物浓度为 0．1#mol／L时 ，无扩增产物；当
引物浓度为 0．2 ptmol／L和 0．4／~mol／L时扩增 条
带较少且强度弱；当引物浓度为 0．3~mol／L虽然
扩增条带多，亮度增强，但大于 1 400 bp的条带模
糊，不清晰。当引物浓度为 0．5／~mol／L时，带型清
晰，稳定性好。本试验最佳引物浓度为0．5,umol／L。
2．6退火温度的确定
根据公式 Tm=4(G+C)+2(A+T)计算引物
理论退火温度，ISSR—PCR退火温度一般在 Tm值
附近上下浮动 1～3℃(陈大霞等，2007)。本试验以
引物 UBC888为例，梯度 PCR仪在 50．0～6O．0℃
之间自动生成 12个退火温度梯度，电泳结果见图
6。当退火温度 50．O～54．3℃时 ，扩增条带较弱 ，背
景较深，且 出现模糊条带和非特异性条带 ；退火温度
56．0℃时条带清晰，但大分子量(1 400 2 000 bp)
的条带模糊；退火温度 58．5℃和大于59．8℃时，两
个重复不一致，稳定性差 ；退火温度 59．3℃时出现
非特异性条带。唯有退火温度57．4℃，扩增的条带
之闻界限分明、亮度适宜、背景清晰且重复性好。故
选择 57．4℃为 UBC888的最适退火温度。
3 结论
影响 ISSR—PCR扩增结果的因素很多，为获得
稳定、可靠的ISSR谱带，有必要对其影响因子进行
0 0 0 8 0 0 0 0 跏 兰兰曼兰啪Ⅲ 枷 Ⅲ
116 广 西 植 物 3O卷
优化，筛选出最佳 ISSR扩增条件。唐古特大黄 IS—
SR—PCR分析较适 宜的扩增条件是 ：2O L反应体
积含 1．5×PCR buffer(15 mmol／L Tris—HC1，75
mmol／L KC1)，1．00 mmol／L MgC12，0．6 U Taq
DNA聚合酶 ，0．125 mmol／L dNTP，0．5／~mol／L
引物，3O ng模板 DNA；引物 UBC888的最佳退火
温度为 57．4℃。利用优化的系统 ，从 100个 ISSR
引物中筛选 出重复性好、条带清晰的 15个引物，对
图 7 引物 UBC888对唐古特大黄个体的扩增结果
Fig．7 The amplification results of 14 R．
tanguticum individuals by UBC888
唐古特大黄不同个体进行扩增，能得到清晰、稳定、
多态性高的 ISSR谱带(图 7)。这为进行唐古特大
黄种质资源鉴定及遗传多样性研究奠定了良好基
础。有关唐古特大黄居群遗传多样性和遗传分化将
另发文章。
参考文献 ：
中国科学院西北高原生物研究所．1991．藏药志[M]．西宁：青
海人民出版社：83
李安仁．1998．中国植物志[Ⅳ口．北京：科学出版社，25：184—186
杨美华．2001．正品大黄的分子鉴定及其系统亲缘关系[D]．北
京：北京大学
国家药典委员会．2005．中华人民共和国药典 (一部)[s]．北
京：化学工业出版社 ：17一l8
林万明．1993．PCR技术操作和应用指南[M]．北京 ：人民军医
出版社 ：7—14
周延清．2005．DNA分子标记技术在植物研究中的应用I-M]．
北京 ：化学工业出版社 ：146—161
Ammiraju JSS，DholaIda BB，Santra DK，et a1．2001．Identification
of inter-simple sequence repeat(ISSR)markers associated with
seed size in wheati,J]．TheorAppl Genet，102：726—732
ChenDX(陈大霞)，Li LY(李隆云)，Lu c(鲁成)，et a1．2007．
Dong XJ(董相 军)，Wang L(王 莉)，Xu WH(徐文 华)，et a1．
2004．Plantlet regeneration from dormancy buds of Rheum tan—
guticum(唐古特大黄休眠芽诱导植株再生)l-J]．Plant Physiol
CoTnTnun(植物生理学通讯)，40(4)：45
Doyle JJ．Do yle J L．1987．A rapid DNA isolation procedure for
smal quantities of fresh leaf tissue[J]．Focus，12：13—15
Gu QP(顾奇萍)，Jin ZX(金则新)，Li JM(李钧敏)．2007．Opti-
mization of ISSR amplification conditions for Rhododendron for-
tunei(云锦杜鹃 ISSR扩增条件的优化)[J]．Cruihaia(广西植
物)，27(4)：560—563
Hu YP(胡延萍)，Xie XL(谢小龙)，Wen Q(温泉)，et a1．2007．
Studies on karyotypes of five populations of Rheum tanguticum
(Polygonaceae)(唐古特大黄五个居群的核型)[J]．Acta Bot
Yunnan(云南植物研究)，29(4)：429—433
Kim DH ，Zur G，Danin-Poleg Y，et a1．2002．Genetic relationships
of sesame germplasm colection as revealed by inter-simple se·
quence repeats[J]．Plant Breeding，121：259-262
Lj L(李磊)，Liu R(刘瑞 )，Yuan B(袁波)，eta1．2005．Finger-
prints analysis of Radix et Rhizoma Rhei by HPLC(大 黄
HPLC指纹图谱分析)[J]．ChinPharm J(中国药学杂志)，
40(17)：1 302—1 305
SJ(李 淑娟)，Dong XH(董晓 华)，Wu HX(武 海霞)，et a1．
2005．Review of Rhubarb and pharmaceutical effects of its effec—
tive constitutes(大黄及其有效成分药理作用研究)[J]．Medi—
calRecapitulate(医学综述)，11(1)：76—78
Li WB(李文表 )．Zhou XY(周先叶)，Li Y(李勇)，et a1．2006．
Discussion on the ISSR reaction condition of Trachyc~rpus for—
tunei(棕榈ISSR反应条件的筛选与优化)[J]．Guihaia(广西
植物)，26(2)：204—208
Nagaoka T，Ogihara Y． 1997． Applicability of inter-simple se—
quenee repeat polymorphisms in wheat for use as DNA markers
in comparison to RFLP and RAPD markers[J]．Theor Appl
C-enet，94：597— 602
Sankar AA，Moore GA．2001．Evaluation of inter-simple sequence
repeat analysis for mapping in Citrus and extension of the genetic
linkage map[J]．Theor Appl Genet，102：206～214
Study on optimization of ISSR reaction conditions for Coptis
chinensis(黄连ISSR反应条件优化的研究)[J]．Bull Bot Res
(植物研究)，27(1)：76—81
Wang JB(王建波)．2002．ISSR markers and their applications in
plant genetics(ISSR分子标记及其在植物遗传学研究中的应
用)[J]．Hereditas(遗传)，24(5)：613—616
Wu YH(吴玉虎)．2004．Floristic characteristics in the region of
Bayan Hat Mountmns(巴颜喀拉山地区植物区系研究)[J]．
Acta Bot Yunr~／n(云南植物研究)，26(6)：587～603
Zheng JH(郑俊华)．1991．Analysis of chemical constituents of
the genus Rheum[J]．J Beijing Med Univ(北京医科 大学学
报)，23(1)：51—53
Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D．1994．Genome fingerprinting
by simple sequence repeats(SSR)一anchored polymerase chain re-
action amplification[J]．Genomics，20：176—183