全 文 ：芸薹属基本种 45S rDNA重复序列的染色体定位
张永泰1 , 孔　芳2 , 李爱民1 , 王幼平3＊
(1 .江苏里下河地区农业科学研究所 , 江苏 扬州 225007;2.安徽工程大学 生物与化学工程学院 , 安徽芜湖 241000;
3.扬州大学生物科学与技术学院 , 江苏扬州 225009)
摘　要:用 45S rDNA 作探针 ,对芸薹属 3 个二倍体种(白菜型油菜 、甘蓝和黑芥)进行有丝分裂和减数分裂的原位杂交
分析 ,发现在白菜型油菜的 20条染色体中有10条 、黑芥 16 条染色体中有 6 条 、甘蓝 18 条染色体中有 4 条染色体上存在
杂交信号。其中白菜型油菜和黑芥的减数分裂为首次报道 ,研究结果对研究芸薹属二倍体基因组 A 、B 或 C 的亲缘关系
以及基因组间的相互进化关系有一定的意义。
关键词:芸薹属;重复序列;原位杂交;染色体定位
中图分类号:Q 813.4　　　　　　文献标志码:A　　　　　　　文章编号:1671-4652(2011)01-0010-04
Chromosomal localization of 45S rDNA in Brassica diploids
ZHANG Yong-tai1 , KONG Fang2 , LI Ai-min1 , WANG You-ping3
(1.L i xiahe Agric Res Inst of J iangsu P rov , Yangzhou 225007 , China;
2.Coll of B io and Chem Engin , Anhui Poly tech Univ , Wuhu 241000 , China;
3.Coll of B iosci and Biotech , Yangz hou Univ , Yangzhou 225009 , China)
ABSTRACT:The position and numbe r of 45S rDNA on mitotic and meio tic chromosomes o f the three basic diploid species
(Brassica rapa , B.oleracea and B.nigra)w ere de tected by fluo rescence in situ hybridiza tion(F ISH)analysis using 45S
rDNA as probe.Ten out o f 20 chromosomes can be ea sily identified in B.rapa , six out of 16 in B.nigra , and four out o f
18 in B.oleracea.Among them , meio tic FISH analy sis of 45S rDNA of B.rapa and B.ni gra w as repo rted for the first
time.These investig ations ar e useful fo r identifying the chr omosomes o f g enome A , B and C and studying the evolution
and phy lo geny o f the B rassica genomes.
KEY WORDS:Brassica;repea t sequence;FISH ;chromosomal lo calization
芸薹属(B rassica)是十字花科植物中较大且具有重要经济价值的属。组成芸薹属 3个二倍体种
(白菜型油菜 , B.rapa , 2n=20 , AA ;黑芥 , B.nigra , 2n=16 , BB;甘蓝 , B .oleracea , 2n=18 , CC)
和 3个异源四倍体种(甘蓝型油菜 , B.napus , 2n =38 , AACC;芥菜型油菜 , B.juncea , 2n=36 ,
AABB;埃塞俄比亚芥 , B.carinata , 2n=34 , BBCC)之间的关系被称之为禹氏三角[ 1] 。大量试验表
明 , 3个异源四倍体物种分别由各自不同二倍体种相互杂交通过自然选择后进化而来[ 2-3] 。芸薹属植物
的染色体较小(1.5 ～ 4.5 μm),染色体结构比较对称 ,按照传统的细胞学标准来准确区分其全部染色体
比较困难[ 2 , 4] 。近年来采用 FISH(fluo rescence in situ hybridization)技术进行芸薹属染色体的鉴定及
核型分析工作越来越普遍 ,大多依据 45S(或 25S)及 5S rDNA 的 FISH 信号的数目及在染色体上的位
置来进行判断[ 2 , 4-6] 。减数分裂粗线期采用 FISH 技术进行检测 ,不仅能直接标示出减数分裂不同构型
染色体的性质 、来源 , 而且染色体构型图像更清晰 、立体感强[ 5] 。在芸薹属作物上 ,利用 FISH 杂交技
术分析 A 、B和 C 基因组间的亲缘关系的研究已有报道[ 7-8] , 但少有关于减数分裂期这方面报道 。本研
收稿日期:2010-12-18
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30671166)
作者简介:张永泰(1964-　), 男 , 江苏兴化人 , 江苏里下河地区农业科学研究所研究员 , 主要从事油菜遗传育种研究。
＊联系作者 , E-mail:w angyp@yzu.edu.cn
第 32 卷第 1 期 扬州大学学报(农业与生命科学版) Vo l.32 No.1
2011 年 3 月 Jou rnal of Yangzhou University (Agricul tu ral and Li fe S cien ce Edit ion) Mar.2011
究以芸薹属的 3个二倍体材料 ,在花粉母细胞减数分裂粗线期和根尖体细胞中期利用 FISH 技术研究
重复序列 45S rDNA 在染色体上的分布及多态性 ,并对其位点进行定位 ,旨在为研究 A 、B 、C基因组间
的亲缘关系和进化提供依据。
1　材料与方法
1.1　植物材料
试验用种子 B.rapa var.chineses L.(基因组 AA , 2n=20)、B.oleracea var.botry t is L .(基因组
CC , 2n=18)和 B.nigra (L.)Koch(基因组 BB , 2n=16)均为本课题组保存的种质资源。
1.2　染色体制片
不同材料的种子放在湿润滤纸上 25 ℃下发芽 ,待根长至 2 ～ 3 cm 时用 2 mmol· L-1 8-羟基喹啉
25 ℃处理2 h 、4 ℃处理 2 h ,再用乙醇-冰醋酸(体积比为3∶1)固定液固定 24 h 。制片前先用蒸馏水冲
洗根尖2 ～ 3次 ,洗去残留的固定液。用 20 g ·L-1纤维素酶 、20%果胶酶混合酶液 37 ℃处理根尖 2 h 。
接着用75 mmol·L-1 KCl低渗溶液处理 45 min ,取单个根尖置于预冷的载玻片上 , 60%冰醋酸分散
细胞 。最后用预冷的固定液进行展开 ,晾干。Olympus相差显微镜镜检 ,筛选出染色体分散良好的玻
片 ,置于-20℃冰箱中保存。
1.3　探针的标记
含有 18S-5.8S-25S (45S)rDN A的克隆 PTa71来自小麦 ,由英国 T rude Schw arzacher 博士惠赠。
45S rDNA 探针采用地高辛-11-dUT P 经缺口平移法进行标记 , 按照试剂盒(Catalogue No.
11745816910 , 美国 Roche 公司)说明书进行。
1.4　原位杂交
染色体制片上加 200 μL 去离子甲酰胺 , 80 ℃变性 10 min;接着玻片进行乙醇梯度脱水(70%※
90%※100%),空气晾干;每张制片用 30 ～ 40μL 杂交液(含 500 mg ·L-1去离子甲酰胺 , 100 mg ·L-1
硫酸葡聚糖), 加入 10μL 标记的探针 、0.5 μL 变性的鲑鱼精子 DNA 和 5μL 20×SSC 。加盖玻片 ,封
片。80 ℃变性 10 min , 置保湿盒中 37 ℃杂交过夜 , 杂交后制片 , 经 2×SSC 、0.4×SSC在 40 ℃条件
下各冲洗 2次。
1.5　信号检测和图像处理
按照试剂盒说明书进行杂交信号的放大和标记 。每张制片用 10 μL PI (Propidium iodide)复染。
使用 Olympus BX51荧光显微镜观察染色体和杂交信号 ,对于分散较好的细胞用不同的滤光片进行拍
照 ,以 Image-Pro Plus Version 5.0软件进行图片合成和处理。
2　结果与分析
用地高辛-11-dUTP 标记的 45S rDNA ,经抗地高辛的抗体 FITC 检测后呈现黄色荧光 ,可清楚地
发现 45S rDNA 所在染色体的杂交信号(图 1 , 见封 3)。在白菜型油菜(B .rapa)有丝分裂中期染色体
的 FISH 检测中 ,清晰可见 10条染色体上有 45S rDNA 的杂交信号(图 1.A),其中杂交信号在着丝粒
和亚着丝粒区域特别突出 ,信号明显而强烈 ,在减数分裂粗线期或中期 I中 ,形成 5对二价体 ,其中 4个
二价体黄色杂交信号沿染色体全长分布 ,几乎覆盖整条染色体(图 1.B 、1.C)。在黑芥(B.nigra)中 ,可
清晰地发现 6条染色体上存在杂交信号(图 1.D),在减数分裂后期 I中 ,6个信号位点平均分配到细胞
两极(图 1.E)。在黑芥的有丝分裂与减数分裂中 ,45S rDNA 信号位点主要分布在染色体短臂的近末
端处 。甘蓝(B .oleracea)中的 45S rDNA 杂交位点与 B.nigra中类似 ,均位于染色体短臂的近末端处
(图 1.F),其中 3条染色体上的杂交信号很强烈 ,另一条染色体上的信号较弱 ,可能是 rDNA 重复序列
拷贝数较少的缘故 ,在减数分裂中期中有 2对明显的二价体杂交信号排列在赤道板上。
3　讨论
45S rDNA 通常参与核仁的形成 ,故常将 45S rDNA 位点称为核仁组织区(NOR), 这一功能片段
11第 1 期 张永泰等:芸薹属基本种 45S rDNA 重复序列的染色体定位
在有丝分裂细胞中多定位在随体染色体上或次缢痕中。也有研究[ 9] 发现 , 45S rDN A 定位在着丝粒至
短臂的区域或染色体长臂末端的区域 ,甚至出现杂交信号数目成奇数的情况 。迄今为止 , 利用 45S
rDNA与 5S rDNA 定位报道较多[ 2 , 4 , 10] , 但利用 rDNA 作为染色体识别标记尚存在致命缺点 ,因为
rDNA等重复序列在物种的染色体上分布有限 ,只在部分染色体上存在且其座位具有不稳定性[ 11] 。此
外 , 由于芸薹属植物的染色体很小 ,相邻染色体形态非常相似 , 再加上长短臂异染色质含量不同 ,染色
体在有丝分裂中期浓缩程度的不同 , 使得单个染色体的鉴别不能准确确定。为了更精确地鉴定其染色
体 , 研究人员采用了多种技术手段 ,如采用 BAC克隆作探针进行 FISH 检测并结合连锁图谱与物理图
谱进行相关基因的定位[ 8] ;也有研究采用[ 12] 原位 DNA 多聚酶链式反应鉴定芥菜型油菜 B.juncea中
的 B基因组染色体 ,并结合GISH 和 FISH 准确区分出B .j uncea中的 A 与B基因组的染色体[ 13] ;Koo
等[ 5]利用减数分裂前期的粗线期染色体的长度是有丝分裂中期 17.5倍的原理 ,在普通光学显微镜下将
FISH 分辨率水平相应提高 10 ～ 15倍[ 5] 。
本研究根据 45S rDNA 在有丝分裂与减数分裂中的杂交信号的数目 、位置和强弱等发现芸薹属作
物中 A 基因组信号主要集中在近着丝粒区域 ,且具有多态性 ,在其他区域信号很弱 ,这与以往的报道结
果基本一致[ 2 , 4 , 6 , 10] 。本研究中 , 白菜 45S rDNA 重复序列分布在染色体亚着丝粒区域 ,易于杂交 ,而染
色体末端区域富含低或单拷贝序列 ,不易与探针杂交;而 B 、C 基因组上 45S rDNA 主要集中于染色体
短臂末端 ,这与 Haste rok等[ 14] 结果一致。本研究中甘蓝减数分裂期 45S rDNA杂交位点只有2对 , 而
Maluszynka等[ 13] 在甘蓝减数分裂期检测到第 3个很弱的信号 ,S nowdon 等[ 15] 在不足 10%的细胞分裂
间期中也观测到这个很弱的信号 。此外 Armstrong 等[ 7] 、Howell等[ 8] 在甘蓝的减数分裂粗线期或中
期 I中观察到有 3对信号。本研究与这些研究结论有些出入 ,究其原因可能是来自于甘蓝材料的差异 、
技术手段的不同以及 FISH 检测效果的敏感度不同等。此外 , A与 C 基因组间有明显差异的重要原因
在于 C 基因组的染色体臂末端上可能分布着一部分重复序列 ,而 A 基因组的染色体臂分布则很少 ,这
表明芸薹属作物基因组 A 与 C 间虽具有高度的同源性[ 2] ,但在各自进化过程中发生了点突变和插
入/缺失突变现象 ,甚至还可能出现通过原基因外显子和内含子上的插入或缺失使基因结构发生变化 ,
从而导致基因组中新基因产生的现象[ 16] 。在白菜 A 基因组中 ,有 71%以上的 2 个位点之间间隔大于
甘蓝 C基因组 ,说明甘蓝和白菜在各自进化过程中发生了缺失或插入现象 ,从而形成不同的间隔长度 ,
进而导致了两者的差异。
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(责任编辑　王子斌)
(上接第 9面)
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(责任编辑　王子斌)
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