全 文 ：中国生态农业学报 2011年 3月 第 19卷 第 2期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, February 2011, 19(2): 394398

* 国家自然科学基金重点项目(30630054)资助
** 通讯作者: 薛泉宏(1957~), 男, 教授, 主要从事微生物生态与资源利用研究。E-mail: xuequanhong@nwsuaf.edu.cn
赵娟(1985~), 女, 博士研究生, 主要从事微生物资源利用研究。E-mail: zhaojuan850309@yahoo.com.cn
收稿日期: 2010-05-20 接受日期: 2010-08-27
DOI: 10.3724/SP.J.1011.2011.00394
多功能放线菌 Act12对土传病原真菌的
拮抗性及其鉴定*
赵 娟 1 薛泉宏 2** 王玲娜 1 段春梅 2 薛 磊 1 毛 宁 2
(1. 西北农林科技大学生命科学学院 杨凌 712100; 2. 西北农林科技大学资源环境学院 杨凌 712100)
摘 要 采用琼脂块法及抑菌试验, 研究了多功能放线菌 Act12对 6种常见土传病原真菌的拮抗作用; 采用形
态特征、生理生化特性及 16 S rDNA 序列分析, 确定了 Act12 的分类地位。结果表明, Act12 对 6 种供试土传
病原真菌具有不同程度的拮抗作用 , 其中 , 对木贼镰刀菌 (Fusarium equiseti)和尖孢镰刀菌西瓜专化型 (F.
oxysporum f. sp. niveum)的拮抗圈直径分别达到 20.5 mm 和 18.4 mm; 培养 48 h, Act12 无菌发酵滤液对木贼镰
刀菌的抑菌率达到 83.2 %。菌株显微形态、培养特征、生理生化特性及 16 S rDNA 序列分析结果表明, 多功
能放线菌 Act12 为链霉菌属的密旋链霉菌(Streptomyces pactum)。
关键词 放线菌 连作障碍 密旋链霉菌 拮抗性 微生物修复 抑菌试验
中图分类号: S476+1; Q939.13+2 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2011)02-0394-05
Antagonistic effect of multifunctional actinomycete strain Act12 on
soil-borne pathogenic fungi and its identification
ZHAO Juan1, XUE Quan-Hong2, WANG Ling-Na1, DUAN Chun-Mei2, XUE Lei1, MAO Ning2
(1. College of Life Science, Northwest A & F University, Yangling 712100, China; 2. College of Resources and Environment,
Northwest A & F University, Yangling 712100, China)
Abstract Antagonistic effects of multifunctional actinomycete strain Act12 on six soil-borne pathogenic fungi were determined
using agar block method and inhibitory test. The strain Act12 was identified by analyses on its morphological character, physiological
and biochemical characteristics, as well as 16 S rDNA sequence. The results showed varying degrees of Act12 antagonism against all
tested six soil-borne pathogenic fungi. The widths of inhibitory zones against Fusarium equiseti and F. oxysporum f. sp. niveum were
20.5 mm and 18.4 mm, respectively. The rate of bacteriostasis of Act12 axenic fermentation filtrate against F. equiseti after 48 h
cultivation was 83.2%. Based on micro-morphology, and cultural, physiological and biochemical characteristics, as well as 16 S
rDNA sequence analysis, Act12 strain was identified as Streptomyces pactum.
Key words Actinomycete, Continuous cropping obstacle, Streptomyces pactum, Antagonism, Microorganism restoration,
Inhibitory test
(Received May 20, 2010; accepted Aug. 27, 2010)
近年来连作障碍已成为影响设施园艺及专业化
种植产业发展的限制性因素。引起连作障碍的主要原
因有土传病害、自毒作用及土壤理化性质劣变等[1]。
研究表明, 有益微生物能够抑制土传病原菌的生长
繁殖[2], 调节植物根际微生态平衡[3], 产生激素促进植
物生长[4], 降解或转化植物根系分泌的自毒物质[5]。
但同时兼备上述多种功能的微生物很少。筛选多功
能微生物是研制连作障碍修复菌剂、克服连作障碍
亟待解决的热点问题。放线菌具有孢子抗逆性强、
可产多种抗生素、菌剂保藏时间长及诱导寄主植物
产生系统抗性等优点[6]。放线菌制剂在土传病害生
物防治、自毒物质微生物降解方面具有良好的发展
前景, 因此筛选多功能放线菌对连作障碍微生物修
复菌剂开发具有重要意义。
西北农林科技大学微生物资源研究室在生防菌
筛选过程中获得 1株多功能放线菌 Act12。该菌株对
第 2期 赵 娟等: 多功能放线菌 Act12对土传病原真菌的拮抗性及其鉴定 395


草莓疫霉 (Phytophthora fragariae)具有明显抑制作
用[7], 对草莓[7]、甜瓜[8]等园艺作物表现出良好的促
生效果, 且具有调整草莓根区土壤微生态的作用[9], 同
时能降解苯甲酸和对羟基苯甲酸等常见自毒物质[10],
可作为草莓等作物连作障碍微生物修复的有效菌
株。本文通过显微形态、培养特征、生理生化特性
及 16 S rDNA序列分析确定了放线菌 Act12的分类
地位, 研究了Act12对 6种镰刀菌属土传病原真菌的
抑制作用, 其结果将为该放线菌对连作障碍修复机
理揭示与应用技术研究提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌株
放线菌 Act12 是西北农林科技大学微生物资源
研究室从分离自青藏高原、黄土高原土壤的万余株
放线菌中筛选到的 1株多功能菌株。
供试土传病原真菌有木贼镰刀菌 (Fusarium
equiseti)、芬芳镰刀菌(F. redolens)、接骨木镰刀菌(F.
sambucinum)、尖孢镰刀菌棉花专化型(F. oxysporum f.
sp. vasinfectum)、 尖 孢镰 刀 菌 西 瓜 专 化 型 (F.
oxysporum f. sp. niveum)、尖孢镰刀菌黄瓜专化型(F.
oxysporium f. sp. cucumerinum), 均为西北农林科技
大学微生物资源研究室保存的菌株。
1.1.2 主要试剂
溶菌酶、蛋白酶 K等购自上海生工生物工程技
术服务有限公司, PCR试剂及 DNA Marker (DL 2000)
购自宝生物工程(大连)有限公司, 其余试剂为国产
分析纯试剂。
1.1.3 培养基
放线菌 Act12活化、保藏采用高氏 1号培养基[11],
Act12 无菌发酵滤液制备采用液体高氏 1 号培养基;
病原真菌保藏、培养采用 PDA 培养基[11]; Act12 培
养特征观察采用高氏 1号培养基、PDA培养基、察
氏培养基[11]、酵母膏麦芽糖琼脂培养基(ISP2)、燕麦
粉琼脂培养基 (ISP3)、无机盐淀粉琼脂培养基
(ISP4)、甘油天门冬素琼脂培养基(ISP5)及葡萄糖天
门冬素琼脂培养基[12]。
1.2 试验方法
1.2.1 放线菌 Act12 对土传病原真菌的皿内拮抗
作用
用 3 mL 无菌水洗下斜面上培养好的病原真菌,
制成菌悬液, 移液器吸取 100 μL 该悬液均匀涂布
于 PDA 平板上; 用直径 7 mm 打孔器切取生长 8 d
的 Act12 平皿培养物, 制成放线菌琼脂块, 并将其
置于 PDA平板上, 每皿 4块。28 ℃培养 3 d, 十字
交叉法测量拮抗圈直径, 观察拮抗圈透明度。
1.2.2 放线菌 Act12 无菌发酵滤液对土传病原真菌
的抑菌率
无菌发酵滤液按赵娟等[13]方法制备。将放线菌
Act12 无菌发酵滤液与冷却至 50 ℃左右的 PDA 培
养基按 1︰5(V︰V)混匀倒平板, 用直径 7 mm 打孔
器分别切取生长好的病原真菌平皿培养物, 制成病
原真菌琼脂块, 置于 PDA平板中央。无菌水代替无
菌发酵滤液与 PDA混匀倒平板作对照。每个处理设
3个重复, 28 ℃培养, 分别于 48 h、72 h、96 h时, 用
十字交叉法测量病原真菌菌落直径(mm), 取平均值,
并计算相应抑菌率(%):
 
  100%7
 
对照菌落直径 处理菌落直径抑菌率= 对照菌落直径

1.2.3 放线菌 Act12显微形态和培养特征观察
采用埋片法在 40 倍镜下观察放线菌 Act12 气
丝、基内菌丝及孢子丝等显微形态。分别在高氏 1
号、PDA、察氏培养基、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5
及葡萄糖天门冬素琼脂培养基平板上接种放线菌
Act12, 28 ℃培养 8 d, 观察并记录放线菌 Act12菌
落形态, 气生菌丝、基内菌丝颜色及是否产可溶性
色素。
1.2.4 放线菌 Act12生理生化特性试验
碳源利用、明胶液化、牛奶胨化、硝酸盐还原
及 H2S、黑色素产生等生理生化特性均按照徐丽华
等[14]方法进行。
1.2.5 放线菌 Act12的 16 S rDNA序列分析
酶解法[14]提取放线菌 Act12总 DNA, 采用细菌
16 S rDNA 通用引物(PA: 5-AGA GTT TGA TCC
TGG CTC AG-3; PB: 5 -AAG GAG GTG ATC CAG
CCG CA-3)进行 PCR扩增, 得到长度为 1 400~1 500
bp的片段。扩增产物送南京金思特生物科技有限公
司测序。将所获得序列校对后, 采用 BLAST方法从
GenBank数据库中调取相关序列, CLUSTALX 2.0软
件进行同源性分析, Mega 4.0 软件中的 Neighbor-
Joining方法构建系统进化树。
2 结果与分析
2.1 放线菌 Act12对土传病原真菌的皿内拮抗作用
从表 1可以看出, Act12对 6种供试土传病原真
菌具有不同程度的拮抗作用, 对其中 3 种镰刀菌拮
抗圈完全透明。Act12对引起作物常见土传病害的木
贼镰刀菌及尖孢镰刀菌西瓜专化型的拮抗圈直径分
别高达 20.5 mm和 18.4 mm, 拮抗圈完全透明。
2.2 放线菌 Act12无菌发酵滤液对土传病原真菌的
抑菌作用
从表 2可以看出, Act12无菌发酵滤液对 6种供
试土传病原真菌均具有明显的抑菌作用, 在 48 h时,
396 中国生态农业学报 2011 第 19卷


表 1 放线菌 Act12 对 6 种土传病原真菌的皿内拮抗圈直径
Tab. 1 Diameters of the inhibitory zones of actinomycete strain Act12 against six soil-borne pathogenic fungi in petri dish
土传病原真菌
Soil-borne
pathogenic fungi
拮抗圈直径
Inhibitory zone
diameter (mm)
透明度
Transparency
土传病原真菌
Soil-borne pathogenic fungi
拮抗圈直径
Inhibitory zone
diameter (mm)
透明度
Transparency
木贼镰刀菌 F. equiseti 20.5 +++ 芬芳镰刀菌 F. redolens 11.0 ++
接骨木镰刀菌
F. sambucinum
14.5 +++ 尖孢镰刀菌棉花专化型
F. oxysporum f. sp. vasinfectum
11.0 ++
尖孢镰刀菌西瓜专化型
F. oxysporum f. sp.
niveum
18.4 +++ 尖孢镰刀菌黄瓜专化型
F. oxysporum f. sp. cucumerinum
13.0 ++
+++、++分别代表拮抗圈完全透明、比较透明。+++, ++ represent high transparency and semi transparency of inhibitory zone, respectively.

表 2 放线菌 Act12 无菌发酵滤液对 6 种土传病原真菌的抑菌率
Tab. 2 Inhibitory rates of axenic fermentation filtrate of actinomycete strain Act12 against six pathogenic fungi %
抑菌率 Inhibitory rate 抑菌率 Inhibitory rate 土传病原真菌
Soil-borne pathogenic fungi 48 h 72 h 96 h
土传病原真菌
Soil-borne pathogenic fungi 48 h 72 h 96 h
木贼镰刀菌 F. equiseti 83.2±1.0 75.7±1.0 68.9±0.5 芬芳镰刀菌 F. redolens 54.6±1.1 53.2±0.3 49.8±0.9
接骨木镰刀菌
F. sambucinum
27.0±1.2 49.2±0.9 50.0±1.3 尖孢镰刀菌棉花专化型
F. oxysporum f. sp. vasinfectum
56.4±0.7 54.4±0.8 47.8±1.2
尖孢镰刀菌西瓜专化型
F. oxysporum f. sp. niveum
44.0±0.6 43.4±0.8 35.4±1.1 尖孢镰刀菌黄瓜专化型
F. oxysporum f. sp. cucumerinum
58.0±1.0 37.4±1.3 32.4±0.7

对木贼镰刀菌的抑菌率达到 83.2%; Act12 对接骨木
镰刀菌的抑菌率随病原真菌培养时间延长明显增加,
对木贼镰刀菌、 黄瓜枯萎菌和西瓜枯萎菌的抑菌率
随培养时间延长呈递减趋势, 对其他 2 种病原真菌
的抑菌率随培养时间延长变化不大。
2.3 放线菌 Act12的鉴定
2.3.1 放线菌 Act12显微形态和培养特征
多功能放线菌 Act12 具有典型的链霉菌属特征,
气丝淡灰白色, 基内菌丝暗黄色, 产暗黄色色素, 见
图 1a 所示。40 倍镜下可见孢子丝紧密螺旋形, 见图
1b所示。放线菌 Act12在不同培养基上 28 ℃培养 8
d 后, 均生长良好, 气丝白色至灰色, 基内菌丝浅黄
色至暗黄色, 在高氏 1号、PDA、ISP5及葡萄糖天门
冬素琼脂培养基上产可溶性色素, 如表 3所示。
2.3.2 放线菌 Act12生理生化特性
放线菌 Act12能利用 D-葡萄糖、D-半乳糖、麦
芽糖、糊精、甘油、可溶淀粉及纤维二糖; 在 D-木
糖、L-鼠李糖、D-甘露醇、蔗糖、乳糖、棉子糖、
山梨醇及肌醇上生长差; 能使明胶液化、牛奶胨化、
硝酸盐还原, 不产生 H2S 和黑色素; 在 18 ℃生长,
55 ℃不生长, 最适生长温度 28~37 ℃。Act12的碳
源利用及生理生化等 20 项特征与密旋链霉菌(S.
pactum)完全吻合[15]。
2.3.3 放线菌 Act12的 16 S rDNA序列分析
测序结果表明(图 2), 放线菌 Act12 的 16 S
rDNA序列全长 1 491 bp。采用 Blast软件在 GenBank
数据库中进行序列相似性搜索, 调取与 Act12 相似
性较高的 15 株链霉菌属相关典型菌株 , 用
CLUSTALX 2.0 软件进行序列相似性分析, Neighbor-
Joining 法构建系统进化树。从图 2 可以看出, 放线
菌 Act12与密旋链霉菌(Streptomyces pactum)和橄榄
链霉菌(Streptomyces olivaceus)在同一系统进化分支
上, Act12与密旋链霉菌的相似度为 99.32%, 与橄榄
链霉菌的相似度为 99.31%。
密旋链霉菌模式菌株孢子丝紧密螺旋, 在 D-木
糖、L-鼠李糖、D-甘露醇及乳糖上生长差, 与 Act12


图 1 放线菌 Act12 的平皿菌落(a)和菌丝(b)特征
Fig. 1 Characteristics of colony (a) and mycelium (b) of actinomycete strain Act12
a b
第 2期 赵 娟等: 多功能放线菌 Act12对土传病原真菌的拮抗性及其鉴定 397


表 3 放线菌 Act12 在不同培养基上的培养特征
Tab. 3 Cultural characteristics of actinomycete strain Act12 on different culture medium
培养特征 Cultural characteristics 培养基
Culture medium
生长情况
Growth situation 气生菌丝
Aerial mycelium
基内菌丝
Substrate mycelium
可溶性色素
Soluble pigment
高氏 1号培养基
Gause 1 medium
生长良好、菌落凹陷
Well growth, colony concave
淡灰色、灰色
Light gray, gray
黄褐色
Yellowish-brown
暗黄色
Dark yellow
马铃薯琼脂培养基
PDA medium
生长良好、菌落凸起
Well growth, colony convex
白色、灰色
White, gray
亮黄色
Bright yellow
黄色
Yellow
察氏培养基
Czapek’s medium
生长良好、菌落平整
Well growth, colony smooth
淡灰色
Light gray
浅褐色
Light brown
无
Not observed
ISP2培养基
ISP2 medium
生长良好
Well growth
淡灰色、灰色
Light gray, gray
暗黄色
Dark yellow
无
Not observed
ISP3培养基
ISP3 medium
生长良好、菌落凹陷
Well growth, colony concave
淡蓝色
Light blue
棕褐色
Tan
无
Not observed
ISP4培养基
ISP4 medium
生长良好
Well growth
淡灰色、灰色
Light gray, gray
浅黄色
Pale yellow
无
Not observed
ISP5培养基
ISP5 medium
生长良好
Well growth
白色
White
淡黄色
Light yellow
淡黄色
Light yellow
葡萄糖天门冬素琼脂培养基
Glucose-asparagine agar medium
生长良好、菌落平整
Well growth, colony smooth
灰色
Gray
淡黄褐色
Light yellow brown
淡黄色
Light yellow


图 2 基于 16S rDNA 的菌株 Act12 和链霉菌属相关菌株的系统发育树
Fig. 2 Phylogenetic tree of actinomycete strain Act12 and other related Streptomyces strains based on 16 S rDNA

的形态、碳源利用及其他生理生化特征吻合; 橄榄
链霉菌孢子丝直、柔曲, 能利用 D-木糖、L-鼠李糖、
D-甘露醇及乳糖, 与 Act12 存在差异。综合 16 S
rDNA 序列分析结果及形态与生理生化特征等, 将
菌株 Act12鉴定为密旋链霉菌。
3 结论与讨论
显微形态、培养特征、生理生化特性及 16 S
rDNA序列分析结果表明, 多功能放线菌 Act12为链
霉菌属的密旋链霉菌(Streptomyces pactum); 该菌株
对本试验中所选用的 6 种镰刀菌属靶标病原真菌表
现出较强的拮抗作用。
目前 , 国内外对密旋链霉菌进行了一定的研
究[1618]。Böckle 等[16]研究表明, 密旋链霉菌能够合
成丝氨酸蛋白酶, 该酶对底物表现出高度的立体选
择性和二级结构专一性。Muñoz-Bellido等[17]从密旋
链霉菌中分离到抗生素耐药基因 pct, 该基因具有编
码 16S rRNA甲基化酶的功能。Bhuyan等[18]研究表
明, 密旋链霉菌能在生长后期自溶阶段产生一种新
型抗癌活性物质密旋霉素(Pactamycin)。
本实验室研究发现, 放线菌 Act12 固态发酵形
成的粉状活菌制剂施入植物根区后表现出明显的促
生和诱导抗性 [79]作用 , 推测该菌株可在代谢过程
中产生植物生长激素。毛宁等[10]研究表明, 模拟田
间条件, 培养 150 d后, Act12对土壤中引起草莓自
毒作用的草莓根泌苯甲酸、对羟基苯甲酸的降解量
分别达到 747~867 mg·kg1、117~118 mg·kg1。本
研究结果表明, 放线菌 Act12 在皿内对棉花及瓜类
枯萎病等几种镰刀菌属土传病原真菌具有较强拮抗
作用, 该菌株在大田条件下对这些作物的防病促生
398 中国生态农业学报 2011 第 19卷


作用及对连作障碍的实际修复效果还需深入研究。
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