全 文 ：基于 ITS 序列探讨南瓜属植物系统发育
吴宇芬1 , 周先治1 , 陈　晟1 , 陈　阳1 , 赵依杰2
(1.福建省农业科学院农业生物资源研究所 , 福建　福州　350003;
2.福建省福州市农业科学研究所 , 福建　福州　350018)
收稿日期:2010-01-05初稿;2010-04-01修改稿
作者简介:吴宇芬 (1965-), 女 , 副研究员 , 主要从事西瓜 、 甜瓜及砧木新品种选育与栽培技术研究
通讯作者:周先治 (1976-), 男 , 助理研究员 , 博士 , 主要从事生物资源研究(E-mai l:xianzhizh ou@126.com)
基金项目:福建省科技计划重点项目 (2007I0037);福建省自然科学基金项目 (2009J01069)
摘　要:基于 ITS 序列对南瓜属 3个种 (中国南瓜 、 美洲南瓜和黑籽南瓜)的系统发育进行了研究。 结果表明 ,
ITS1 全长 188 ～ 191 bp , ITS2 全长 251 ～ 263 bp;南瓜 ITS1 序列的变异位点数为 33 , 占 ITS1 全序列的
17.55%, ITS1 序列的信息位点数为 24 , 占 ITS1全序列的 12.77%;南瓜 ITS2 序列的变异位点数为 45 个 , 占
ITS2 全序列的 17.93%, ITS2 的信息位点数为 31 个 , 占 ITS2 全序列的 12.35%;ITS1 的 G+C 含量变化范围
为 51.60%～ 54.50%, ITS2的 G+C 含量变化范围为 53.78%～ 56.98%;基于 ITS1和 ITS2 分别构建的系统树
可以看出 , 中国南瓜和美洲南瓜的亲缘关系较近 , 与黑籽南瓜的亲缘关系较远。
关键词:rDNA;内转录间隔区;南瓜属;系统发育
中图分类号:S 642 文献标识码:A
Phylogeny of Cucurbi ta Based on ITS sequence data
WU Yu-fen1 , ZH OU Xian-zhi1 , CHEN Sheng 1 , CH EN Yang1 , ZH AO Yi-jie2
(1.Agricultural Bio-resources Research Institute , F ujian Academy o f Agricultural Sciences , F uz hou , Fuj ian
350003 , China;2.Fuzhou Institute o f A gricuhural Sciences , Fuz hou , Fu jian　350018 , China)
Abstract:The relationships and differ ences among the specie s , moschata , pepo and f ici f of ia (Cucurbitaceae:
Cucurbita), w ere examined using data from the inte rnal transcribed spacer (ITS) region o f the nuclear ribosomal
DNA.The ITS sequences we re obtained from moschata , pepo and f ici f o f ia 3 species. The results showed that ,
within Cucurbita , ITS1 was 188-191bp(C.moschata , C.pepo and C. f ici fo f ia)and ITS2 ranged fr om 251-
263bp(C.moschata , C.pepo and C. f ici f o f ia).There w ere 33 va riable positions(17.55%)and 24 info rmativ e
sites (12.77%)w ithin Cucurbita found in the ITS1 sequence s , while 45 variable po sitio ns (17.93%) and 31
informa tive sites (12.35%)fo und in the ITS2 sequences.The G+C content of ITS1 w as 51.60% to 54.50% and
tha t of ITS2 ranged from 53.78% to 56.98%.The resulting trees fr om the ITS1 and ITS2 sequences show ed that
the relationship between C.moschata and C.pepo w as closer than that be tw een C.moschata and C. f ici fo f ia.
Key words:Ribo somal DNA (rDNA);Internal transcribed spacer(ITS );Cucurbita;phylog eny
　　南瓜原产于南美洲 ,后传入我国 ,为一年生蔓生
草本植物 。南瓜种质资源十分丰富 ,所含物种数量
超过芸苔属(B rassica)和番茄属(Lycopersicon)。
南瓜属包含 5 个栽培种:中国南瓜 (Cucurbi ta
moschata)、 美 洲 南 瓜 (C.pepo)、 印 度 南 瓜
(C.max ima)、 灰籽南瓜 (mix ta)和黑籽南瓜
(C.f ici f of ia)。除栽培种之外 , 南瓜属至少包括
12个野生种[ 1] 。这些种之间的遗传基础 、 亲缘关
系极为复杂。已有学者采用同工酶[ 2] 、 RA PD
(Random Amplif ied Polymorphic DNA , 随机扩增
多态性 DNA)[ 3-6] 、 AFLP (Amplif ied Fragment
Leng th Polymo rphism , 扩增片段长度多态性)[ 7] 、
SSR (Simple Sequence Repeat , 简 单 序 列 重
复 )[ 8] 、 SRAP (Sequence-Related Amplif ied
polymorphism , 相关序列扩增多态性)[ 9] 等技术进
行了南瓜属植物遗传多样性研究 , 表明南瓜属植物
遗传多样性丰富 , 也揭示了南瓜属不同种间亲缘关
系的远近。
真核生物核糖体内转录间隔区 ITS (Internal
t ranscribed spacer)(18S-5.8S-26S)所受的选
择压力小 , 与编码区相比 , 进化速率较快[ 10] 。与
RA PD 、 AFLP 、 SSR和 SRA P 等技术相比 , 采用
福建农业学报 25(2):170 ～ 175 ,2010
F ujian Journal o f Agricultural Sciences
文章编号:1008-0384 (2010)02-170-06
ITS构建系统发育树 , 具有省时 、 省工和结果更加
可靠等优点。在被子植物中 ITS 作为 18S 至 26S
的一部分高度重复 , 而且又有高度变异性和长度上
的保守性 ,被子植物大多数科属其 ITS 序列的种间
差异值为 1.2%～ 10.2%,属间差异值为 9.6%～
28.8%[ 11] 。这不仅为 PCR扩增产物直接测序奠定
了理论基础 ,而且很容易在近缘类群间排序 ,比较适
合用来研究植物的系统发育。因此 ,真核生物细胞
基因组中内转录间隔区序列可以作为一种遗传标
记。 ITS是最常用作属 、种 、种下水平遗传分析的片
段 ,截至 2010 年 4 月在 GenBanK 中各种生物的
ITS序列超过 640 000条[ 12] 。该片段已成功应用于
杜鹃属[ 13] 、睡莲属[ 14] 、益母草类[ 15] 、杨属[ 16] 、桑
属[ 17]等植物物种亲缘关系及系统发育研究 。本研
究比对分析了不同来源 、不同品种的南瓜属植物的
ITS序列 ,旨在研究南瓜属植物的系统发育和亲缘
关系 ,为南瓜的引种 、育种提供必要的理论依据。
1　材料与方法
1.1　材料来源
材料来源见表 1。
表 1　材料来源
Table 1　Source of materials
编号 　　类 群 原产地 登录号
1 中国南瓜 C.moschata 中国福州 FJ915101
2 美洲南瓜 C. pepo 中国北京 FJ915102
3 美洲南瓜 C. pepo 中国西安 FJ915103
4 中国南瓜 C.moschata 中国福州 FJ915104
5 中国南瓜 C.moschata 中国福州 FJ915105
6 中国南瓜 C.moschata 中国台湾 FJ915106
7 美洲南瓜 C. pepo 中国青岛 FJ915107
8 中国南瓜 C.moschata 中国台湾 FJ915108
9 中国南瓜 C.moschata 日本 FJ915109
10 中国南瓜 C.moschata 中国台湾 FJ915110
11 中国南瓜 C.moschata 中国郑州 FJ915111
12 中国南瓜 C.moschata 中国济南 FJ915112
13 中国南瓜 C.moschata 中国济南 FJ915113
14 中国南瓜 C.moschata 中国台湾 FJ915114
15 黑籽南瓜 C. f ici fo lia 中国郑州 FJ915115
16 美洲南瓜 C. pepo 布基纳法索 AM981169＊
17 中国南瓜 C.moschata - AF006790＊
18 中国南瓜 C.moschata - AF013339＊
19 黑籽南瓜 C. f ici fo lia - AM981170＊
　注:＊序列下载自 GenBank;“ -”表示来源未知。
1.2　叶片基因组 DNA提取
取 0.1 g 叶片置于 1.5 mL 灭菌离心管中经液
氮冷冻 3 min 后用研磨棒磨成细粉末 , 加入 600
mL 预热的 CTAB 提取缓冲液 [ 50 mmol · L-1
Tris · HCl (pH 8.0), 20 mmol · L-1 EDTA ,
2%CTAB , 1.4 mmol · L -1 NaCl , 临用前加入
2%β-巯基乙醇] , 混匀后置于 65℃水浴中温育 45
min , 期间混匀数次 , 4℃下 12 000 r ·min-1离心
20 min , 将上清转移到新的 1.5 mL 离心管 , 加入
等体积预冷的氯仿∶异戊醇(24∶1), 将离心管缓慢
颠倒几分钟使管内充分混匀 , 4℃下 12 000
r ·min-1离心 10 min , 将上清小心转移到新的 1.5
mL 离心管中 , 加 2/3体积预冷的异丙醇 , 缓慢混
匀 , 于 -20℃下静置 30 min , 4℃下 13 000
r ·min-1离心 10 min , 弃上清 , 用 1 mL 预冷的
70%乙醇洗涤 DNA 沉淀 2次 , 加100μL 灭菌过的
ddH 2O , 溶解 DNA 。
1.3　I TS序列的扩增与测定
ITS 全序列 (含 5.8S rRNA 基因)采用引物
ITS5a: 5′-CCT TATCA TT TAGAGGAAGGAG-
3′[ 18] 和 引 物 ITS4:5′-TCCTCCGCTTA T T-
GATA TGC-3′[ 19] 扩增获得 。PCR反应体系体积为
50 μL :模板 100 ng , 2 mmo l· L-1 dNTP 5 μL ,
10×buffer 5μL , Taq酶 2 U , 引物 ITS5a 和 I TS4
各 20 pmol。PCR扩增程序为:95℃预变性 5 min;
95℃变性 1 min;50℃退火 1 min;72℃延伸 1.5
min;30个循环 , 最后 72℃延伸 7 min。PCR产物
经 DNA 纯化试剂盒 (杭州博日生物技术有限公
司)纯化后 , 由上海生工生物工程服务有限公司测
序 。
1.4　序列分析
将 I TS 序列测序结果进行分析 , 确定 ITS1 、
ITS2和 5.8S rRNA区 , 并登陆 GenBank , 所得序
列采用 DNAS tar 软件和 Clustalw 软件进行排序和
G+C 含量分析 , 利用MEGA 4.0软件进行系统发
育分析 , 并以自展法 (boo tst rap)进行检测 , 共
循环 1 000次 , 采用最大简约法 (Maximum par si-
mony)构建严格一致树。
2　结果与分析
2.1　南瓜 ITS 序列的差异分析
供试材料的 5.8S rRNA 的长度均为 162 bp ,
G+C 含量均为 58.64%, 表明南瓜核糖体基因高
度保守 。中国南瓜的 I TS1 长度为 188 ～ 191 bp ,
G+C含量变化范围为 51.60%～ 53.68%;美洲南
171第 2期 吴宇芬等:基于 ITS序列探讨南瓜属植物系统发育
瓜的 ITS1长度为 189 ～ 190 bp , G+C 含量变化范
围为 53.16%～ 54.50%;黑籽南瓜的 ITS1长度为
189 ～ 191 bp , G +C 含量变化范围为 52.38%～
52.88%。中国南瓜 I TS2 的长度为 251 ～ 256 bp ,
G+C含量变化范围为 53.78%～ 55.08%;美洲南
瓜的 ITS2的长度为 258 ～ 263 bp , G+C 含量变化
范围为 54.75%～ 56.98%;黑籽南瓜的 ITS2长度
为 258 bp , G +C 含量变化范围为 54.26% ～
55.04%(表 2)。南瓜 I TS1 序列的变异位点数为
33 , 占 I TS1全序列的 17.55%, ITS1序列的信息
位点数为 24 , 占 ITS1 全序列的 12.77%;南瓜
ITS2序列的变异位点数为 45个 , 占 ITS2全序列
的 17.93%, I TS2的信息位点数为 31个 , 占 ITS2
全序列的 12.35%(表 3)。在被子植物中大多数科
属 I TS 序列的种间差异值为 1.2%～ 10.2%, 属间
差异值为 9.6%～ 28.8%[ 11] , 由此可见南瓜 ITS
序列的信息位点适于作为南瓜系统演化的分子标
记 。
表 2　ITS 序列长度和 G+C 含量
Table 2　Length and G+C content of ITS sequences
编号 类群 ITS1 IT S2长度(bp) G+C含量(%) 长度(bp) G+C含量(%)
1 中国南瓜 C.moschata 189 52.38 252 54.76
2 美洲南瓜 C.p epo 190 54.21 259 56.37
3 美洲南瓜 C.p epo 189 53.44 263 54.75
4 中国南瓜 C.moschata 190 53.68 251 54.58
5 中国南瓜 C.moschata 190 53.68 251 54.98
6 中国南瓜 C.moschata 189 53.44 254 53.94
7 美洲南瓜 C.p epo 189 54.50 258 56.98
8 中国南瓜 C.moschata 190 53.16 256 55.08
9 中国南瓜 C.moschata 190 52.63 251 53.78
10 中国南瓜 C.moschata 190 53.16 256 54.69
11 中国南瓜 C.moschata 191 52.36 251 54.18
12 中国南瓜 C.moschata 189 52.38 252 54.37
13 中国南瓜 C.moschata 189 52.38 254 54.33
14 中国南瓜 C.moschata 190 53.16 251 54.18
15 黑籽南瓜 C.f ici f olia 191 52.88 258 55.04
16 美洲南瓜 C.p epo 190 53.16 258 55.43
17 中国南瓜 C.moschata 188 51.60 - -
18 中国南瓜 C.moschata - - 251 54.18
19 黑籽南瓜 C.f ici f olia 189 52.38 258 54.26
表 3　南瓜种间 ITS 序列及其变异
Table 3　Description of sequences from ITS(ITS1 and ITS2)data sets in Cucurbita
序列 序列长度(bp) 变异位点数目 信息位点数目
G+C 含量
(%)
ITS 1 188～ 191 33(17.55%) 24(12.77%) 51.60～ 54.50
ITS2 251～ 263 45(17.93%) 31(12.35%) 53.78～ 56.98
2.2　南瓜 I TS序列系统树构建
由 ITS1序列构建的严格一致树 (图 1), 步长
为34 , CI =0.666 7 , RI =0.857 1 , 分支所示数
据为重复 1 000次的自展值 。美洲南瓜和中国南瓜
为 1大分支 , 其 boo tst rap值支持率为 96%, 美洲
南瓜为这一大分支中的一分支 , 其 bootst rap值支
持率为 81%。中国南瓜又分为 4 个亚分支 , 编号
8 、 9 、 10 、 14的中国南瓜为一亚分支 , 自展支持
172 福建农业学报 第 25卷
率为 84%, 其中编号 8和 10 的为同一品种的父母
本 , 编号 4和 5 两个品种的中国南瓜为第二亚分
支 , 自展支持率为 57%, 编号 1 、 11 、 12 、 13 、 17
的为第三亚分支 , 自展支持率为 58%, 编号 6 的
为第四亚分支 , 黑籽南瓜为另一分支。
由 ITS2序列构建的严格一致树 (图 2), 步长
为37 , CI =0.681 8 , RI =0.774 2 , 分支所示数
据为重复 1 000次的自展值。美洲南瓜和中国南瓜
为一大分支 , 自展支持率为 99%, 黑籽南瓜为另
一分支 。编号 2 、 7 、 16 的美洲南瓜为一亚分支 ,
自展支持率为 50%, 编号 7和 11 的美洲南瓜为一
亚分支 , 自展支持率为 74%, 严格一致树不能将
中国南瓜和美洲南瓜完全区分开 。
图 1　据 ITS1 序列数据构建的严格一致树
Fig.1　Strict consensus tree of Cucurbita constructed based on ITS1 sequences data
注:分支上的自展支持率 Bootst rap的值≥50%显示 , 采用最大简约法 , 1 000次重复;图 2同。
3　讨　论
植物 rDNA 的 18S 至 26S 内转录间隔区
(ITS)是从碱基的差异来探讨物种遗传差异和系
统进化规律的 。被子植物的 ITS 序列在不同植物
类群中可用来解决科内不同等级的系统发育和分类
问题[ 18-2 2] 。不同分类等级 , ITS 序列所提供的信
息也是不同的。在对菊科沙蒿属艾亚属 [ Artem is-
ia section Tridentatae(Asteraceae)] 23个种植物
的研究中 , ITS1序列信息位点数占 7.82%, ITS2
序列的信息位点数占 9.84%[ 23] 。Moore 等[ 24] 基于
ITS 序列研究了菊科向日葵族的 Balsamorhiz a属
和Wyethia 属植物的系统发育 , 信息位点数占
25.74%。戴小军等[ 25]基于 ITS 序列对栽培稻种系
统发育分析 , 信息位点数占 1.82%。在对杨属
(Populus)15个种植物的研究中 , ITS1的信息位
点数占 7.1%, I TS2 的信息位点数占 19.2%[ 16] 。
本研究基于 ITS 序列探讨了南瓜属植物的系统发
育 , ITS1的信息位点数占 12.77%, ITS2的信息
位点数占 12.35%, 具有极强的系统发育信号 , 从
ITS1和 ITS2序列分别构建的系统树都可以看出 ,
中国南瓜和美洲南瓜为一大分支 , 黑籽南瓜为另一
173第 2期 吴宇芬等:基于 ITS序列探讨南瓜属植物系统发育
图 2　据 ITS2 序列数据构建的严格一致树
Fig.2　Strict consensus tree of Cucurbita constructed based on ITS2 sequences data
分支 。中国南瓜与美洲南瓜的亲缘关系较近 , 与黑
籽南瓜的亲缘关系较远。
在种水平上 , I TS1 的区别效果好于 I TS2[ 26] ,
本研究再次证实了这一点 , 从 I TS1 序列构建的系
统树可以看出 , 美洲南瓜为一单独的分支 , 从
ITS2序列建的系统树则不能完全将美洲南瓜和中
国南瓜区分开。从 I TS1序列构建的系统树可以看
出中国南瓜种下分化显著 , 这与孙正海等[ 27] 通过
过氧化物同工酶技术得到的结论是一致的。
从 ITS1序列构建的严格一致树可以看出中国
南瓜具有地理分化的现象 , 源自台湾与源自日本的
品种的亲缘关系较近 , 与大陆品种亲缘关系较远 ,
编号 6源自台湾的中国南瓜无论从外形还是 ITS1
序列来看 , 都与一般的中国南瓜品种不同 , 有待用
其他片段或技术手段来进一步研究它的系统分化 。
大陆南北方的不同中国南瓜品种的分化与它的地理
来源有一定关系 。因此南瓜的杂交育种有必要拓展
亲本的来源 , 引入不同地理来源的南瓜亲本 , 以拓
宽南瓜种质的遗传基础。
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(责任编辑:林海清)
175第 2期 吴宇芬等:基于 ITS序列探讨南瓜属植物系统发育