全 文 ：中国生态农业学报 2009年 11月 第 17卷 第 6期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Nov. 2009, 17(6): 1200−1205


* 国家科技支撑计划项目(2007BAD52B06、2006BAD04A04、2006BAD01A19)、农业部行业专项(nyhyzx07-022)和现代农业产业技术体
系建设专项资金资助
** 通讯作者: 师尚礼(1962~), 男, 汉族, 教授, 博士生导师, 主要从事牧草种质资源方面的研究。E-mail: shishl@gsau.edu.cn
李剑峰(1979~), 男, 汉族, 在读博士, 主要从事草坪草及牧草种质资源、植物内生菌和微生物制剂方面的研究。E-mail: ljfsmart@qq.com
收稿日期: 2009-01-28 接受日期: 2009-04-29
DOI: 10. 3724/SP.J.1011.2009.01200
苜蓿内生根瘤菌分布部位与数量变化动态*
李剑峰 张淑卿 师尚礼** 霍平慧
(甘肃农业大学草业学院 草业生态系统教育部重点实验室 中-美草地畜牧业可持续发展研究中心 兰州 730070)
摘 要 为探明根瘤菌在苜蓿植株及其种子内的分布规律, 对苜蓿植株及种子各部位在不同生育期内生根瘤
菌的分布和数量变化进行了研究。结果表明: 苜蓿植株内根瘤菌的分布和数量在空间和时间上都具有很大异
质性。空间分布上, 不同部位组织的内生根瘤菌数量随植株光合产物源-库的运输方向呈逐渐增大的趋势, 绝
大部分内生根瘤菌分布于植株的根系, 并主要分布于毛根, 在主根内主要存在于表皮和皮层, 中柱分布较少;
在植株地上部分, 内生根瘤菌主要在营养期末分布于花芽[8.6~9.6×103cfu·g−1(FW)], 在蕾期和花期分布 于雌
蕊子房的子房壁, 在结荚期分布于荚果果皮(1.07×103cfu·pod−1), 在种子成熟期则主要存在于新生的种子中;
茎内的根瘤菌数量在营养期和结荚期不足 2×102 cfu·g−1(FW), 而在蕾期和花期完全绝迹; 叶片内则始终不存
在根瘤菌。在时间上, 结荚期根、荚果皮内的根瘤菌数量明显高于其他时期; 花内各器官(不包括花梗)在授粉
后根瘤菌数量迅速增加; 由子房向荚果发育的过程中, 子房壁和胚珠内的根瘤菌数量随时间呈对数增长; 胚
珠在受精后即存在有内生根瘤菌, 并且幼嫩种子内生根瘤菌数量远高于受精胚珠, 证明内生根瘤菌能被转运
并定殖在发育早期的种子中。两个苜蓿品种成熟种子在收获 120 d后, 根瘤菌数量比刚收获时分别增加 131.46
倍(“陇东”)和 11.76倍(“游客”), 说明根瘤菌进入种子后, 仍然有一个继续繁殖增长的过程。
关键词 苜蓿 内生根瘤菌 生育期 器官
中图分类号: S154.4; S812; S41; S541 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2009)06-1200-06
Position and quantity of endogensis rhizobia in alfalfa plant
LI Jian-Feng, ZHANG Shu-Qing, SHI Shang-Li, HUO Ping-Hui
(College of Pratacultural Science, Gansu Agricultural University; Key Laboratory of Grassland Ecosystem of the Ministry
of Education; Sino-US Center for Grazingland Ecosystem Sustainability, Lanzhou 730070, China)
Abstract To determine the distribution characteristics of rhizobium in alfalfa plants and seeds, the distribution and abundance of
endogenous rhizobium in different parts and seed of alfalfa at different growth stages were analyzed. The result indicates significant
spatial and temporal heterogeneity in endogenous rhizobium abundance in alfalfa plant. For the spatial distribution, rhizobium abun-
dance gradually increases with source-sink transportation trend of plant photosynthate. Most endogenous rhizobia are distributed in
alfalfa root, mainly in the hair roots. In main root, more endogenous rhizobia exist in the epidermis and cortex areas compared with
stele. Regarding the above-ground plant parts, endogenous rhizobia are mainly distributed in flower buds at vegetative stage
[8.6~9.6×103 cfu·g−1 (FW)], and in ovary walls of pistils at budding and floral stage. For pod-bearing stage, endogenous rhizobia are
mainly in the pericarp of legumes (1.07×103 cfu·pod−1), and in newborn seeds at mature stage. Rhizobium abundance in stalk is less
than 2×102 cfu·g−1 (FW) at vegetative and pod-bearing stages, which vanishes at budding and floral stages. Rhizobia are not found in
leaves. Temporally, rhizobium abundance in root and pericarp is obviously higher at pod-bearing stage than any other growth stage.
Rhizobium abundance in various floral organs (except pedicle) rapidly increases after pollination. During ovary-to-legume germina-
tive process, rhizobium abundance in ovary wall and ovule increases logarithmically. Endogenous rhizobia are found in ovule only
after fertilization, and rhizobium abundance in young seeds is higher than in fertilized ovule. This implies that endogenous rhizobia
can be transported and colonized in early germinated seedlings. Rhizobium abundance in mature seeds of the two alfalfa varieties
第 6期 李剑峰等: 苜蓿内生根瘤菌分布部位与数量变化动态 1201


stored for 120 d after harvest are 131.46 (“Longdong”) and 11.76 (“Eureka”) times higher than in newly harvested seeds. This sug-
gests continuous proliferation of rhizobia after seeds are infested.
Key words Alfalfa plant, Endogenous rhizobium, Growth stage, Organ
(Received Jan. 28, 2009; accepted April 29, 2009)
植物内生菌指分布于无外在感染症状的健康植
物组织内, 能在植物组织中定殖与运转, 对植物无
害甚至有益的微生物[1]。植物内生菌在植物体内有
稳定的生存空间, 可有效地提高宿主植物的生存能
力和抗病能力, 并与宿主植物协同进化, 彼此形成
稳定的生态关系[2]。内生细菌已发现约 50 属[3], 其
中不乏具有抗逆、固氮并能产生植物生长促进剂的
菌株。杨海莲[4]等分离出的内生固氮细菌 MR12 兼
有固氮和防病作用。Baldani等[5]研究发现, 植物内生
固氮菌可定殖在植物内部, 并与植物宿主联合固氮。
有研究表明, 感染内生菌的植物宿主往往具有生长
快速、抗逆境、抗病害、抗动物危害等优势, 比未感
染植株更具生存竞争力[6]。崔林等[7]从马铃薯块茎中
分离出的内生细菌能在平板培养中拮抗环腐病菌。祁
娟等 [8]从苜蓿种子内分离出的根瘤菌(Rhizobium)具
有固氮、溶解无机磷和分泌生长素的作用。
随着研究领域的不断拓宽和研究方法的不断深
入, 因在农业和医药领域的巨大应用潜力, 内生菌
已逐渐成为国内外研究的热点。但内生菌多属异养
生物, 依靠植物提供的养分生存, 除可通过种子传
播外, 还可通过气孔、水孔和皮孔等进入植物体内,
或通过昆虫传播和再分布, 甚至由根际真菌的携带
达到重新分布的目的地[6]。因此, 内生菌在植株体内
的分布和数量不是恒定的 , 会随环境而改变 [9], 呈
现时间及空间上的差异。目前已有的研究主要集中
在内生菌的分离和菌种的利用方面, 而对某一特定
菌种在植物体内的分布动态却少有报道。本试验拟
通过对苜蓿内生根瘤菌在宿主植株各部位及不同生
育期内的分布和数量变化的研究, 了解根瘤菌在苜
蓿植株及其种子内的分布规律, 为内生菌的利用提
供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验地概况与试验材料
1.1.1 试验地概况
试验于 2004 年在甘肃农业大学兰州牧草实验
站内进行 , 该站位于兰州市西北部 , 东经 102°36′,
北纬 35°34′, 海拔 152 5 m, 年均降水量 330 mm, 年
平均日照时数 2 446 h, 全年无霜期 180 d以上。土
质为砂壤, pH 8.09, 速效氮 105 mg·kg−1, 速效磷
25.32 mg·kg−1。
1.1.2 供试材料
2个供试苜蓿品种已生长 3年, 分别为甘肃本地
品种“陇东”(Medicago sativa L. Longdong)和引进
美国的品种“游客”(M. sativa L. Eureka)。植株生长
健壮无病虫害, 营养期取样时平均株高分别为 120
cm和 147 cm。 每品种 3个种植小区, 每种植小区
6 m2, 种植密度 12株·m−2。
表面处理药剂: 碘伏(聚乙烯吡咯烷酮碘)消毒
液, 有效碘数量为 2 500 mg·L−1; ST 液含 0.9%
NaC1、 0.5%吐温 80和 0.5%硫代硫酸钠, 有清除植
物材料表面的污物、抑制抑菌剂活性的作用。
试验用培养基为 YMA 刚果红培养基, 含甘露
醇 10.0 g·L−1, NaCl 0.1 g·L−1, MgSO4·7H2O 0.2
g·L−1, 酵母粉 1.0 g·L−1, K2HPO4 0.5 g·L−1, 琼脂
15~20 g·L−1, 0.5% 刚果红液 4 mL·L−1, 蒸馏水
1 L·L−1, pH 7.0~7.2。
1.2 研究方法
1.2.1 植物材料的取样、表面消毒及组织器官的分离
分别于营养期、现蕾期、花期和结荚期在每个
苜蓿品种的 3 个种植小区内各随机取 1 株植株(共 3
株), 连根挖起后清洗整株, 晾干表面明水后用无菌
剪刀分离为根、茎、叶、茎尖 4 部分, 用无菌手术
刀自花芽(花芽仅在营养期取样)与植株的连接处将
花芽切下。将分离出的组织材料称取 1 g 置于无菌
三角瓶中, 加碘伏溶液震荡灭菌 5 min 后用无菌水
冲洗 5 次, 再加入无菌 ST 液洗涤 1 min, 无菌水冲
洗 5次, 以上过程对主根、叶片和茎重复两次, 对茎
尖及花芽进行 1 次。冲洗后再将主根用手术刀解剖
分离为中柱和皮层(包括内外皮层和表皮)。
植株的花蕾、花或荚果分别在现蕾期、花期及
结荚期用无菌手术刀自花梗(荚果梗)与植株连接的
部位与植株分离, 并以上述方法表面消毒, 其中碘
伏溶液消毒时间为 3 min。在无菌工作台内晾干明水
后置于解剖镜下, 用手术刀先将花梗(荚果梗)切下,
再用无菌解剖针将花瓣去除, 将花蕾(花)分离为花
药(花粉)、花丝、雌蕊和花托, 将雌蕊在解剖镜下再
分离为柱头、花柱和子房, 最后取部分发育良好的
子房, 将子房壁小心剖开, 取出其中的胚珠。荚果则
用解剖针挑开, 取出其中的幼嫩种子, 幼嫩种子和
荚果皮分别置于无菌离心管中备用。
花期未受精胚珠与受精胚珠的判别: 参照陈宝
书的方法[10]以花的形态特征及龙骨瓣的位置判断花
是否已授粉, 并在 40~100倍显微镜下观察雌蕊是否
产生到达胚珠的花粉通道来判断胚珠受精与否。
1202 中国生态农业学报 2009 第 17卷


成熟的荚果于种子收获期于种植小区内随机采
集[11]。剥开荚果后将种子置于室温保存, 120 d后取
出, 以相同的方法进行表面消毒(碘伏灭菌 5 min, 无
菌水冲洗 5遍), 在培养皿内加 5 mL无菌水浸泡 12 h,
待种皮泡软时用解剖针和手术刀将种胚、子叶和种皮
剥离, 子叶及种胚剥离后用无菌水冲洗 5遍备用。
以上过程除室外采样及植株表面清洗外均在无
菌条件下完成, 花内组织和种子等细微结构的解剖
和分离均在解剖镜下进行。
1.2.2 植物组织中内生根瘤菌的分离和数量测定
将分离出的茎、叶、茎尖、花芽, 毛根、侧根
及主根(主根已分离为皮层和中柱两部分)各称取 1 g,
加 2 mL无菌水在研钵中研磨均匀。以 10枚花或荚
果为 1个样品单位, 将花梗(荚果梗)及从花蕾、花和
荚果内分离出的花药、柱头、子房等组织分别加
1 mL无菌水研磨。以上处理 3次重复。将研磨得到
的组织匀浆 2 mL转入 20 mL刻度试管, 加无菌水至
刻度后配制成原液 1×10−1 浓度的稀释液, 取该稀释
液 1 mL 加无菌水 9 mL 配制 1×10−2浓度的稀释液,
并依次配制 10−3、10−4、10−5的稀释液。每浓度 3次
重复, 离心(4 000 r·min−1, 10 min)后取上清液 0.2
mL, 稀释平板法涂抹至含刚果红的YMA培养基上。
将涂抹后的平板置于生化培养箱中 28 ℃培养 48 h
后, 参照黄宝灵的方法[12](根瘤菌单菌落在 YMA 刚
果红培养基上不吸附色素 , 圆形 , 边缘光滑 , 中间
隆起呈黏质半透明状, 并在结晶紫培养基上正常生
长)区分并记录每皿的根瘤菌单菌落数量。以林稚兰
的方法[13]选择菌落均匀、约每平板 30~300个菌落的
稀释度计算每处理组织中内生根瘤菌的最大可能菌
数。并取每培养皿中的典型菌株分离纯化培养后编
号保存。
1.2.3 内生根瘤菌的回接鉴定
将初步分离纯化后保存的根瘤菌株接入 YMA
固体平板培养基活化 24 h, 再转入 YMA 液体培养
基, 120 r·min−1、28 ℃摇床培养至培养液光密度值
(OD600 nm值)≥1时, 10 000 r·min−1离心 10 min,
抛去上清液后用无菌水洗下菌体, 摇匀打散后用无
菌水调制成 OD600 nm为 0.5的菌悬液。用该菌悬液
浸泡表面消毒后发芽的苜蓿种子 30 min, 将浸泡后
的种子植入灭菌后的试管蛭石中, 剩余菌液加入装
有蛭石的试管中 , 加盖棉塞 , 置于培养室中培养
8~10 d, 去掉棉塞, 自然培养。每个菌株 3 个试管,
每试管植入 5 粒种子作为重复, 以无菌水代替菌液
处理为对照。培养条件: 光照度 7 000~8 000 lx, 光
照时间 12 h·d−1, 有光照温度 21~25 ℃, 无光照温
度 16~20 ℃, 相对湿度 50%~70%。接种 45 d 后取
出苜蓿植株测算单株根瘤数和结瘤率, 将无结瘤能
力的菌株判定为非根瘤菌或无效根瘤菌, 本文数据
所涉及的根瘤菌菌株均已经过上述方法鉴定。
1.3 数据处理
根、茎、叶、茎尖、花芽数据以每克组织为单
位, 花梗(荚果果梗)及花(荚果)内各部位组织以 1 枚
花(荚果)为单位, 胚珠或种子每 10 粒为 1 个单位(1
枚花或荚果内平均含有约 10 粒胚珠或种子)。数据
处理采用 DPS统计软件以 LSD法进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 不同时期植株地下部分各部位内生根瘤菌数量
由表 1 可见, 内生根瘤菌在两个苜蓿品种根部
的各个部位均有分布, 且分布规律基本一致, 即内
生根瘤菌在各个时期均主要存在于毛根内, 平均最
高菌数达到 5.1×107 cfu·g−1; 侧根及主根内的根瘤
菌数量则不足毛根组织菌数量的 0.2%。这说明毛根
为根瘤菌在植株地下部分的主要存在部位, 这可能
与毛根表面积较大有关。侧根和主根内的根瘤菌数
量相近, 主根内根瘤菌则主要分布于根表皮和皮层,

表 1 不同时期苜蓿根部内生根瘤菌数量
Tab. 1 Endogenous rhizobia amount in alfalfa root in different growth stages
根瘤菌数量 Endogenous rhizobia amount [cfu·g−1(FW)] 检测部位
Optimum part
生育时期
Growth stage 陇东 Longdong 游客 Eureka 平均 Average
营养期 Vegetative stage 810 130 470
盛花期 Florescence stage 252 280 366
主根表皮及皮层
Epidermis and cortex
of main roots
结荚期 Bearing pod stage 4 786 2 090 3 438
营养期 Vegetative stage 106 22 64
盛花期 Florescence stage 78 25 52
主根中柱
Stele of main roots

结荚期 Bearing pod stage 708 390 549
营养期 Vegetative stage 848 673 761
盛花期 Florescence stage 1 438 520 979
侧根
Lateral roots

结荚期 Bearing pod stage 6 120 3 326 4 723
营养期 Vegetative stage 707 546 990 212 848 879
盛花期 Florescence stage 732 532 874 796 803 664
毛根
Hair roots

结荚期 Bearing pod stage 3 196 370 7 037 810 5 117 090
第 6期 李剑峰等: 苜蓿内生根瘤菌分布部位与数量变化动态 1203


同时期主根中柱内的根瘤菌平均数量均仅为皮层和
表皮内根瘤菌数量的 10.0%~16.8%, 这与刘成运
等[14]的研究结果不同, 即百合根系中的内生菌主要
分布于主根的中柱, 而在皮层及表皮层分布较少。
不同生育时期各部位内生根瘤菌数量差异较
大, 结荚期根各部位的菌数最高, 主根及毛根在盛
花期和营养期时的菌数量仅为结荚期时的 9.5%~
16.6%, 而侧根在营养期、盛花期的平均根瘤菌数量
亦仅为结荚期的 16.1%~20.7%。
2.2 不同时期苜蓿植株地上部分各部位内生根瘤
菌数量
从表 2 可以看出, 苜蓿植株地上部分(不计花与
荚果) 仅在茎和花芽内携带有内生根瘤菌, 叶片中
虽有大量杂菌存在, 但无根瘤菌检出, 茎尖内则无
任何可培养的菌落检出。苜蓿植株茎内仅在营养期
和结荚期有根瘤菌存在, 且两个时期的根瘤菌数目
相对稳定。而在蕾期与花期只有杂菌而无根瘤菌存
在。花芽在营养期末形成 , 内含有大量的根瘤菌 ,
“陇东”和“游客”两品种植株花芽内的根瘤菌数
量分别为同时期茎内生根瘤菌数量的 66.2 倍和
114.3倍。对各生育期两品种地上部分和根总根瘤菌
数量的调查发现, 两苜蓿品种植株地上部分的平均
总根瘤菌数量在营养期、盛花期和结荚期仅为根的
0.14%、0.037%和 0.009 2%, 且根瘤菌在茎内的分布
在时间上也是不连续的。这与龙良鲲等[15]的研究结
果类似, 即生防菌 01-144 在番茄植株根内的定殖能
力大于茎, 茎中的 01-144 菌定殖动态也呈由增到减
的趋势。这一现象说明内生根瘤菌同多数内生细菌一
样能在植物体内转移, 并对特定的部位有所偏好[16]。
2.3 授粉前后苜蓿花各部位内生根瘤菌数量
苜蓿为异花授粉植物, 开花前雌蕊保持未授粉
状态, 此时的花药和柱头均无根瘤菌存在(图 1a)。而
在雌蕊柱头以下部分, 即花柱和子房内有根瘤菌分
布, 花托和花梗内亦有少量根瘤菌存在。两苜蓿品
种子房内的根瘤菌数量最高, 平均根瘤菌数量分别
为花柱、花梗和花托的 226.3%、211.1%和 554.0%, 差
异极显著(P<0.01); 花托内的平均根瘤菌数量最低,
仅为花柱和花梗内根瘤菌数量的 42.1%和 38.1%。
授粉后, 子房根瘤菌数量达到 21.4 cfu·flower−1,
迅速增高到授粉前的 497.7%, 花柱和花托内的平均
根瘤菌数量亦分别增加到授粉前的 210.5%和
366.7%(图 1b)。与其他组织不同的是, 花梗在授粉
后无根瘤菌检出。
授粉前后花内组织根瘤菌数量变化表明, 根瘤
菌在子房中的积累速度明显快于其他部位。柱头内
的根瘤菌来源可以推测为由花粉带入, 随着花粉管

表 2 不同时期苜蓿植株地上部分内生根瘤菌数量
Tab. 2 Endogenous rhizobia amount in alfalfa shoot in different growth stages
内生根瘤菌数量 Endogenous rhizobia amount [cfu·g−1(FW)] 品种
Variety
生育时期
Growth stage 茎 Stem 叶片 leaf 茎尖 Stem tip 花芽 Flower bud
营养期 Vegetative stage 130 + − 8 600
蕾期 Squaring stage + + −
花期 Florescence stage + + −
陇东
Longdong


结荚期 Bearing pod stage 170 + −
营养期 Vegetative stage 84 + − 9 600
蕾期 Squaring stage + + −
花期 Florescence stage + + −
游客
Eureka


结荚期 Bearing pod stage 80 + −
“+”表示无根瘤菌, 但有其他菌检出; “−”表示无任何可培养菌种检出。 “+”means no rhizobia but other bacteria exists; “−” means no bacteria exists.


图 1 授粉前(a)、后(b)苜蓿花各部位内生根瘤菌数量
Fig. 1 Endogenous rhizobia amount in flower tissues before (a) and after (b) pollination of alfalfa
1204 中国生态农业学报 2009 第 17卷


的生长进入柱头组织, 但花粉中的根瘤菌来源尚不
明确, 试验中分离出的花丝在授粉前后均不曾携带
任何可培养菌, 也有可能是材料处理过程中花丝较
其他组织更易被消毒液渗透 , 其内含菌被杀灭所
致。授粉后, 两苜蓿品种柱头和花粉内的根瘤菌从
无到有迅速增加, 刘成运[13]等对百合花药和花粉的
切片染色后观察发现, 花药横切片内部绒毡层及药
室的小孢子母细胞中尚未出现细菌, 而在成熟的花
粉粒中有细菌分布, 这与本试验的结果一致。柱头
内根瘤菌的变化与花粉内的变化趋势一致 , 因此 ,
可以推测花粉携带的根瘤菌随着花粉在柱头上的萌
发而进入柱头组织。
2.4 苜蓿荚果及种子各发育时期内生根瘤菌数量
的变化
苜蓿荚果发育过程中, 花内的胚珠受精后发
育为种子, 子房壁发育为荚果皮。这一过程中, 子
房壁(荚果果皮)内生根瘤菌数量呈先升后降趋势,
在结荚期达到最大值, 随着种子成熟, 荚果果皮
逐渐失水木质化, 根瘤菌数量降低而杂菌数量增
大。结荚期荚果皮内的平均根瘤菌数量分别为蕾
期、盛花期和种子成熟期的 419.25 倍、87.63 倍
和 4.03 倍, 差异均达极显著水平(P<0.01); 胚珠
(种子)发育过程中根瘤菌数量的变化趋势与子房
壁相似, 但胚珠在未受精前不含任何菌类, 受精
后胚珠内生根瘤菌从无到有, 至结荚期根瘤菌数
量接近最大值并趋于稳定, 平均根瘤菌数量为胚
珠初受精(盛花期)的 26.84倍, 种子成熟期根瘤菌
数量与结荚期差异不显著(图 2)。
2.5 种子收获后各部位内生根瘤菌数量
两苜蓿品种收获 120 d 的种子中, 根瘤菌主要
分布于种皮, 其平均数量约为种胚和子叶的 359.84
倍和 515.22 倍。种子浸泡液内亦含有大量根瘤菌,
其数量与种皮接近。将干燥种子剖开并去除种胚后
浸泡种皮, 发现种皮浸出液的根瘤菌数量与种子浸
泡液的根瘤菌数量处于同一数量级, 而高于胚轴及
子叶根瘤菌数量 102~103倍, 这说明种子浸泡液中的
根瘤菌绝大多数来自于种皮(图 3)。
综合以上结果可以看出, 种子中的内生根瘤菌
主要来自种皮, 数量高于 3.54×102 cfu·10grains−1
(“游客”)和 5.85×104 cfu·10grains−1 (“陇东”)。经计
算, 与刚收获的种子相比, “陇东”苜蓿的种子室温
下放置 120 d后根瘤菌数量增加 131.46倍, 而“游客”
的种子则增加 11.76 倍。这说明种子在荚果成熟后
的一段时期内生根瘤菌数量仍在快速增加, 故初收
获的种子内尤其是种皮内的环境适宜于根瘤菌的存
活和繁殖。

图 2 荚果及种子在发育过程中的根瘤菌数量
Fig. 2 Endogenous rhizobia amount in pods and seeds
during seeding process of alfalfa


图 3 收获后常温储存 120 d 后苜蓿种子浸泡液及
种子各部位的根瘤菌数量
Fig. 3 Endogenous rhizobia amount in every part and
soaking liquid of alfalfa seeds stored for 120 d after harvest
under normal temperature

3 结论和讨论
两个品种苜蓿植株内根瘤菌的分布和数量在
空间和时间上都具有很大的异质性。在空间上 ,
植株内绝大部分的内生根瘤菌分布于根系, 仅不
足 10%的根瘤菌分布于植株地上部分。根系中根
瘤菌主要分布于毛根, 侧根和主根内的根瘤菌数
量不足 0.92%。而在主根内主要存在于表皮和皮
层, 中柱内的菌数量较少。植株地上部分的内生
根瘤菌则主要在营养期末分布于花芽, 在蕾期和
花期分布于雌蕊子房的子房壁, 在结荚期分布于
荚果果皮, 在种子成熟期则主要存在于新生的种
子中。茎内的根瘤菌数目极少 , 不足 2 × 1 0 2
cfu·g−1(FW), 甚至在蕾期和花期绝迹。空间分布
上的异质性首先说明内生根瘤菌对于植株各部位
组织环境内的偏好程度并不相同, 营养丰富的部
第 6期 李剑峰等: 苜蓿内生根瘤菌分布部位与数量变化动态 1205


位相对数量较高, 如子房、种子和根部, 而在光合
产物的生产和运输部位, 如茎和叶则很少或没有
分布 , 这一结果与龙良鲲等 [15]的研究结果一致 ,
即内生菌虽能在植物体内转移, 但对某些特定部
位有其偏好。袁保红等[11]的研究结果证明, 植物
不同部位的微环境如通气状况、生物酶和其他化
学成分使不同的内生菌在植物不同器官和组织中
褆占据不同的生态位。许 森[17]也提出, 植物组织
中可利用碳源的多少直接限制了内生固氮菌固氮
酶基因的表达。结合以上观点推断, 内生根瘤菌
随植株源−库的运输方向而逐渐增大的趋势也许
与根瘤菌作为异养生物, 需要耗费宿主植物大量
营养的特性相关联。但同一植株内并非只有一种
根瘤菌, 要明确植株内某一特定菌株的分布和数
量变化规律, 则需要进一步利用标记菌株进行示
踪试验。
在时间上, 结荚期的根、荚果皮内根瘤菌数量
明显高于其他时期, 花内各器官(不包括花梗)授
粉后根瘤菌数量迅速增加。在子房向荚果发育的
过程中, 子房壁和胚珠内的根瘤菌数量随时间呈
对数增长, 幼嫩种子内生根瘤菌数量远高于受精
胚珠。这些结果与 Coombs 和 Franco 的研究结果
一致[18], 即在小麦种子的胚芽和胚乳中能找到在
母体植株中内生定殖的标记菌, 证明内生菌能被
转运并定殖在发育早期的种子中。两个苜蓿品种
成熟的种子在收获 120 d 后, 根瘤菌数量比刚收
获时分别增高 131.46 倍(“陇东”)和 11.76 倍(“游
客”)。说明根瘤菌进入种子后, 仍有一个继续繁殖
增长的过程, 这一过程可能会有正负两方面的效
应, 首先根瘤菌的繁殖需要消耗大量的营养和能
量, 对于种子的储藏年限和生活力不利; 另一方
面, 种子在陌生环境萌发后, 种子内生根瘤菌的
大量存在为种子−根瘤菌这一共生体系的继续存
在提供了物质基础, 对次代植株的生长和发育有
积极意义 , 这也是根瘤菌−植株这一共生体系长
期进化的结果。祁娟[19]的研究结果表明, 同一苜
蓿品种种子贮藏 5 年之内, 种子内生根瘤菌的数
量随着贮藏年限的增长而增加, 5年以后则随着贮
藏年限的延长数量逐渐减少。
次代种子和植株内生根瘤菌的最终来源目前
还不明确, 是由根际侵入根系后再转运至种子的
土壤根瘤菌, 还是上代或是多代前种子中存在的
内生根瘤菌, 或二者兼有？这一问题目前尚无确
定结论的相关报道, 亟需深入的研究探讨, 这对
于根瘤菌−寄主植物固氮共生体系的进化研究和
根瘤菌接种的应用实践将会有深远的意义。

致谢 本研究得到甘肃农业大学草业学院姚拓教
授、柳小妮教授和刘建荣老师的指导帮助, 在此表
示衷心的感谢！
参考文献
[1] 文才艺 , 吴元华 , 田秀玲 . 植物内生菌研究进展及其存在
的问题[J]. 生态学杂志, 2004, 23(2): 86−91
[2] 黄瑞虎 , 刘会强 , 迪丽拜尔·托乎提 . 植物内生菌及其宿主
植物研究概况[J]. 新疆师范大学学报: 自然科学版 , 2008,
27(1): 77−79
[3] Stamford T., Stamford N. P., Coelho L. C., et al. Production
and characterization of a thermostable glucoamylase from
Streptosporangium sp. endophyte of maize leaves[J]. Biore-
search Technology, 2002, 83 (2): 105−109
[4] 杨海莲, 王云山. 水稻内生阴沟肠杆菌 MR12 的鉴定及其
固氮和防病作用研究[J]. 植物病理学报, 2001, 31(1): 92−93
[5] Baldani J., Olivares F. Nitrogen-fixing entophytes: Recent
advances in the association with graminaceous plants grown
in the tropics [M]. Netherlands: Kluwer Academic Publishers,
1997: 203−206
[6] 邹文欣 , 谭仁祥 . 植物内生菌研究新近展 [J]. 植物学报 ,
2001, 43(9): 881−892
[7] 崔林, 孙振, 孙福在, 等. 马铃薯内生细菌的分离及环腐病
拮抗菌的筛选鉴定[J]. 植物病理学报, 2003, 33(4): 353−358
[8] 祁娟 , 师尚礼 . 不同品种紫花苜蓿种子内生根瘤菌溶磷和
分泌生长素能力[J]. 草原与草坪, 2006 (5): 18−20
[9] 王瑶瑶 , 韩烈保 , 曾会明 . 禾本科植物内生菌研究进展[J].
生物技术通报, 2008 (3): 34−38
[10] 陈宝书 . 牧草饲料作物栽培学[J]. 北京: 中国农业出版社 ,
2001: 182−184
[11] 袁保红 , 杜青平 , 邓祖军 . 小连翘内生真菌种群分布及其
抗菌性研究[J]. 广东药学院校报, 2007, 23(3): 307−311
[12] 黄宝灵, 吕成群, 唐东阶, 等. 罗汉松根瘤内生细菌的分离
和特性[J] . 微生物学报, 2002, 42(5): 620−623
[13] 林稚兰 , 黄秀梨 . 现代微生物学与实验技术[M]. 北京: 科
学出版社, 2000: 151−153
[14] 刘成运, 李广彦. 百合组织中细胞内生菌的分布与传播[J].
武汉植物学研究, 1989, 7(2): 101−105
[15] 龙良鲲, 肖崇刚. 内生细菌 01-144 在番茄根茎内定殖的初
步研究[J]. 微生物学通报, 2003, 30(5): 53−56
[16] 卢镇岳, 杨新芳, 冯永君. 植物内生细菌的分离、分类、定
殖与应用[J]. 生命科学, 2006, 18(1): 91−94
[17] 褆许 森 . 内生固氮菌研究进展 [J]. 安徽农业科学 , 2008,
36(12): 4828−483
[18] Coombs J. T., Franco C. M. Visualization of an entophytic
Streptomycin species in wheat seed[J]. Appall. Environ. Mi-
crobial., 2003, 69(7): 4260−4262
[19] 祁娟. 苜蓿种子内生根瘤菌筛选及其促生能力研究[D]. 甘
肃农业大学, 2006: 23−25
[ 2 0 ]