全 文 ：北方园艺 2008(1):203 ～ 206 ·生物技术 ·
第一作者简介:白瑞(1983-),女,在读硕士,研究方向:植物分子生
物学。E-mail:bairui0312@163.com。
通讯作者:李潞滨。 E-mail:lilubin@126.com。
基金项目:国家林业局引进国际先进农业科学技术(948)项目
(2004-4-26)及(2005-4-37)。
收稿日期:2007-09-01
基于叶绿体 rRNA ITS 序列的兰科植物
系统发育关系分析
白 　瑞1 , 何聪 芬1 , 董 银卯1 , 李潞滨2 , 刘 　蕾1 , 彭 镇华2
(1.北京工商大学 化学与环境工程学院 ,植物资源研究开发北京市重点实验室,北京 100037;
2.中国林业科学研究院林业研究所 ,国家林业局林木培育实验室,北京 100091)
　　摘　要:叶绿体 DNA(Chloroplast DNA , cpDNA)中的反向重复序列中的非编码区对于陆生
植物的进化研究非常有指导意义 ,被越来越广泛的应用在不同的分类阶元的系统研究中。该研
究在叶绿体 rRNA ITS 序列的保守区设计引物 ,PCR扩增得到 450 bp左右的叶绿体 rRNA从
4.5 S到5 S的片段 ,扩增产物直接测序 ,进而依据叶绿体 rRNA ITS基因序列分析了兰科植物
(Orchidaceae)的33个品种材料(12个兰属品种 ,14个兜兰属品种 ,7个石斛属品种)间的亲缘关
系。通过最简约性分析产生的叶绿体 rRNA ITS系统树表明 ,石斛属和兜兰属为两个自然类群 ,
兰属可能为一多源组。兰属的碧玉兰位于系统树的基部 ,构成其余各种的姐妹支。兜兰属的白
花兜兰 、麻栗坡兜兰独立于属内其他种而自成一支。由于兰科植物叶绿体 rRNA ITS序列变异
率较低 ,最简约分析产生的分支得不到Bootstrap分析的高度支持 ,各亚属之间的关系也不明确。
对兰科植物系统发育关系的研究尚需要更多的证据。
关键词:兰科植物;系统发育;叶绿体 rRNA ITS 序列
中图分类号:S 682.31;Q 946-33　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2008)01-0203-04
　　兰科(Orchidaceae)植物是开花植物中最大的家族之
一 ,而且是单子叶植物中最高度演化的一科 ,有 6个亚
科725属25 000余个种[ 1] 。由于在自然界杂交的缘故 ,
兰科植物中间类型多 ,变异较大 ,其分类界限不是很明
确 ,给属间 、属内种的分类和整理带来了很大的困难[ 2] 。
从理论及实践上来讲 ,探讨植物亲缘关系和进化趋势是
一个很重要的研究方面。
形态学特征在兰科植物的分类中是最主要的依据。
最初 ,兰科植物主要根据体态(叶片数 、花色等)、习性(花
期、生长温度 、地理位置等)及蕊柱长短等相关指标进行
分类[ 3] 。陈心启[ 4-5]根据双蕊兰属(Diplandrorchis)的腐
生习性 、花 、雄蕊2枚 、柱头向上 、无蕊喙等特点认为其是
极为原始的孑遗植物 ,在 1982年又提出选用 10个最重
要的原始特征 ,如具2 ～ 3枚能育雄蕊 、花辐射对称 、无特
化的唇瓣等来分析兰科各主要类群的亲缘关系。孙安
慈等[ 6] 通过观察各属叶片的微观结构提出各属之间的
差异。对于属下种间的划分 ,兰属基于宏观形态学形
状 ,尤其是花粉块的数目以及唇瓣与蕊柱的愈合程度而
分为 3个亚属:兰亚属(subgen.Cymbidium),大花亚属
(subgen.Cyperorchisand)和剑兰亚属(subgen.Jenso)。
陈心启等[ 7] 则根据叶上表面是否有网格斑 ,对中国兜兰
属(Paphiopedilum)野生种分为宽瓣亚属(S ubgenus
Brachypetalum)和兜兰亚属(Subgenus Paphiopedilum)。
植物叶绿体基因组(cpDNA)为闭环双链 DNA ,其
长度变异主要由2个反向重复序列(称为 IR区 , Inverted
repeat region)引起 ,这 2 个反向重复序列长约 22 ～
25 kb , IR区主要含有编码 rRNA的基因 , rRNA 基因在
叶绿体基因组上排列成簇 ,顺序为 16S-23S-4.5S-
5S ,形成一个操纵子 ,其中有 3个间隔非编码区(ITS)。
不同种植物叶绿体 rRNA 序列具有高度同源性。前人
研究表明[ 9] ,叶绿体 DNA中的反向重复序列中的非编
码区对于陆生植物的进化研究是非常有指导意义的。
近年来 , cpDNA非编码区序列被越来越广泛的应用在不
同的分类阶元的系统研究中。
鉴于兰科植物高度演化的形态 ,依据传统的形态学
分类法存在诸多有争议之处 ,近年来 ,分子生物学的方
法越来越多地应用于兰科植物系统发育研究中 ,该研究
则首次将叶绿体 rRNA ITS 序列应用于此 ,为兰科植物
的系统研究提供多来源的信息。
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·生物技术· 北方园艺 2008(1):203～ 206
1　材料与方法
1.1　材料
　　表 1　　　　　　样本名称
序号 名称
C1 兰属 Cymbidium 碧玉兰C.lowianum
C2 大雪兰C.mastersii
C3 台兰(多花兰之变种)
C4 硬叶兰(亚种)C.bicolorsubsp.Obtusum
C5 莎草兰C.elegans
C6 多花兰C.f loribundum
C8 独占春C.eburneum
C9 西藏虎头兰 C.tracyanum
C11 大花蕙兰C.hybridium杂交种
C12 春兰 C.goeringii
C16 蕙兰 C.hybridium
C20 春剑 C.longibracteatum
P1 兜兰属 Paphiopedilum 彩云兜兰P.wardii
P2 紫纹兜兰P.purpuratum
P3 巨瓣兜兰P.bellatulum
P4 带叶兜兰P.hirsutissimum
P5 白花兜兰P.emersonii
P6 同色兜兰P.concolor
P8 长茎兜兰P.rhizomatosum
P11 麻栗坡兜兰 P.malipoense
P12 飘带兜兰P.parishii
P14 亨利兜兰P.henryanum
P15 虎斑兜兰P.markianum
P16 卷萼兜兰P.appletonianum
P18 春紫毛兜兰 P.villosum
P19 查尔斯兜兰 P.charlesworhii
d1 石斛属Dendrobium 串珠石斛 D.f alconeri
d 4 细茎石斛D.monili forme
d 5 大包鞘石斛 D.wardianum
d 6 流苏石斛D.f imbriatum
d10 石斛 D.nobi le
d12 矮石斛D.Bel latulum
d13 疏花石斛D.Henry i
　　注:样品序号中的英文字母为属拉丁文名称的首字母。
　　试验共选用 33个兰科品种(兰属 12种 ,兜兰属 14
种 ,石斛属7种)作为样品(样品保存于中国林业科学研
究院林业研究所)。样品名称见表 1。采用禾本科竹亚
科刚竹属 2个品种 ,寿竹(Phy llostachys f .shouzhu)和
舒竹(Phy llostachys shuchengensis)作为外类群 ,所有样
品均在中国林业科学研究院林业研究所培育。
1.2　方法
用改进的 CTAB 法[ 10] 从新鲜幼嫩叶片中提取总
DNA 。根据在 GenBank中查到的叶绿体 rRNA ITS的
保守区段设计引物 ,正向引物:5 TATCGTCACCGCAG-
TAGA 3 ,反向引物:5 CCCCTACAGTATCGTCAC 3 。
所用扩增体系为 25 μL 体系 ,其中 10×buffer
(MgCl220 mM)2.5μL ,dNTPs(2.5 mM)1.25 μL , Taq
酶(2 U/μL)0.75 μL ,DNA 模板(20 μg/μL)1.25 μL ,两
向引物(10 μM)各 1μL ,无菌双去离子水补足至 25 μL
(其中所用试剂均为 TIANGEN 生产)。PCR程序为:
94℃预变性 5 min ,然后经94℃变性30 s;58℃退火30 s;
72℃复性延伸 15 s ,共 30个循环后 ,72℃延伸 10 min。
PCR扩增产物直接测序(所有序列均由三博远志公
司测定)。用Clustal X软件校正序列。用 PAUP 4.0软
件进行最大简约法分析 ,得其系统进化关系。
2　结果
根据在GenBank中查到的叶绿体 rRNA ITS 的保
守区段设计引物 ,在 33个品种(12个兰属品种 ,14个兜
兰品种 ,7个石斛兰品种)中均 PCR扩增得到长度 449 ～
464 bp的片段(部分结果电泳图见图 1),PCR结果直接
测序(所有序列均由三博远志公司测定)。测序引物同
PCR引物。
使用 Clustal X 校正 4.5 S 、ITS 3、5 S 序列。用
PAUP 4.0最大简约法分析 ,所有变异均等同处理。最
大简约树采用启发式搜索(Heuristic search),获取严格
一致树 ,用Bootstrap分析(1000 replications)检验简约树
中各分支的内部支持率。
图 1　部分 PCR结果电泳图
　　　注:M:200 bp DNA ladder:1:碧玉兰 C.lowianum;2:大雪兰 C.mastersi i;3:台兰(多花兰之变种);4:硬叶兰(亚种)C.bicolorsubsp.Obtusum;
5:莎草兰 C.elegans;6:多花兰 C.f loribundum;7:独占兰 C.eburneum;8:西藏虎头兰 C.tracyanum;9:大花蕙兰 C.hybridium;10:春兰
C.goeringii;11:蕙兰 C.hybrid ium;12:春剑 C.longibracteatum。
3　结论 经 Clustal X后的叶绿体 rRNA ITS序列(含4.5 S 、
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ITS 3和5 S)总长为475 bp ,排列后的序列经 PAUP 4.0
分析 ,用最大简约法寻找得到 1棵最简约树 ,所有位点
相同权重。其中412个位点相同 ,13个位点为非信息位
点 ,信息位点共50个。缺失位点按空缺处理 ,1 000次自
展 ,树长 69 ,一致性指数(CI)0.9275 ,相似性指数(HI)
0.0725 ,除去非信息位点后 CI=0.9107 , HI=0.0893 ,维
持性指数(RI)0.9760。最大简约树用 bootstrap分析各
分支的支持强度。
3.1　属的划分
依据叶绿体 rRNA ITS 序列作出的系统发育树分
析可见 ,石斛属和兜兰属各自聚为一支 ,这与传统分类
所得的结果是一致的。而兰属则为一多源组 ,逐步分
出 ,其中碧玉兰继外类群后最先分出(BS<50),然后是
石斛属一支(BS=100),接着 ,兰属其余品种相继分出 ,
兜兰属最后分出(BS=100)。由此推断兰属是 3个属中
最接近外类群的种群 ,而且进化程度不一 ,体现出高度
的异质性。
3.2　亚属的划分
兰属内大花亚属的碧玉兰是最接近外类群的一个
种 ,然后是剑兰亚属的蕙兰 、春兰以及兰亚属的台兰 、多
花兰 、硬叶兰 ,最后分出的是大花亚属的大雪兰 、独占
春、莎草兰 、大花蕙兰 、西藏虎头兰以及剑兰亚属的春
剑。而依据核内 ITS基因序列所做的系统分析[ 11] 以及
用RAPD方法[ 12]得到的结果显示 ,剑兰亚属可能是一个
自然类群 ,大花亚属并非自然类群 ,兰亚属则为一高度
异质性的类群。这与传统分类均有较大分歧 ,综合各种
分析结果显示 ,有必要对兰属属下分类进行重新校订。
石斛属各种之间没有区分 ,共在同一支。可见叶绿
体 rRNA ITS基因不适用于石斛属内的系统分析。
兜兰属宽瓣亚属的麻栗坡兜兰和白花兜兰独立于
其余种而自成一支 ,而同属于宽瓣亚属的巨瓣兜兰和同
色兜兰却混迹于兜兰亚属中 ,叶绿体 rRNA ITS基因在
兜兰属内的系统分析还需要增加样品品种数量或结合
更多其他来源信息分析。
4　讨论
兰科植物叶绿体 rRNA ITS 基因序列位点变异率
较低 ,有限的简约信息位点使得很多分支都得不到有力
的支持。
不管是现行的表型分类还是基于兰科植物叶绿体
rRNA ITS基因序列分析 ,兜兰属和石斛属(研究中所涉
及的品种)都是自然类群 , 在研究中支持强度达到
100%。
兰属中 ,碧玉兰最早从主体分出 ,成为其余品种的
姐妹支(BS<50)。随后分出剑兰亚属的蕙兰 、春兰以及
兰亚属的台兰 、多花兰(BS<50),大花蕙兰 、西藏虎头兰
以及剑兰亚属的春剑组成一支(BS =100),成为大花亚
属的大雪兰 、独占春 、莎草兰以及兜兰属全部品种的姐
妹支。
兜兰属宽瓣亚属的麻栗坡兜兰和白花兜兰独立于
其余种而自成一支。
总之 ,由叶绿体 rRNA ITS 基因序列得到的系统树
仅有一部分是与现有分类学中的是一致的。石斛属与
兜兰属之间遗传关系显然比较远。然而 ,由于叶绿体
rRNA ITS基因序列的不足 ,尚不能得到各主要分支的
确定位置 ,各亚属之间的关系也不明确 ,尤其是兰属内
各品种遗传位置不能确定。显然 ,要得到相应得新的分
类结果还需要更多的信息 ,尤其是来源不同的大量证据。
图 2　依据叶绿体 rRNA ITS 基因序列所得系统发育树
　　注:Tree length = 69 , Consistency index (CI)= 0.9275 , Homoplasy
index(H I)= 0.0725, CI excluding uninformative characters = 0.9107 , HI
excluding uninformative characters = 0.0893 , Retention index (R I)= 0.
9760 , Rescaled consistency index (RC)= 0.9052
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A Preliminary Analysis of Phylogenetic Relationships in Orchidaceae
Based on cp rRNA ITS Sequence Data
BAI Rui1 , HE Cong-fen1 , DONG Yin-mao1 , LI Lu-bin2 , LIU Lei1 , PENG Zhen-hua2
(1.Beijing Key Lab of Plant Resources Research and Development , College of Chemistry and Environmental Engineering , Beijing Technology
and Business University , Beijing 100037 ,China;2.Key Lab of Tree Breeding and Cultivation , State Forestry Administration , Research Insti-
tute of Forestry , Chinese Academy of Fo restry , Beijing 100091 , China)
Abstract:Noncoding sequences from the inverted repeat region of chloroplast DNA appear suitable for phylogenetic study
at different taxonomic levels.In this study , we developed PCR primers against highly conserved regions of the rRNA
operon located and used these to amplify the region spanning from 4.5 S rRNA gene to 5 S rRNA gene , which is roughly
450 bp.The sequence of cp rRNA ITS regions of 33 orchidaceous(12 Cymbidiums ,14 Paphiopedilums , and 7Dendrobi-
ums)were analyzed using PCR amplification and direct DNA sequencing.The phylogenetic trees generated f rom maxi-
mum parsimony analysis showed that Paphiopedilum and Dendrobium are monophyletic g roup while Cymbidium is
polyphyletic with C.lowianum which is sister to the remainder species , P.emersonii and P.malipoense became the
sister group to the remainder species within Paphiopedilum.However , because of the low substitution rate in the rRNA
ITS region , some of the clades identified received relatively low support , subgenus delimitations were also not clear.
Further study is needed for achieving a robust phylogeny of Orchidaceae.
Keywords:Orchidaceae;Phylogeny;cp rRNA ITS
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