全 文 ：收稿日期：２０１４－０２－２８
基金项目：江苏省高校自然科学研究项目（１２ＫＪＤ５５０００３）；江苏省博士后基金项目（１３０２０４１Ｂ）；徐州工程学院校级科研课题（２０１３）；徐州工程
学院大学生创新项目
作者简介：侯进慧（１９８０－），男，江苏徐州人，副教授，博士，主要从事食品微生物学与生物工程研究．
第２９卷第４期 徐 州 工 程 学 院 学 报 （自 然 科 学 版 ） ２０１４年１２月
Ｖｏｌ．２９Ｎｏ．４ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｘｕｚｈｏｕ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｄｅｃ．２０１４
大蒜在葱科的分子分类地位研究
侯进慧，李同祥，蔡文佳
（徐州工程学院，江苏 徐州　２２１０１８）
　　摘要：通过扩增获得１８ＳｒＲＮＡ和叶绿体１６ＳｒＲＮＡ基因序列，测序并提交ＧｅｎＢａｎｋ，登录号
分别是ＪＦ７１９２８５和ＪＦ７１９２８６．利用大蒜和ＧｅｎＢａｎｋ相关序列构建系统发育树，进行分子演化分
析．结果表明：大蒜１８ＳｒＲＮＡ基因与球序韭、韭菜、茖葱等葱科植物序列相似度高；叶绿体１６Ｓ
ｒＲＮＡ基因与龙舌兰科和薯蓣科的物种序列相似度高．大蒜与葱科植物在１８ＳｒＲＮＡ序列上具有
较高的同源性．１８ＳｒＲＮＡ序列在植物演化方面的区分度比１６ＳｒＲＮＡ高．
关键词：大蒜；ｒＲＮＡ；分类；鉴定
中图分类号：Ｑ９４６　文献标志码：Ａ　文章编号：１６７４－３５８Ｘ（２０１４）０４－００４７－０４
大蒜（Ａｌｌｉｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ）是天门冬目（Ａｓｐａｒａｇａｌｅｓ）葱科（Ａｌｉａｃｅａｅ）葱属（Ａｌｌｉｕｍ）植物，又名胡蒜、葫，它
既可以做调味品也有药用价值．中医理论认为大蒜味辛、性温，入脾、胃、肺经，具有温中消食、行滞气、暖脾
胃、消积、解毒、杀虫的功效，主治饮食积滞、脘腹冷痛、水肿胀满、泄泻、痢疾、疟疾、百日咳、痈疽肿毒、白秃癣
疮、蛇虫咬伤以及钩虫、蛲虫等病症，近年大量实验研究和临床验证证实了大蒜具有抗血小板凝聚、降血压、
改善血流纤溶活性和外周微循环、显著降低血液黏稠度和改善红细胞浓集现象、抗实验性动脉粥样硬化、扩
张血管和防治脑梗塞等作用，对中老年人的这一常见病和多发病有肯定和综合的防治作用．大蒜的活性成分
有蒜氨酸（ａｌｉｎ）、蒜酶（ａｌｉｎａｓｅ）、大蒜辣素（ａｌｉｃｉｎ）和阿霍烯（ｃｉｓ－ａｊｏｅｎｅ，ｔｒａｎｓ－ａｊｏｅｎｅ）等．目前对大蒜的药
理作用、生物活性和临床开发利用的研究较多［１－５］．
在植物性食品的鉴定中，一般是利用形态学、细胞学、生理学等方面的特征进行表型分析和资源的分类．
随着分子生物技术的发展，利用数据信息量较大的ＤＮＡ分子信息，直接从ＤＮＡ分子水平进行物种鉴定已
成为一种快速有效的方法［６］．目前，ｒＲＮＡ基因序列分析技术已应用于食品的检测和鉴定中，扩增植物
ｒＲＮＡ基因并进行碱基序列测序分析，是进行分子鉴定的很好标记．相关研究表明，ｒＲＮＡ基因用于食品质
量监控、鉴定是高效可行的方法［７－１４］．李萍等［１５］研究了忍冬科植物忍冬的５ＳｒＲＮＡ基因间序列的变异，探讨
了金银花药材道地性的基因基础．有研究者根据模式植物拟南芥的１８ＳｒＲＮＡ基因序列设计引物，对三七根
的１８ＳｒＲＮＡ基因序列进行基因克隆、测序，并与模式植物拟南芥以及人参属植物喜马拉雅人参的相应序列
进行比较．通过对产于广西靖西的三七根的１８ＳｒＲＮＡ基因进行克隆测序，获得了三七根的１８ＳｒＲＮＡ基因
的部分序列特征［８］．也有人分析了三七及其伪品竹节参蓬莪术、温莪术、桂莪术的１８ＳｒＲＮＡ基因序列，确定
蓬莪术、温莪术和桂莪术１８ＳｒＲＮＡ基因序列之间只有１个变异位点，而与三七之间有９４个［９］．
本文对大蒜核糖体１８ＳｒＲＮＡ和叶绿体１６ＳｒＲＮＡ基因序列进行扩增和序列分析，与ＧｅｎＢａｎｋ数据库
中相近序列进行了比对，分析了大蒜的分类问题，为相关食品分类和鉴定提供了方法参考．
１　材料与方法
１．１　材料和试剂
大蒜样品采自于徐州市铜山区菜地，采摘后立即带到实验室进行研究分析．实验所用的生化试剂使用
“国药集团化学试剂有限公司”产品，基因组提取、ＤＮＡ胶回收等试剂盒和分子生物学试剂购自 “天根生化
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科技（北京）有限公司”．
１．２　基因组和叶绿体ＤＮＡ的提取
将新鲜大蒜除去表皮，进行表面除菌后，使用液氮在无菌研钵中研成粉末，使用基因组提取试剂盒提取
大蒜基因组ＤＮＡ．叶绿体ＤＮＡ参照文献［１５］的方法提取．将大蒜绿叶进行组织匀浆，差速离心分离，密度
梯度离心，分离提取叶绿体，使用苯酚／氯仿抽提大蒜叶绿体ＤＮＡ．使用完整性好的ＤＮＡ作为 ＰＣＲ模板，
－２０℃保存．
１．３　ｒＲＮＡ基因序列扩增
使用ＬＡ－Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶扩增大蒜核糖体的１８ＳｒＲＮＡ和叶绿体的１６ＳｒＲＮＡ基因片断．ＰＣＲ反应条
件：９４℃预变性３ｍｉｎ，９４℃变性６０ｓ，５６℃退火６０ｓ，７２℃延伸９０ｓ，反应２５个循环，７２℃延伸１０ｍｉｎ．
核糖体１８ＳｒＲＮＡ基因的引物是［１０－１２］：Ｆ　５′－ＧＴＡＧＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＧＴＣＴＣ－３′和 Ｒ　５′－ＴＣＣＧＣＡＧＧＴ－
ＴＣＡＣＣＴＡＣＧＧＡ－３′．叶绿体 １６ＳｒＲＮＡ 基因的引物是：Ｆ５′－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３′，Ｒ５′－
ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３′．
１．４　克隆测序
将目的片段进行胶回收，与载体连接，用于测序．连接体系是１μＬＴ４ＤＮＡ连接酶缓冲液、１μＬ　ｐＧＥＭ－
Ｔ载体、１μＬ　Ｔ４ＤＮＡ连接酶、３μＬ回收的ＤＮＡ片段，用灭菌ｄｄＨ２Ｏ补充体积至１０μＬ．１６℃连接４ｈ，转
化ＤＨ５α感受态细胞，筛选阳性克隆，送生物公司测序［１６］．
１．５　序列分析
使用ＤＮＡＭＡＮ软件将ＧｅｎＢａｎｋ中与大蒜序列相近物种的１８ＳｒＲＮＡ和叶绿体１６ＳｒＲＮＡ基因序列
进行比对，分析大蒜的分类地位［１７］．
２　结果与讨论
２．１　大蒜ｒＲＮＡ基因扩增
图１　扩增ｒＲＮＡ基因
片段的电泳结果
使用ＰＣＲ方法获得了大蒜的核糖体１８ＳｒＲＮＡ和叶绿体１６ＳｒＲＮＡ
基因片段如图１所示．在琼脂糖凝胶电泳中检测序列，无杂带．将片段克隆
测序，获得两条片段的序列．将序列登录到 ＮＣＢＩ，两基因序列的登录号分
别是：１８ＳｒＲＮＡ（ＪＦ７１９２８５），１６ＳｒＲＮＡ（ＪＦ７１９２８６）．
２．２　序列分类
使用ＮＣＢＩ的ＢＬＡＳＴ程序获得ＧｅｎＢａｎｋ数据库中１８ＳｒＲＮＡ基因
与大蒜相近的序列，确定相关物种的类别，分析大蒜与相关物种的分类关
系（图２）．分析结果显示，葱属的大蒜、球序韭（Ａｌｌｉｕｍ　ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）、韭菜
（Ａｌｌｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、茖葱（Ａｌｌｉｕｍ　ｖｉｃｔｏｒｉａｌｉｓ）相似性都很高，它们在分析
结果的下面一个大分支中．其中，大蒜与球序韭的序列相似性最高，说明两者演化关系较近．在分析结果的上
面一大分支中大多是龙舌兰科（Ａｇａｖａｃｅａｅ）、天门冬科（Ａｓｐａｒａｇａｃｅａｅ）的物种．
分析ＧｅｎＢａｎｋ数据库中叶绿体１６ＳｒＲＮＡ基因与大蒜相近的序列（图３）．分析结果显示，在系统发育树
的最下面葱科的大蒜、龙舌兰科的Ｙｕｃｃａ　ｆｉｌａｍｅｎｔｏｓａ和薯蓣科（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ）的Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｓｐ．３个物种聚
类成一个分支．说明三者的演化关系较近．
３　结论
本文研究显示，ｒＲＮＡ基因序列分析在植物分类鉴定中具有较好的应用价值．本文利用基因组中核糖体
ＲＮＡ基因探讨大蒜的分子分类，发现大蒜与葱科植物在１８ＳｒＲＮＡ序列上具有较高的同源性，这与基于形
态学进行的传统分类研究是一致的．而１６ＳｒＲＮＡ基因显示，大蒜与龙舌兰科和薯蓣科３个物种聚类成一个
分支，说明１８ＳｒＲＮＡ序列在植物演化方面的区分度比１６ＳｒＲＮＡ高．
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徐州工程学院学报（自然科学版）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０１４年第４期
图２　大蒜１８ＳｒＲＮＡ基因和ＧｅｎＢａｎｋ中相关序列构建的系统发育树
（序列登录标注于括号内）
图３　大蒜叶绿体１６ＳｒＲＮＡ基因和ＧｅｎＢａｎｋ中相关序列构建的系统发育树
（序列登录号标注于括号内）
参考文献：
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Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ａｌｉｕｍ　Ｓａｔｉｖｕｍ　ｉｎ　Ａｌｉａｃｅａｅ
ＨＯＵ　Ｊｉｎ－ｈｕｉ，ＬＩ　Ｔｏｎｇ－ｘｉａｎｇ，ＣＡＩ　Ｗｅｎ－ｊｉａ
（Ｆｏｏｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｘｕｚｈｏｕ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｕｚｈｏｕ　２２１００８，Ｃｈｉｎａ）
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｔｈｅ　ｐａｐｅｒ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ　ｏｆ　Ａｌｉｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ　ｗｅｒｅ　ｄｉｓｃｕｓｓｄｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ
ｒＲＮＡ　ｇｅｎｅ．１８ＳｒＲＮＡ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　１６ＳｒＲＮＡ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ．Ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｒＲＮＡ
ｇｅｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ　ｔｏ　Ｇｅｎｂａｎｋ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ＪＦ７１９２８５ａｎｄ　ＪＦ７１９２８６．Ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｏｆ　Ａｌｉｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｗｉｔｈ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｉｎ　ＧｅｎＢａｎｋ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ：Ａｌｉｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ
１８ＳｒＲＮＡ　ｇｅｎｅ　ｈａｓ　ａ　ｈｉｇｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｗｉｔｈ　ｍａｎｙ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｗｉｔｈｉｎ　Ａｌｉａｃｅａｅ，ｓｕｃｈ　ａｓ　Ａｌｉｕｍ　ｔｈｕｎｂｅｒｇｉ，Ａｌｉｕｍ
ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ　ａｎｄ　Ａｌｉｕｍ　ｖｉｃｔｏｒｉａｌｉｓ．Ａｌｉｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ　ａｎｄ　Ａｌｉａｃｅａｅ　ｐｌａｎｔｓ　ｈａｓ　ａ　ｈｉｇｈ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　ｉｎ　１８ＳｒＤＮＡ．
Ｔｈｅ　ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ　ａｃｃｕｓａｔｉｏｎ　ｏｆ　１８Ｓｒ　ＲＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ｐｌａｎｔ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｓ　ｂｅｔｔｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　１６Ｓ
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Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｌｌｉｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ；ｒＲＮＡ；ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
（编辑　崔思荣）
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