全 文 ：综 述文章编号：1009-0002(2007)03-0543-03
原生质体培养在芸薹属蔬菜作物中的研究进展
张艳 1,李成琼 1,宋洪元 1,秦家顺 2
1.西南大学 重庆市蔬菜学重点实验室,重庆 400716;2.长江师范学院,重庆 408003
[摘要] 原生质体是遗传转化的优良受体。在原生质体培养过程中会产生很多无性系变异,还可以产生体细胞杂种,这些
都为蔬菜育种提供了新的途径。介绍了原生质体培养及原生质体融合方法的研究进展,综述了原生质体培养在芸薹属蔬菜
育种中所取得的研究成果,并对今后研究的方向进行了展望。
[关键词] 芸薹属;蔬菜;原生质体培养;原生质体融合
[中图分类号] Q943 [文献标识码] A
TheProgressofProtoplastCultureResearchOnBrassicaVegetableCrops
ZHANGYan1,LICheng-qiong1,SONGHong-yuan1,QINJia-shun2
1.ChongqingKeyLabofOlericulture,SouthwestUniversity,Chongqing400716K
2.YangtzeNormalUniversity,Chongqing408003K China
[Abstract]Protoplastcanbeusedasanexcelentreceptoringenetictransformation.Variationofprotoplast-derivedplants
areverycommon.Cybridsalsocanbeobtainedfromprotoplastfusion.Althispavewayforvegetablebreeding.Advance
inprotoplastcultureandprotoplastfusionandapplicationofthesetechnologyinthebreedingofBrassicavegetablewere
reviewedinthispaper.Theprospectoftheseprotoplastbasedtechnologywasdiscussedaswel.
[Keywords] BrassicaK vegetableK protoplastcultureK protoplastfusion
十字花科芸薹属(Brassica)蔬菜作物主要包括大白菜、不结
球白菜、甘蓝、花椰菜、菜心、芥菜等,是我国人民喜爱并广为栽
培的蔬菜种类。其中许多蔬菜杂种优势明显,但是利用自交不亲
和系繁殖杂种存在一些问题,如亲本繁殖困难、杂种纯度无法达
到 100%、长期自交导致自交衰退等。利用雄性不育系制造杂种
是较为理想的方法,所以细胞质雄性不育基因(CMS)在各种间甚
至属间进行转育,对杂种种子生产有重要的意义。但芸薹属植物
种间杂交所形成的胚和种子往往发育不良,从十字花科其他野
生种导入有用基因则更为困难,而利用原生质体培养可以方便
地进行各种遗传转化工作,这就促使原生质体培养技术在芸薹
属蔬菜作物中得到了广泛的应用。我们简要综述了原生质体培
养和体细胞融合等技术在芸薹属蔬菜作物中的研究进展,并介
绍了这些技术在育种工作中的应用情况,以期为应用原生质体
培养技术培育芸薹属蔬菜新品种提供参考。
1 原生质体的分离与培养
1.1 原生质体的来源
芸薹属蔬菜原生质体可以来源于真叶、子叶、幼根、下胚轴
及花茎组织等材料[1-5],当前这些游离原生质体的植物器官多取
自种子萌发的无菌苗,且以 4～7d的无菌苗分离效果最好[6]。赵
军良[7]对大白菜原生质体进行再生植株时发现,采用小于 4d或
大于 7d的无菌苗游离所得的原生质体,只能见到少数细胞分
裂,大多数死亡。对于不同的取材部位来说,叶片分离的原生质
体同质性高,但叶片作为营养器官,由它所分离的原生质体淀粉
含量较多,分裂慢,且再生细胞形成的愈伤组织分化慢,再生频
率低。由于下胚轴所分离的原生质体起始分裂早,分裂频率高,
所以近年很多研究者采用下胚轴作为游离原生质体的材料。
1.2 原生质体的分离
原生质体的分离纯化多采用酶解-过滤-离心-洗涤的方法。
酶液的配制多为1%的纤维素酶、0.5%的果胶酶 [3,8]溶解在 CPW
溶液中。在分离青菜原生质体时发现[3],半纤维素酶对分离原生
质体只有促进作用,而果胶酶MacerozymeR-10则是必需的。另
外,密度梯度离心法对纯化下胚轴原生质体效果较好,而用该方
法分离纯化根原生质体则损失严重。根本身在酶解液中产生的
杂质较少,采用比重法纯化根原生质体更为可取。许多研究还表
明,对酶解前的材料在 4～7℃低温下进行预处理,有助于原生质
体的分离和以后的分裂及再生[7,9],其机理可能是低温预处理使
细胞分裂产生了相对同步,或是冷处理使原生质体分泌了一些
因子来改善细胞活力或刺激细胞分裂。
1.3 原生质体的培养
对初期原生质体培养的方法,许多学者进行了比较研究,方
法也在逐步改进。李名扬等[9]培养黄籽甘蓝原生质体时发现,与
液体浅层静置培养法相比,薄层漂浮法分裂的起始时间早,在培
养基中 1d就有细胞壁的再生,第 2天时就开始第一次细胞分
裂,而液体浅层静置培养法在4～5d时才开始启动分裂。何龙飞
[收稿日期]2006-09-18
[基金项目]重庆市良种创新工程项目
[作者简介]张艳(1982-),女,硕士研究生
[通讯作者]李成琼,(E-mail)chqli@swau.cq.cn
生 物 技 术 通 讯
LETTERSINBIOTECHNOLOGY Vol.18No.3May,2007 543
生 物 技 术 通 讯
LETTERSINBIOTECHNOLOGY Vol.18No.3May,2007
等[3]采用液体浅层培养、液固双层法和混合平板法等 3三种方法
对青菜下胚轴原生质体进行培养,发现液固双层法的效果最好,
有利于改善通气,满足原生质体发育所需营养,固相部分还可以
吸附有害物质,从而提高了原生质体的分裂频率。
KM8P培养基由于其营养成分丰富,在许多植物原生质体培
养中被采用,在芸薹属蔬菜作物中也表现出良好的培养效果[3,7]。
分裂培养基中所加激素及其配比因作物种类及原生质体来源不
同而略有差异。附加0.25mg/L6-BA、1.0mg/LNAA、0.5mg/
L2,4-D的培养基上,不结球白菜[5]下胚轴原生质体再生新壁和
分裂启动快,频率高,为所筛选的最佳培养基。而不结球白菜子
叶作为分离材料,其最佳激素组成则是在其他保持不变的情况
下将 NAA改为 0.5mg/L[2]。青菜所用的起始培养基中加入 2
mg/L2,4-D、0.5mg/LBA[3],培养效果较好。李世君等[8]对芜菁
油菜(AA)、包心菜(CC)、浙油(AACC)等 3种不同基因组的作物
分别进行了原生质体培养,发现 2,4-D与 KT配合使用对于刺
激 AA基因组作物的原生质体分裂有效,而 CC基因组作物则要
求IAA和BA的存在。对于同一基因组的原生质体,提高培养基
中的 6-BA浓度(0.25～0.5mg/L)有利于刺激原生质体分裂。培
养密度也会对培养效果产生一定影响,对于芸薹属蔬菜,一般采
用 105细胞/mL。培养密度过大,易导致细胞聚集、粘连,最终死
亡,密度过低也不利于原生质体的分裂[3,7]。
原生质体没有细胞壁的支撑,必须有一定浓度的渗透压稳
定剂来维持其稳定。在原生质体培养过程中,随时间的推移不断
降低渗透压,有利于原生质体的分裂和生长。对于大白菜来说[7],
降低渗透压可以增多细胞团的数量,但未能改变细胞团体积增
长的速度。如果渗透压稳定剂组成不同,原生质体的分裂频率也
不同,代谢上惰性的糖如甘露糖和代谢上活跃的糖如葡萄糖等
配合使用效果较好。
1.4 防止褐化
原生质体培养中的褐化问题在芸薹属蔬菜作物中也普遍存
在,严重制约着原生质体培养的效果和再生植株的频率。研究发
现,AA基因组、CC基因组原生质体褐化轻,AACC基因组的褐化
重,推测可能是由于2个基因组互作的结果[8]。近年来,研究人员
应用各种物理和化学方法来降低褐化发生的频率,并取得了一
定的进展。原生质体在培养初期多采用暗培养或在弱光照下培
养,并定期加入新鲜培养液,在降低渗透压的同时对防止褐化也
起到一定的作用[3,7,9]。在形成小细胞团后可以把培养皿放置在摇
床上低转速振荡培养,以保证通气良好,防止原生质体粘连、褐
化[7,9]。在黄籽甘蓝原生质体培养[9]中加入50～100mg/L的VE对
抑制褐化有良好的效果。采用液固双层法时,由于有害物质被固
相培养物吸附,也有利于防止褐化的产生;而且在愈伤组织长到
1mm左右时应及时转入固体培养基进行增殖培养,长时间置于
液体培养基中会提高褐化发生的频率。
作为生长促进剂的芸薹素在青菜原生质体培养[3]中使用时,
没有提高分裂频率,但可以减缓褐化产生的速度。
1.5 植株再生
芸薹属的 3个基本种、3个复合种中,含有 A基因组的蔬菜
作物往往再生植株困难,而 C基因组则对原生质体再生植株有
利。但通过多年的努力,至今很多芸薹属作物都已建立了原生质
体再生体系。近年来许多含有 AA基因组的蔬菜,其分化再生植
株的研究成为研究的重点,同时也取得了一定的进展。
何龙飞[3]在对青菜下胚轴和根的原生质体进行培养时发现,
在培养基中添加 2～10mg/L6-BA、NAA和 IAA各 0～0.25mg/
L时,其各个组合诱导分化的效果均差别不大。获得了原生质体
再生的根且愈伤组织中有绿团的发生,但是没有分化成芽。不结
球白菜[5]愈伤组织经过增殖,接种在含有 6-BA和 NAA的分化培
养基上进行培养并获得再生植株,最佳激素组合为 10mg/L6-
BA、0.3mg/LNAA,其分化频率最高。
大白菜也属于 AA基因组,长期以来,它的分化和再生都较
为困难。赵军良等[6]在诱导其分化的培养基中加入 0.5mg/L的
TDZ和 3%的甘露醇,对愈伤组织的分化起到了一定的促进作
用。李世君等[8]还发现,在原生质体培养阶段,培养基中诸成分对
原生质体潜在的分化能力有影响。
2 原生质体培养在育种中的应用
2.1 原生质体融合
原生质体融合在一定程度上避开了有性繁殖时物种间的生
殖隔离障碍,还可以创造自然条件下无法实现的胞质杂种。特别
是由于芸薹属蔬菜中细胞质雄性不育基因的类型相对较少,发
现新的稳定不育源和利用现有的不育基因在种间或属间转移显
得尤为重要。所以原生质体融合技术,特别是非对称融合的相关
研究在近些年有不少报道。
2.1.1 原生质体的融合方法
聚乙二醇融合法 PEG具有一系列的分子量,显示不同的
水溶性。它能打乱细胞磷脂的双分子层,起到细胞黏合的作用,
而且它还可以引起膜表面电荷的紊乱来干扰细胞的识别,所以
可作为原生质体的融合剂。李昌功等[10]详细研究了 PEG介导的
融合法的具体操作对青菜与芥菜花粉-体细胞原生质体融合效
果的影响,认为先滴数滴PEG溶液于培养皿底,再各滴 1滴原生
质混合液在每滴PEG溶液之上,这种方法最有利于原生质体的
融合。原因主要是花粉和体细胞原生质体在大小和比重上有差
异,而这种方法使 2种原生质体在重力和张力的作用下,同时缓
慢地向周围扩散且一直处于PEG融合液之上,扩散运动中相互
接触的机会增多,使异源融合率得以提高。实验表明,20%～50%
的 PEG均能诱导融合,且随着 PEG浓度的提高异源融合率不断
提高。PEG与DMSO的配合使用也有利于原生质体的融合。最终
结果表明,40% PEG与10% DMSO配合使用能获得最佳的融合
效果。但在该次试验中高pH值/Ca2+法并没有提高融合率,反而
使部分原生质体破裂。
电融合法 电融合法是指将原生质体放在两电极之间,先
给两极通以交变电源,使原生质体沿着电极的方向排列成串珠
状,接着就给以瞬间的高强度电脉冲,使原生质体局部被损而导
致融合。该方法虽然比化学方法起步较晚,但由于操作简单、无
化学毒性、对原生质体损伤小,目前已被广泛应用[11,12]。对不结球
白菜的研究表明,它的电融合最适电场条件为:交流场强 20V/
cm,交变频率1500kHz,直流场强200V/cm,直流脉冲幅宽 40
μs,直流脉冲次数为3次[12]。
2.1.2 原生质体融合的应用 惠志明等[1]以甘蓝型油菜萝卜细
胞质雄性不育系无菌苗的叶肉原生质体为供体材料,经紫外线
辐射处理后,与花椰菜傲雪 1号(受体)的下胚轴原生质体进行
了REG介导的融合,共获得 68株再生植株,鉴定结果表明有 32
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株为杂种植株。
侯喜林等[12]为改善萝卜胞质不结球白菜雄性不育系苗期黄
化和蜜腺发育不良的性状,将 OguCMS下胚轴原生质体进行核
失活处理,将保持系子叶原生质体线粒体进行失活处理,两者经
原生质体融合后最终获得 8株再生植株,其中 3株不育,用保持
系授粉后从其中一株的后代中获得有 2株价值的杂交后代,即
表现完全不育、低温下叶片不黄化、有蜜腺。姚星伟[13]等应用PEG
融合法对花椰菜与表现多抗的野生种 Brassicaspinescens进行
非对称体细胞融合获得再生植株,为选育多抗的品种提供了育
种材料,经形态学、RAPD分子标记及同工酶等多种方法对再生
植株进行鉴定,发现其中有双亲融合产生的杂种植株,但不同鉴
定方法所得结论有差异。
除了依靠原生质体融合转移现有不育基因外,原生质体融
合本身也可以产生不育的融合杂种。Takeshi等[14]应用可育的卷
心菜和可育的萝卜,通过非对称原生质体融合获得了CMS卷心
菜,而且该 CMS卷心菜与红卷心菜回交 9次仍表现不育性。
RFLP分析表明,该不育品系的 mtDNA与 OguraCMS型存在高度
的结构相似性。推测可能是 Ogura型 atp6基因存在于正常可育
的卷心菜或萝卜中,只是以较低的复制水平存在而无法被检测。
但在细胞融合过程出现了mtDNA化学计量的转变,转变后 Ogu-
ra型atp6基因得到增加,最终使两者的杂交后代表现不育性。
2.1.3 杂种植株的鉴定方法 原生质体融合无可避免地会出现
同一亲本细胞间的融合,必须有严格的杂种鉴定方法才能筛选
出真正有价值的杂种细胞。近年来,鉴定的方法主要有形态学[3]、
RAPD[10]、RFLP[14]、同工酶、STS标记[7]等方法。由于不同的方法在
应用上都有其局限性,必须综合应用多种手段进行杂种植株的
鉴定,才能得到较为可靠的结论。
2.2 利用原生质体培养获得无性变异系
由于原生质体无细胞壁,对外界环境敏感,且在培养条件下
的代谢过程与在植株体内并不完全相同,所以在原生质体培养
过程中容易产生无性系的变异,为育种工作提供新的材料。熊新
生 [15]等早在1988年就在甘蓝原生质体再生植株中发现了二倍
体、四倍体,同时也发现有部分非整倍体。
2.3 利用原生质体培养进行遗传转化
利用原生质体导入外源基因不存在不亲和问题,且没有细
胞壁的障碍,便于进行遗传转化操作。杨仲南等[16]通过PEG介导
研究了外源GUS基因在花椰菜原生质体中的瞬间表达。薛红卫
等[17]将 GUS基因导人甘蓝下胚轴原生质体并获得转基因植株。
Eimert等用花椰菜叶肉原生质体,通过电激法转化得到了抗性
芽。Mukhopadhyal等用甘蓝下胚轴原生质体在PEG的介导下,直
接摄取了抗潮霉素标记基因的质粒 DNA,转化频率为 l0%～
33%,而且获得了转化再生植株[18]。
3 展望
近年来,芸薹属蔬菜原生质体培养和植株再生技术不断完
善,体细胞融合技术特别是非对称细胞融合技术日趋成熟,为芸
薹属蔬菜作物种间杂交和雄性不育等细胞质基因的转育提供了
技术保障,为蔬菜作物育种开辟了新的途径并加速了育种进程。
应用非对称细胞融合技术使芸薹属各种蔬菜作物获得稳定的不
育系来简化育种程序,通过遗传转化途径改良芸薹属蔬菜作物
品质、抗逆性、产量等性状是今后的重点研究方向。但原生质体
融合的杂种植株再生频率低,或体细胞杂种不育等问题也严重
制约着这一技术在育种中的应用,通过体细胞融合高效获得完
全可育的体细胞杂种也将是今后工作的重要方面。
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