全 文 ：农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2009,17 (3): 504~509
*基金项目：国家自然科学基金（No.30671429）和重庆市自然科学基金（No.9266）资助。
**通讯作者。Author for correspondence.教授，主要从事植物生物化学与分子生物学研究。E-mail:.
收稿日期：2008-06-03 接受日期：2008-07-07
·研究论文·
芸薹属 A基因组 DNA封阻下的甘蓝 C染色体组核型分析 *
陈晓丹,朱利泉 **,王 永,荣小营,卢 军,王小佳
（西南大学农学与生物科技学院，重庆 400716）
摘要：为探索一种高效可靠的芸薹属植物核型分析方法，以甘蓝（Brassica oleracea）和白菜（B.pekinensis）为材料，提取甘蓝
基因组 DNA用地高辛标记为探针，提取白菜基因组 DNA作为封阻剂，对甘蓝有丝分裂中期染色体进行原位杂交。结果表明，
甘蓝每对同源染色体上均显示出了特定的原位杂交信号，依据信号特征成功地将甘蓝 9对染色体进行了精细的分型。为甘蓝
等小型染色体的核型分析提供了一条可行且精确的方法。
关键词：甘蓝；白菜；基因组原位杂交；核型分析
中图分类号: S188 文献标识码: A 文章编号: 1006-1304(2009)03-0504-06
Karyotype Analysis of Brassica oleracea C Genome Based on
Brassica A Genomic DNA as Block Reagent
CHEN Xiao-dan, ZHU Li-quan**, WANG Yong, RONG Xiao-ying, LU Jun, WANG Xiao-jia
(College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716, China)
Abstract: To explore an effective and reliable karyptyping method in Brassica crop plants, karyptype of Brassica oleracea was
conducted successfully by genomic in situ hybridization using B.oleracea genomic DNA as probe labeled with DIG-High Prime Mix
Kit and B.pekinensis genomic DNA as block reagent. The results indicated that specific fluorescent signals were shown on each pair
of homologous chromosome and nine pairs chromosomes of B.oleracea were exactly identified according to signal characteristics. It
provided a feasible and accurate method to karyptype analysis of small chromosomes.
Key words: Brassica oleracea; Brassica rapa; genomic in situ hybridization; karyotype analysis
甘蓝是芸薹属的 3个基本种之一，是一种重要
的蔬菜作物，包括各种生态型及许多人工杂交品种，
无论是从进化角度还是育种角度考虑，均需要对其
进行各种细胞遗传学方面的研究。然而，由于甘蓝染
色体很小，而且在细胞分裂期的收缩程度较之其它
许多植物的染色体更高、更均一，因而准确鉴定其全
部染色体比较困难。
随着荧光原位杂交（fluorescence in situ hy-
bridization, FISH）技术的飞速发展，近年来采用
FISH技术进行甘蓝染色体的鉴定及核型分析工作
越来越普遍，大多依据 45S（或 25S）及 5S rDNA的
FISH信号的数目及在染色体上的位置来进行判断
（Snowdon et al., 1997; Hasterok et al., 2001）。
Kamisugi et al.（1998）利用 2个 cDNA探针及 rDNA
鉴定了甘蓝的 5对染色体，Armstrong et al.（1998）利
用 3个 DNA重复序列也只鉴定了 5对染色体，王
太霞等（2006）利用甘蓝 rDNA 及 Cot-1 DNA 鉴定
了甘蓝的 9对染色体。上述利用 FISH对甘蓝染色
体的鉴定均是借助 rDNA等重复序列作为探针，而
rDNA等重复序列在甘蓝染色体上的分布有限，只
在几条染色体上存在位点，FISH特征信号的不足难
免会增加核型分析工作的困难和结果的局限性。基
因组原位杂交（genomic in situ hybridization, GISH）
技术是由染色体原位抑制杂交（chromosome in situ
suppression CISS）衍生而来的一种重要的原位杂交
技术，现已成为植物分子细胞遗传学的重要研究手
段。广泛应用于物种的起源和进化、远缘杂种的鉴
定、外源染色质的检测、以及基因的功能与定位等研
究。植物基因组的差别主要源于它们的重复 DNA
序列的不同，而且植物基因组中都有高含量的专一
第 3 期 陈晓丹等：芸薹属 A基因组 DNA封阻下的甘蓝 C染色体组核型分析
重复序列（Schwarzacher et al., 1992）。因此以整个基
因组 DNA作为 FISH探针，以适当浓度的近缘种基
因组 DNA进行封阻，在靶染色体上进行原位杂交
时，优先与靶染色体上共有保守序列杂交，剩下的高
含量的特异性序列主要被标记探针所杂交。由于植
物基因组中专一重复序列的高含量及在每条染色体
上分布的不同，因而在各条染色体上会呈现足够的
且各具特征的 GISH信号。根据每条染色体上具体
的杂交信号的数目、强弱和位置等信号特点可以较
为容易的区分鉴定各条染色体。
本研究采用上述 GISH 技术，以甘蓝基因组
DNA为探针白菜基因组作为封阻剂，对甘蓝的 9对
染色体进行区分鉴定和精细分型，以期克服 rDNA
等重复序列为探针的 FISH特征信号不足和结果的
局限性，探索出一种更为准确可靠的核型分析方法，
为甘蓝等小而均一的染色体组的系统分型提供一条
可行且精确的方法。
1 材料和方法
1.1 实验材料
自交不亲和甘蓝（Brassica oleracea）K-164，由西
南大学农学与生物科技学院农业部作物品质改良重
点开放实验室提供；白菜（B.pekinensis），由西南大
学园林园艺学院甘蓝育种研究室提供。
用水培法培养甘蓝和白菜幼苗 10 d左右，收获
黄化苗，经液氮速冻后，将其放置于-80℃冰箱中保
存，用于提取基因组 DNA，以备合成探针和封阻剂
之用。
1.2 染色体制备
染色体制备参考李懋学等（1985）的方法并稍加
改进。采用避光变温条件培养根尖，待根尖长度为
1~2 cm时剪根、8-羟基喹啉溶液预处理、ddH2O洗
净、固定液固定、前低渗、2%纤维酶和 2%果胶酶 37
℃酶解、后低渗等步骤后，采用火焰干燥法制片，于
-60℃冰箱保存备用。
1.3 探针及封阻剂的制备
采用 CTAB法提取甘蓝和白菜的基因组 DNA
（朱利泉等，2000）并进行纯化，甘蓝基因组 DNA经
酶切后采用随机引物法用地高辛标记为探针，白菜
基因组 DNA作为封阻剂。
1.4 基因组原位杂交
1.4.1 制片的预处理 保存的片子冰冻脱片，脱水
干燥后，用 100 μg/mL RNase于 37℃温育 1 h，2×
SSC漂洗，70%、90%和 100%（V/V）乙醇依次脱水，
气干片子备用。
1.4.2 原位杂交 将染色体制片在 70%去离子甲
酰胺中 70 ℃预变性 2 min，立即用-20 ℃预冷的
70%、90%和 100%（V/V）乙醇依次脱水，风干片子；
杂交液（100%去离子甲酰胺、50%硫酸葡聚糖、探
针、20×SSC、鲑鱼精 DNA、封阻 DNA和 SDS）在 85
℃预变性 10 min，立即放在冰上；每片加杂交液 30
μL，盖上盖玻片，85℃共变性 10 min，于 37℃保湿
盒内恒温杂交过夜。
1.4.3 杂交后洗脱与信号的检测 杂交后洗脱，37
℃条件下 2×SSC中漂洗 10 min、4×SSCT中漂洗 8
min，25℃条件下 1×PBS中漂洗 5 min，风干。在避
光的条件下，向每个杂交过后的载玻片加检测液 30
μL，加盖盖玻片，放置于湿盒内，37℃温育 30 min，
洗脱后风干。向每个制片上加 20 μL 2 μg/mL 的
DAPI染料，于 37℃复染 30 min，洗脱后风干，然后
加抗淬灭剂封片。
1.4.4 图像收集和处理 用 Nikon 公司 ECLIPSE
E600 荧光显微镜镜检，DIGITAL SIGHT DS-U2
CCD对图像进行捕捉和收集，使用 NIS-Elements
编号 绝对长度 /μm Absolute length 相对长度 /% 相对长度系数 类型
No. 总长度 长臂 短臂 臂比 Relative length Coefficient of relative length Type
Total Long arm Short arm Arm ratio
1
2
3
4
5
6
7
8
9
6.25
4.73
4.43
4.21
3.82
3.59
3.44
3.03
2.76
3.72
2.98
2.86
2.82
2.54
2.32
2.10
1.92
1.60
2.53
1.76
1.57
1.39
1.28
1.27
1.35
1.11
1.16
1.47
1.70
1.82
2.03
1.98
1.84
1.56
1.72
1.39
10.25+6.98=17.23
8.21+4.84=13.05
7.88+4.32=12.20
7.78+3.84=11.62
7.00+3.53=10.53
6.40+3.49=9.89
5.79+3.71=9.50
5.29+3.07=8.36
4.41+3.19=7.60
1.55
1.17
1.10
1.05
0.95
0.89
0.85
0.75
0.68
m
m
sm
sm
sm
sm
m
sm
m
表 1甘蓝的核型分析
Table1 Karyotype analysis of Brassica oleracea
505
农 业 生 物 技 术 学 报 2009 年
BR 2.20和 photoshop7.0软件对图像进行分析处理。
2 结果和分析
2.1 甘蓝根尖中期染色体的核型分析
采用李懋学和陈瑞阳（1985）的植物核型分析标
准进行核型分析。本实验采用了卡宝品红和 DAPI
两种染色方法（图 1），共统计 10个中期细胞的染色
体相应参数值（表 1）。
图 2.甘蓝染色体核型模式图
Fig. 2. The idiogram of Brassica oleracea
甘蓝为同源二倍体，染色体数为 9对 18条，从
表 1和图 2可以看出，该典型自交不亲和甘蓝有丝
分裂中期染色体表现出的特征为：①最长染色体与
最短染色体的长度差别很大，最长染色体与最短染
色体的长度比达到 2.3∶1，这与漆红艳（2006）的实验
结果基本一致，借助第 1对染色体特有的长度优势
可以很容易地将它与其它染色体区分开来；②1号、
2号、7号和 9号染色体臂比在 1.70以下，为中部着
丝粒染色体，3~6号和 8号染色体臂比在 1.71~3.00
之间（4号染色体的臂比大于 2），为近中部着丝粒染
色体，其核型公式为 2n=2x=18=4m+5sm；③1 号染
色体相对长度系数大于 1.21，为长染色体，2~4号染
色体相对长度系数在 1.01~1.21之间，为中长染色
体，5~8号染色体相对长度系数在 0.71~0.99之间，
为中短染色体，9号染色体相对长度系数小于 0.70，
为短染色体；④从表 1中还可以看出，每对染色体的
相对长度值与 Armstrong et al.（1998）提出的标准是
很相近的，说明实验的结果是真实可信的；⑤3号与
4~7号染色体长度相近，难于区分。同源染色体之间
的配对参见图 1,a和 1,b。
2.2 甘蓝中期染色体的 GISH分型
提取甘蓝和白菜基因组 DNA，纯化后甘蓝基因
组 DNA用 HindⅢ、EcoRⅠ酶切，酶切后电泳结果
表明，多数 DNA分子被切成 500~10 000 bp的片段
（图 3）。该长度达到 Roche公司 DIG标记相关试剂
盒的要求，可用于标记。纯化后的白菜基因组 DNA
图 4染色体
序号
Fig 4. No.
of Chromosome
1
2
3
4
5
6
7
8
9
杂交信号数 /个
Numbers of
hybridization
signals
2
2
3
1
1
1
2
1
3
杂交信号特征
Characteristics of hybridization signals
一信号点位于长臂，一信号点位于短臂，且两信号点一强一弱。
Signals were strong on long and weak on short arm, respectively.
两个很弱的信号点靠近长臂的臂端。
Signals near to the edge of long arm were both very weak .
两条染色体的长臂对应位置都有 3个明显的信号点。
There were three strong hybridization signals on long arm.
信号点位于染色体短臂的臂端。Signal was on the edge of short arm.
信号点很弱，位于短臂上。Signal was very weak, on short arm.
信号点靠近染色体的中部。Signal was near to the middle of chromosome.
一信号点位于长臂，一信号点位于短臂，且长臂上信号点靠近着丝点，
短臂上信号点靠近短臂端。
Signals were respectively on long (near to centromere) and short arm
(near to the edge of short arm).
信号点位于染色体短臂的臂端。Signal was on the edge of short arm.
3个很弱的信号点，位于染色体中部。
There were three weak hybridization signals in the middle of chromosomes.
相对长度 /%
Relative
length
14.98
13.17
12.67
10.79
10.78
10.12
9.60
9.28
8.60
臂比
Arm
ratio
1.52
1.69
1.82
2.14
1.89
1.79
1.37
1.72
1.42
表 2基因组原位杂交分型的甘蓝染色体特征
Table2 Chromosomal characteristics for karyotype analysis of B.oleracea by GISH
506
第 3 期 陈晓丹等：芸薹属 A基因组 DNA封阻下的甘蓝 C染色体组核型分析
测定浓度后直接作为封阻剂使用。
通过一系列条件的探索，最终确定并得到了最
佳条件下的基因组原位杂交分型结果。分型主要是
根据染色体上杂交信号的数目、位置和强弱不同，区
分甘蓝的各条染色体（图 4）。图 4,A、B中的染色体
分散良好、充分暴露、重叠粘连程度低，染色体上信
号清晰。从图 4和表 2归纳可以很清楚
地看到每对同源染色体上的信号特征：1
号、2号和 7号染色体上都有 2 个信号
点，但它们的位置和强度都不尽相同，1
号染色体上的信号强，2 号染色体上的
信号很弱；3号和 9 号染色体上各有强
弱很明显的 3 个信号点；4~6 号和 8 号
染色体上都有 1个信号点，虽然 4号和
8号染色体上的信号点都位于染色体短
臂的端部，且强度相近，但是二者长度上
的差异可以很明显的将二者进行区分。
由以上每对同源染色体的特征可以很明
确的将甘蓝的染色体进行精细的区分。
根据李懋学和陈瑞阳（1985）的传统
方法，对图 4, A、a中染色体进行各参数
的统计计算，所得染色体相对长度和臂
比等相关参数与之前统计所得结果相
近，结果如表 2，故更确定了这个杂交分
型结果的可靠性。相比较而言，GISH分型方法更为
合理、精确。
3 讨论
基因组原位杂交（GISH）技术在植物中有着广
泛的应用。目前，研究者已经利用 GISH技术成功辨
图 1.甘蓝中期染色体与核型
Fig.1. Chromosomes and karyotype at metaphase of Brassica oleracea
A, a.卡宝品红染色; B, b. DAPI复染。
A, a. Carbol fuchsin staining; B,b. DAPI counterstaining.
图 3.甘蓝和白菜基因组 DNA及甘蓝酶切后
基因组 DNA的电泳检测
Fig.3. The agarose gel electrophoresis of
genomic DNA from B.olereacea and
B.peknensis and B.olereacea genomic DNA
digested by restriction enzymes
M1,λDNA/HindⅢ marker; 1,甘蓝基因组 DNA;
2,白菜基因组 DNA; 3,甘蓝基因组酶切;
M2,DL2000+ DNA marker.
M1, marker λDNA/HindⅢ; 1, genomic DNA of
B.olereacea; 2, genomic DNA of B.peknensis;
3,B.olereacea genomic DNA digested by restriction
enzymes; M2, DL2000+ DNA marker.
图 4.甘蓝基因组原位杂交核型分析
Fig. 4. Karyotype analysis of B.oleracea by GISH
A. DAPI复染（紫外光激发）; B.蓝光激发,箭头指示染色体上信号; a,b.甘蓝核型图。
A. DAPI counterstaining (irradiation with ultraviolet light); B. Irradiation with blue light，
arrows indicate single on chomosome; a, b. Karyotype of B.oleracea.
507
农 业 生 物 技 术 学 报 2009 年
别了芸薹属异源四倍体 AA、BB 和 CC 基因组，探
讨了 AA、BB和 CC基因组之间的关系（李宗芸等，
2002），研究了甘蓝基因组与芸薹属其它 5个近缘物
种基因组间的相互关系（李宗芸等，2003），并利用
GISH技术对与芸薹属亲缘关系近的物种与芸薹属
作物属间杂交种进行了分析研究（李再云等，2002；
朱旺升等，2005；程雨贵等，2006；陈洪高等，2006），
确立了远缘杂交在作物遗传改良中的重要作用。本
研究以 C基因组 DNA作为探针，A基因组 DNA作
为封阻剂，在甘蓝（C基因组）有丝分裂中期染色体
上进行 GISH，成功地将典型自交不亲和甘蓝 9对
同源染色体明显区分开，实现了对甘蓝根尖中期染
色体精确鉴定的研究。本研究虽然是首次采用基因
组原位杂交的方法区分芸薹属甘蓝的染色体，但其
原理同以上的研究一样，都是根据碱基互补配对原
则，选用特定的探针、封阻剂，通过杂交后染色体上
的杂交信号来进行分析，得出结论。本研究主要是根
据杂交信号的数目、位置和强弱将染色体进行区分，
同源染色体上具有相同的信号特征即其上的信号数
目、强度和位置相同，可准确将同源染色体进行配
对，并且每对同源染色体上具有独特的信号特征，能
将其与其它同源染色体进行明确的区分，避免了传
统方法测量过程中的误差，很好地克服了前人 FISH
方法中以 rDNA做探针的局限性。研究结果证明，此
方法合理、可行，并且效果明显，达到了精确分型的
目的。对此分型方法进行重复实验发现，几次杂交结
果除了个别同源染色体信号点的位置和强度稍有不
同外，它们的多数基本特征都是相同的，说明该方法
具有可重复性，是可行的。该技术方法简单有效，且
便于在其它物种推广应用，因此，可望在小型染色体
的核型鉴定方面发挥重要作用。
生物从共同原始祖先逐渐分化为现有各物种的
进化过程中，都要伴随着基因组大小、基因数目和
DNA序列的不断变化。基因组的进化是漫长而复杂
的过程，虽然至今人们还没有完全弄清楚其进化的
具体过程和机制，但目前已经普遍认为广泛存在的
点突变和插入 /缺失突变是基因组进化的重要驱动
力（陈玲玲等，2006）。插入或缺失一段 DNA片段不
仅可以像碱基突变那样造成基因组的多态性，甚至
还可以通过原基因外显子和内含子上的插入或缺失
使基因结构发生变化，而导致基因组中新基因的产
生（Long et al., 2003）。在白菜 A基因组中，有 71%
以上的两个位点之间间隔大于甘蓝 C基因组，说明
甘蓝和白菜在各自进化过程中发生了缺失或插入现
象，从而形成不同的间隔长度，导致了二者的分异。
基因组序列含有基因和非基因序列，基因序列在生
物进化中发生着突变，非基因序列也同样发生突变，
而且非基因序列累计突变的速度比基因要快得多，
故整个基因组序列在 A、C之间的变异比预期的更
大。虽然如此，但比较基因组作图分析（Lagercrantz
and Lydiate, 1996）表明，A、B和 C基因组的基因内
容是基本相同的，具有高度的保守性。但在长期的进
化过程中，染色体可能发生融合、分裂以及染色体片
段的重复、易位和重排，从而导致它们含有不同的染
色体结构。前人的研究（Warwick and Black, 1991;
Song et al., 1988; Axelsson et al., 2000）还表明 A、C
基因组较为接近，基因组间同源性较高。李宗芸等
（2002; 2003）的研究也表明 C与 A基因组间存在着
高度的同源性，亲缘关系较近，基因组的分异程度较
小。以 S位点基因 SRK和 SLG为例，在 GenBank
里分别搜索甘蓝（CC）和白菜（AA）的 SRK和 SLG
基因序列以及 SRK mRNA 序列各 10 条，利用
Blastn及 Vector软件对所查到的序列进行核酸序列
比对。通过两个物种 SRK和 SLG基因的核酸序列
比对可以看出，虽然在长期进化过程中个别的碱基
发生了突变，但是整体上二者中的这两个基因序列
还是很保守的，一致率达到了 50%以上，而相似率
达到了 90%以上。故由二者的核酸比对可知，用白
菜的 SRK和 SLG基因可封阻甘蓝的 SRK和 SLG
基因。
由此可知，由于 A与 C基因组之间存在着高度
的同源性，所以保证了用白菜封阻甘蓝时，封阻
DNA优先与甘蓝染色体上的同源部分杂交，二者同
源的大部分片段结合；而二者的分异又保证了甘蓝
的特异位点能裸露出来，被标记探针所杂交，由此在
甘蓝的染色体上得到不同的杂交信号，A与 C基因
组的同源性与分异性充分的说明了这种封阻作用的
合理性与可行性。封阻剂片段的大小对其封阻的效
率有很大的影响，理论上可知片段越大，其对被测植
物封阻的概率会越低，而片段小，其与被测植物染色
体结合的机率越大，封阻效率越高，研究表明（陈洪
高等，2006；李再云等，2002），封阻剂多采用沸水煮
的方法，随机打断，片段大小多在 200~500 bp，可达
到很好的封阻效果。在本实验中，提取的白菜基因组
DNA经纯化后直接作为封阻剂，实验结果表明，虽
然白菜 DNA未经过处理，但由于甘蓝和白菜的同
源性很高，所以只要调整好封阻与探针的比例，也达
到了很好的封阻效果。
508
第 3 期 陈晓丹等：芸薹属 A基因组 DNA封阻下的甘蓝 C染色体组核型分析
参 考 文 献
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