全 文 ： * ?“十五”江苏省科技攻关项目 ( BE2001041)资助
** ?通讯作者
收稿日期 : 2004-11-10 改回日期 : 2004-12-22
钝齿棒杆菌精氨酸生物合成相关
基因簇 argCJ BDF R 的扩增及序列分析 *
陈雪岚 许正宏 陶文沂 ** 王正祥
(江南大学教育部工业生物技术重点实验室 无锡 214036) (江南大学工业微生物研究中心 无锡 214036)
摘 要 采用 PCR 方法扩增钝齿棒杆菌精氨酸生物合成基因簇 argCJ BDFR , 其序列长为 6080bp, 其中含有 argJ、
argB、argD、argF 和 argR 5个完整的开放阅读框。序列和结构分析表明这 5个结构基因编码的氨基酸序列与谷氨
酸棒杆菌的相应基因编码的氨基酸高度同源 ,同源性分别为 92%、95%、96%、97 .5%和 100%。
关键词 钝齿棒杆菌 精氨酸 基因簇 序列分析
Cloning and sequencing of the tandem arginine biosynthetic genes argCJ BDF R from Corynebacterium crenatum A .S1 .
542 . CHEN Xue-Lan, XU Zheng-Hong, TAO Wen-Yi( Key Laboratory of Industry Biotechnology, Ministry of Education,
Southern Yangtze University, Wuxi 214036, China) , WANG Zheng-Xiang( TheResearch Center of Industry Microbiology,
Southern Y angtze University, Wuxi 214036, China) , CJEA ,2006,14( 2) : 32～36
Abstract The tandem arginine biosynthetic genes argCJBDFR from Corynebacteriumcrenatum wereamplified by PCR .
Sequence analysis indicates that there are fiveopen reading frames, including argJ , argB , argD, argF and argR in the
6080bp stretch . Theamino acid sequencescoded by argJBDFR genesshow 92% , 95% , 96% , 97 .5% and 100% identi-
ty to those of Corynebacteriumglutacimum, respectively .
Key words Corynebacterium crenatum, Aginine, Tandem genes, Sequenceanalysis
( Received Nov .10,2004;revised Dec .22,2004)
精氨酸是生物体尿素循环的一种重要中间代谢产物 , 具有多种独特的生理和药理作用。正常情况下机
体能自身合成 L-Arg,但在饥饿、损伤、疾病、应急状态及生长阶段机体对 L-Arg的需求超过了自身合成能
力 ,因此及时补充外源性 L-Arg有利于提高机体免疫能力。此外研究发现 L-Arg对氨中毒性肝昏迷及病毒
性肝炎有显著疗效 , 对于恶性肿瘤、脂肪肝、外科创伤和男性无精症等有明显抑制、减轻或治疗作用 ; 随着
L-Arg-NO途径在临床上研究的不断深入 , 发现 L-Arg还具有抗动脉粥样硬化、防治高血压及心力衰竭等作
用[ 1～3] 。精氨酸在医药、食品、饲料及化妆品行业有着越来越广泛的应用 , 但精氨酸生产量远不能满足市场
需求 ,我国目前主要依赖于进口。
在原核微生物中 , L-Arg的合成是从谷氨酸开始 , 经历了 8种酶催化而成。根据脱乙酰基团方式的不
同 , L-Arg的代谢途径分为两种 :一种称之为线形途径 , 即乙酰鸟氨酸在由 argE 基因编码的乙酰鸟氨酸酶水
解作用下形成精氨酸前体物———鸟氨酸[ 4 ,5] ;另一种称之为循环途径 , 即乙酰鸟氨酸在由 argJ 基因编码的
鸟氨酸乙酰转移酶的作用下形成鸟氨酸的同时 , 乙酰基团被转移至谷氨酸形成乙酰谷氨酸 , 此途径中鸟氨
酸乙酰转移酶具有乙酰鸟氨酸酶和乙酰谷氨酸合成酶二重功能 , 故此途径又称为经济循环途径 [ 4 , 6～ 8] 。目
前国内外多采用以循环途径合成精氨酸的棒杆菌属菌作为生产菌株。棒杆菌生物合成精氨酸途径中受精
氨酸反馈抑制的关键酶为 argB基因编码的乙酰谷氨酸激酶 , 此酶不仅被 Arg反馈抑制亦被其反馈阻遏 ; 同
时与 argB 基因串联的 argJ 基因编码的乙酰鸟氨酸转移酶决定精氨酸的代谢途径 , argR 基因编码精氨酸阻
遏蛋白 ,对精氨酸的生物合成起调控作用。
钝齿棒杆菌 A .S1 .542 ( Corynebacterium crenatum)是我国研究者分离得到的一种钝齿状、无芽孢的革
兰氏阳性菌 ,其突变株在国内氨基酸生产中被广泛应用 , 但对其精氨酸代谢途径的特异性研究尚未见相关报
第 14 ?卷第 2期 中 国 生 态 农 业 学 报 Vol .14 No .2
2 0 0 6 ?年 4 月 Chinese Journal of Eco-Agriculture April, 2006
道。本实验扩增了钝齿棒杆菌 A .S1 .542中精氨酸生物合成途径中串联基因 , 为从分子水平改造钝齿棒杆
菌 A .S1 .542、提高精氨酸产量以达到工业化大规模生产奠定基础。
1 实验材料与方法
供试试剂 Tap DNA 聚合酶购自上海生物工程技术服务公司 , 溶菌酶购自 Sigma公司 , 蛋白酶 K 购自大
连宝生生物有限公司 , WizardTM PlusMinipreps DNA purification Systems购自 Promega公司 ,引物由北京三
博远志生物公司合成。实验用菌株为“ C . crenatum A .S1 .542”,购自中国科学院微生物菌种保藏中心。实
验将 C . crenatum接种至牛肉汁液体培养基中 , 30℃、150r/ min恒温培养 48h。采用溶菌酶和蛋白酶 K 结
合方法提取其基因组 DNA。根据序列同源性 , 参考已报道的 Corynebacterium glutamicumATCC 13032[ 6] 、
Corynebacterium diphtheriae gravis NCTC13129[ 9] 、Corynebacteriumefficiens YS-314[10] 和 Mycobacteriumtuber-
culosis CDC1551[ 11] 生物合成精氨酸串联
基因 argCJBDFR 的高度保守序列 , 设计
了 4对特异引物 ,具体见表 1。PCR 反应
体系为 10× Taq Buffer ( 2 .5μL ) , dNTP
(10mmol/ L , 0 .5μL ) , Mg2 + (25mmol/ L ,
2μL) , 上游引物 ( 10μmol/ L , 1μL ) , 下游
引物 ( 10μmol/ L , 1μL ) , 模板 DNA ( 1μL ,
约 10ng) , 双 蒸 水 ( 16 . 5μL ) , Taq 酶
(1U/ μL ,1μL)。根据各对引物的 Tm 值 , 通
过温度梯度 PCR 确定最佳退火温度。扩
增 argCJ 片 段 PCR 程 序 为 95℃ 3min ;
表 1 引物名称及其序列
Tab.1 Primer names and their sequence
引物名称
Primer names
引物序列
Primer sequence
T m
Sense- argC ( 1 ?) 5‘ T CAAGGTTGCAAT CGCAGGAGCCA 3’ 72 x℃
Antisense- argJ ( 2 ?) 5‘ GCAACTCACCAATAAGACCAGTGGA 3’ 72 x℃
Sense- argJ ( 3 ?) 5‘CCGCAGCGGCCGTGTT TACACG 3’ 70 x℃
Antisense- argJ D ( 4 ?) 5‘ GACAAGAT TGTTGTCGTGAAATA TC 3’ 64 x℃
Sense- argD ( 5 ?) 5‘ AT CT TTGGAAT CA TGCCGGAA TC 3’ 70 x℃
Antisense- argDF ( 6 ?) 5‘ T CT TCGT CGGTGAT CACCAGCGG 3’ 74 x℃
Sense- argF ( 7 ?) 5‘CATGCCAGAT TCTGGCTGATCTGCAG 3’ 80 x℃
Antisense- argR ( 8 ?) 5‘ GCAAGAACGATGCGGTTAGTCATG 3’ 72 x℃
95℃ 1min,58℃ 0 .5min,72℃ 2min,30个循环; 72℃10min。扩增 argJBD 片段 PCR 程序为 95℃3min;95℃1min,
图 1 各对引物 PCR 扩增串联基因结果 *
Fig .1 The result of tandem argininebiosyn-
thetic genes amplified by PCR
* 泳道 1为 DL2000Marker, 泳道 2、3、4和 5分
别为 argCJ、argJBD、argDF 和 argFR。
55℃0 .5min,72℃2min, 30 个循环 ; 72℃ 10min。扩增 argDF 片段
PCR程序为 95℃ 3min; 95℃1min, 52℃0 .5min, 72℃2min, 30 个循
环 ;72℃10min。扩增 argFR片段 PCR 程序为 95℃3min;95℃1min,
58℃0 .5min, 72℃ 1 .5min, 30 个 循 环; 72℃ 10min。扩 增 产 物 在
10g/ kg的琼脂糖凝胶电泳中检测。PCR 产物的纯化按照回收试剂
盒说明书操作。由上海生物工程技术服务公司完成4段 PCR 扩增产物
的测序工作。这4段序列均有部分重叠 ,测序结果采用 DANStar软件进
行拼接。采用 DNAman4 .0分析 DNA及其推测蛋白质序列。
2 结果与分析
2 . 1 各对引物 PCR 扩增
利用特异性引物 ,以 C . crenatum基因组 DNA 为模板 , 采用
DNA 聚合酶进行 PCR 扩增其结果见图 1。测序完成后拼接获得
全序列 , 在 GenBank中通过 Blast查询确认该片段为精氨酸生物合
成的串联序列 argCJ BDFR,其总长度为 6080bp。将获得的基因在
GenBank 登录 ,登录号为 AY509864。
图 2 长 6 .08kb 的钝齿棒杆菌 A .S1 .542 基因顺序及其限制性酶切图谱 *
Fig .2 Genetic and restriction maps of the 6 .08kb stretch of C . crenatumA .S1 .542 DNA
* 箭头指示 ORFs的方向 ,序号为各引物。
2 . 2 序列分析
长为 6. 08kb的序列包括 argJ、argB、argD、argF 和 argR 5个完整的开放阅读框 (ORF ) , argC 获得部
分 ORF。这 6
个 ORFs 的顺
序、方 向 及 4
对引物位置见
图2。序列分析
显 示在 argJ 、
argB 、argD 、
第 2 ?期 陈雪岚等 :钝齿棒杆菌精氨酸生物合成相关基因簇 argCJ BDFR 的扩增及序列分析 33
argF 和 argR 5个 ORFs的上游区均存在与转录启始有关的典型 SD 序列。argJ ( 1081～2247)上游 - 10bp处
有一核糖体结合区 GGAG; argB( 2293～3246)上游 - 11bp处有一核糖体结合区 AGG, argD(3247～4422)上
游 - 12bp处有一核糖体结合区 GGGGA,此结合区位于 argB基因序列内; argF (4436～5395)上游 - 13bp处有一
核糖体结合区 AGGA ; argR ( 5399～5914) 上游 - 10bp 处有一核糖体结合区 GAGG。这与在 E . coli 和枯
草杆菌 ( Bacillus subtilis)中已证实核糖体结合区与转录启始位点的最适距离为 7～9bp存在差异 ,该差异可
能与棒杆菌表达系统本身的特殊性或 C .crenatum中串联序列 argJBDFR 的翻译效率有关。经分析这 5个
ORFs的结构基因下游均无固定特征 ,且未发现 4～8个 A 或 T 组成的序列 ( argB 基因例外 ) , 推测串联基因
转录的终止依赖于ρ因子的存在。
应用 TRANSFAC 中的 FastM PatSearch V1 .1 和 Mat Inspector V2 .2 程序以及 BCM HGSC 提供的
NNPP/ Prokaryotic程序对串联基因序列进行分析预测 ,寻找可能的启动子区域 , 预测出 argB基因上游具有
潜在的启动子活性。Pribnow 盒在 argB 基因上游 - 134bp, Sextama盒在 argB 基因上游 - 146bp,二者间隔
12bp; argB基因上游 - 91bp至 - 126bp存在一对长为 6bp的反向重复序列 , 推测是调控蛋白质识别的 DNA
序列 ,即操纵子区域。
argJ 基因编码的氨基酸序列分析。 argJ 基因编码一个由 389氨基酸组成的分子量为 39 .8kD 的鸟氨
酸乙酰转移酶 ( OAT ) , 富含丙氨酸 ( 15 .7% ) ; 其编码的 12 个精氨酸密码子中有 3 个稀有密码子 CGA
(25% ) 。在 C . glutamicum ATCC13032中 argJ 编码的蛋白酶也出现了这种偏好密码子 , 12个精氨酸密码
子中有 4个是稀有密码子 [ 6] 。经 BLAST 比较分析 , C . crenatumA .S1 .542 的 argJ 基因编码的 OAT 与
C . glutamicum、C .diphtheriae gravis NCTC13129、C . efficiens Y S-314 和 M . tuberculosis CDC1551 的分
别享有 92%、67%、79%和 53%的同源性。
C .crenatum 的 OAT 与只具有乙酰鸟氨酸酶的功能、无乙酰转移酶活性的同属菌 C . glutamicum、
C . ef ficiens及 C .diphtheriae的 OAT 比较 ,相同氨基酸数为 270, 相同氨基酸均匀分布在整个氨基酸序列
上 ;且与 C .glutamicum的 OAT 相同氨基酸数高达 357,据此可认为 C .crenatum的 argJ 结构基因编码的
OAT 亦为单功能酶。同时比较其他具有双功能的 OAT 菌株 , 包括 Lactococcus lactic[ 12] 、Bifidobavterium
longum[ 13] 、Streptomyces clavuligerus[ 14] 、B .stearothermopbilus[ 8] 、B .subtilis[ 15] 、M . tuberculosis、Neisseria
meningitidisserogroup[ 16] 及 Therm . tengcongensis[ 17] ,得出 OTA 是否具有双功能与 OTA 的氨基酸数无关 ,
其中 C .glutamicum、C .efficiens及 C .diphtheriae与 Lactococcus lactic、Bi fidobavterium longum、Strepto-
mycesclavuligerus和 Therm . tengcongensis菌在 N 端均比其他菌少 8～13个氨基酸 ,这与前人认为的因为在
OTA 的 N 端少几个或十几个氨基酸而使 OTA 不具备乙酰转移酶活性[ 6] ,即 N 端缺失的氨基酸与转乙酰基
团无关存在差异。
argB 基因编码的氨基酸序列分析。 argB基因编码一个由 313氨基酸组成的 34 .6kD 的蛋白酶———乙
酰谷氨酸激酶 (AGK )。在 argB 基因中稀有的甘氨酸密码子 GGA 和 GGG 在 28个甘氨酸密码子中有 7个 ,
占甘氨酸密码子的 25%。BLAST 比较结果显示 C .crenatumA .S1 .542的 argB基因编码的 AGK 多肽序列
与 C .glutamicum ATCC13032的序列同源性高达 95% ;与 Bifidobacterium longum NCC2705的有 63%的
相同氨基酸 ,与 N . meningitidis serogroup B 的有 48%的相同氨基酸。
图 3 具有 ATP 结合结构域的蛋白 *
Fig .3 Putative ATP-binding domain protein
* # 指示 A TP 结合位点。
AGK 属于一类需 Mg2 + 激活的酶家族。研究表明不同种属来源的激酶存在着高度保守的区域。在序
列的 C 端 , 都存在一段
被认为是 ATP 结合位
点的共同序列 GIG (其
中 I 可为 K、S、A、T 或
C )。 C . crenatum 的
AGK 在 287、288 和
289 有 ABC ( ATP-
binding cassette, ABC)
转运子核苷酸结合的
氨基酸残基 GIG。图 3
列 举 了 C . crenatum
34 中 国 生 态 农 业 学 报 第 14 ?卷
的 AGK 与其他几种菌的 AGK 蛋白的 ATP 结合位点。
argD 基因编码的氨基酸序列分析。 argD 基因编码一个分子量为 43 .8kD, 由 392氨基酸组成的乙酰鸟
氨酸转氨酶 (AOAT ) , 富含丙氨酸 ( 12 .2% ) 、甘氨酸 ( 10 .5% ) 和缬氨酸 ( 10 .2% ) , 无明显偏好密码子。经
BLAST 分析 , argD 基因编码的多肽序列与 C . glutamicum的 AOAT 有 98 .5% 相同氨基酸 ;与 C .efficiens
的有 77 .4%相同氨基酸 ; 与 C .diphtheriae的有 61 .5%相同氨基酸 ; 与 M . tuberculosis的有 52 .2% 相同氨
基酸。
argF 基因编码的氨基酸序列分析。 argF 基因编码一个分子量为 34 .2kD, 由 320氨基酸组成的鸟氨酸
转氨甲酰酶 (OCAT ) , 富含丙氨酸 ( 11 .6% ) , 无明显偏好密码子。经 BLAST 分析 , argF 基因编码的 OCAT
与 C .glutamicum的有 97 .5% 相同氨基酸 ; 与 C . efficiens、C . diphtheriae及 M . tuberculosis 的分别享有
84 .95%、75 .5%和 58 .1%相同氨基酸。
argR 基因编码的氨基酸序列分析。 argR 基因编码一个分子量为 18 .2kD, 由 172氨基酸组成的精氨酸
抑制子 (AR) ,富含亮氨酸 ( 14 .5% )。 argR 基因中稀有的甘氨酸密码子 GGA 和 GGG 在 15个甘氨酸密码子
中有 5个 ,达 33 .3%。经 BLAST 分析 , C . crenatum的 argR 基因与 C . glutamicum的 argR 基因虽存在 3
个碱基的差异 ,但由于密码子的简并性 , C . crenatum的 argR 基因编码的精氨酸抑制子与 C . glutamicum
的氨基酸 100%相同 ;与 C . diphtheriae、C . efficiens及 M . tuberculosis分别有 63 .7%、73 .7%和 49 .1%的
相同氨基酸。AR 属于调控蛋白 , 具有 DNA 结合结构域。 C . crenatum的 AR 结合 DNA 的结构域位于第
14～89位氨基酸。
3 小结与讨论
本实验参照 C .glutamicum、C . diphtheriae、C . efficiens 和 M . tuberculosis生物合成精氨酸基因簇序
列 ,设计 4对特异性引物 , 获得 C .crenatum的相应基因 ,并对其编码的氨基酸序列进行分析。 C . crenatum
的相应基因序列及其推导的氨基酸序列与 C . glutamicum同源性非常高 , 说明二者的亲源关系密切。
C .crenatum的 argJ 基因编码的 OTA 只具有乙酰鸟氨酸酶的功能 , 为单功能酶 , OTA 是否具有双功能与 N
端少几个或十几个氨基酸无关。采用循环途径生物合成精氨酸的生物 , argJ 编码的蛋白酶一般具有双功
能 ,棒杆菌属的菌属于这类代谢途径的特例。 argB 基因上游有一启动子序列和阻遏蛋白结合区域。在
C .crenatumA .S1 .542 的精氨酸生物合成串联序列中 , argB 的终止密码子 TAA 和 argD 的启始密码子
ATG 紧密相邻 , argD 与 argF 相距 13bp, argF 与 argR 相距 3bp,提示这 4个 ORFs位于同一转录单元。
C .crenatumA .S1 .542产精氨酸的量按坂口试剂法检测几乎趋于零 , 但本实验室已采用亚硝基胍诱变
此菌 ,使之产精氨酸的量达到 4mg/ mL。通过与原始菌株基因的比较 , 研究其诱变型 C .crenatum生物合成
精氨酸基因簇的变化 ,可为采用基因工程手段探索改良 C .crenatum提供线索 , 从而为进一步提高精氨酸产
量起到积极作用。
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