全 文 ：2011 年 8 月
2011，33(4) :409 － 411
中国油料作物学报
Chinese journal of oil crop sciences
秋水仙碱对芸薹属三种单倍体染色体加倍效率
李勤菲，向竹清，梅家琴，杨续蕊，李加纳，钱 伟*
(西南大学农学与生物科技学院，重庆市油菜工程技术研究中心，重庆 北碚，400715)
摘要:采用浸根、1g /L秋水仙碱滴生长点、含 100mg /L的秋水仙碱培养基处理芸薹属三种单倍体无性系幼芽，
诱导染色体加倍。根据处理后材料的田间表型、花粉育性和细胞学检测结果发现，各处理的染色体加倍效率存在
显著性差异，其中培养基处理幼芽的加倍效率最高，达到 50． 75%;浸根和滴生长点的处理加倍效率分别为 44． 07%
和 17． 54%。
关键词:秋水仙碱;浸根;滴生长点;幼芽培养;染色体加倍
中图分类号:S565． 403 文献标识码:A 文章编号:1007 － 9084(2011)04 － 0409 － 04
Efficiency of chromosome doubling with colchicine in three haploids Brassica spp．
LI Qin － fei，XIANG Zhu － qing，MEI Jia － qin，YANG Xu － rui，LI Jia － na，QIAN wei*
(Agronomy and Biotechnology College of Southwest University，Chongqing Engineering
Research Center for Rapeseed，Chongqing 400715，China)
Abstract:Three genotypes of haploids from Brassica spp． were used to study chromosome doubling efficiency
under colchicine treatments including immersing roots with colchicine solution，dropping 1g /L colchicine on growth
point and culturing shoots in medium with 100mg /L colchicine． Efficiency of chromosome doubling exhibited signif-
icant differences among three treatments by identifying morphology，pollen fertility and chromosome number． Shoot
culture had the highest efficiency of 50． 75% ． Immersing root and dropping method had 44． 07% and 17． 54% of
doubling efficiency respectively．
Key words:Colchicine;Immersing roots;Dropping growth point;Shoots culture;Chromosome doubling
收稿日期:2011 － 02 － 21
基金项目:国家科技支撑项目(2009BADA8B01)
作者简介:李勤菲(1984 － ) ，女，四川邛崃人，博士研究生，种质资源创新方向，E － mail:feifei1984998@ 126． com
* 通讯作者:钱 伟(1973 － ) ，男，湖北天门人，教授，博士，植物分子育种方向，E － mail:qianwei666@ hotmail． com
多倍体化是所有被子植物重要的遗传特征，在
高等植物进化与物种形成中起着重要的作用，是一
种自然选择的结果。已有报道，70%以上的显花植
物在进化过程中都发生过至少一次多倍体化［1］。
染色体加倍后的多倍体由于基因剂量倍增，使植株
的营养器官变大，新陈代谢旺盛，基因活性和酶的差
异性增强，加强植株的生态适应性和抗逆性［2］。
秋水仙碱是一种化学诱变剂，能够抑制有丝分
裂过程中纺锤体的形成，诱导多倍体的发生［3］，利
用秋水仙碱诱导多倍体育种已经得到广泛的应
用［4］。尽管研究表明秋水仙碱能够诱导染色体加
倍，并且也发展了一些加倍效率较高的处理方
式［5 ～ 7］，但是在远缘杂交过程中利用秋水仙碱诱导
染色体加倍仍然存在瓶颈现象，并且针对不同材料，
采用不同的处理方法进行秋水仙碱诱导染色体加倍
的系统性研究很少有报道。因此本研究对芸薹属不
同的单倍体材料进行不同的秋水仙碱处理，以比较
各种处理的加倍效率，为芸薹属单倍体材料的染色
体加倍提供参考。
1 材料与方法
1． 1 材料
M － AC 为甘蓝型油菜(B． napus，AACC，2n =
38)小孢子培养获得的单倍体材料(AC，n = 19) ;S
－ AC为白菜型油菜 (品系 6y733，B． rapa，AA，2n =
20)与栽培甘蓝(品系 K154，B． oleracea，CC，2n =
18)杂交产生的单倍体(AC，n = 19) ;S － ABC 源于
埃塞俄比亚芥 8w127(B． carinata，BBCC，2n = 34)白
菜型油菜 6y733 远缘杂交形成的单倍体(ABC，n =
27)。以上所涉及的亲本材料均由重庆市油菜工程
技术研究中心提供。为了便于研究染色体加倍效
率，这三种单倍体材料均通过无性繁殖，发展为无
性系。
1． 2 秋水仙碱加倍方法
1． 2． 1 浸根处理 处理材料M － AC、S － AC和 S －
ABC。设置三种处理水平，即 50mg /L 的秋水仙碱
浸根 16h、200mg /L 的秋水仙碱浸根 8h，以及
300mg /L的秋水仙碱浸根 2h［8］。具体操作如下:幼
苗生长至 3 ～ 4 叶期，洗净根部，剪去根尖部分后将
根部整体浸入秋水仙碱溶液中，处理相应时间后取
出，用清水冲洗 2 ～ 3h后移栽。
1． 2． 2 滴生长点 处理材料 S － AC 和 S － ABC。
幼苗生长至 3 ～ 4 叶期时，在其顶芽与腋芽处放置少
许棉球保持水分，滴一至两滴 1g /L的秋水仙碱于放
置棉球的顶芽和腋芽处。早晚各一次，持续一周。
1． 2． 3 幼芽培养 处理材料 S － AC 和 S － ABC。
取无性苗的顶芽或者分化的小苗(3 ～ 4 叶)于
100mg /L秋水仙碱 + MS + 3mg /L 6 － BA + 0． 2mg /L
NAA培养基中培养 7 ～ 10d(避光) ，观察愈伤组织
膨大后，转入MS +3mg /L 6 － BA +0． 2mg /L NAA的
分化培养基中培养成苗，切下新发育的苗，并转入
MS + 0． 5mg /L IBA 培养基中培养 15 ～ 20d，待植株
长大，生根后移栽。
采用三种秋水仙碱处理后的幼苗均于 2009 年
10 月移栽于西南大学试验田。
1． 3 秋水仙碱加倍效率的鉴定
1． 3． 1 花粉可染率 在天气晴朗时，早上 10 ∶ 00
– 11∶ 00 取当天新开放的花 2 朵，取出长、短雄蕊
各 1 枚，滴 1 滴醋酸洋红染液于载玻片上，将花粉抖
落在染液上，在显微镜下观察、计数。大而圆，且能
被染成红色的为可育花粉，不能着色的、小而瘪的花
粉为不育花粉。每单株观察花粉的总数在 200 ～
300 个之间。以甘蓝型油菜品种中双 9 号为对照，
若植株的花粉可染率恢复至与对照相当的水平，且
形态学特征与对照吻合，则该植株染色体加倍成功。
1． 3． 2 普通细胞学方法 对于无法通过花粉育性
和形态学特征确定是否加倍成功的植株进行染色体
计数:取 F1 植株幼小花蕾，用 0． 002mol /L 的 8 －羟
基喹啉处理，并置于室温(25℃)中，3 ～ 4h 后用卡诺
固定液(乙醇∶ 冰醋酸 = 3 ∶ 1)固定 24h 以上，4℃
保存。取固定后的子房，用 1mol /L HCl在 60℃恒温
水解 8min，用 10%的改良卡宝品红染色，敲片压片，
在显微镜下观察并记录染色体数目。
2 结果与分析
2． 1 处理后植株的花粉可染率及材料的加倍效率
根据材料的花粉可染率观察，小孢子材料的花
粉可染率分为两类:一类 90% ～ 97% 之间，一类
60% ～70%;人工合成甘蓝型油菜植株的花粉可染
率也分为两类:一类 95% ～ 99． 5%之间，一类是无
雄蕊、不育，或者育性低于 60%;自然状态下甘蓝型
油菜(即对照)的花粉可染率为 99． 5%。结合形态
学特征，小孢子材料中的花粉可染率为 90% ～ 97%
的材料为加倍成功，人工合成甘蓝型油菜中花粉可
染率为 95% ～ 99． 5%的材料为加倍成功。对于花
粉可染率在 70%以下的材料，需结合形态学和染色
体数目的鉴定。本研究共计处理三类单倍体 729
株，结合花粉可染率、形态学和染色体数目的观察，
浸根处理 270 株植株，119 株加倍成功;滴生长点处
理 325 株，57 株加倍成功;培养基分化处理 134 株，
68 株加倍成功。各材料在不同处理方式下的染色
体加倍结果列于表 1。
表 1 三种染色体加倍方法的加倍效率
Table 1 Chromosome doubling efficiency of three treatments of colchicine /%
材料
Genotype
处理方式 Treatment
浸根 Immersing roots
I II III
滴生长点
Dropping
growth point
幼芽培养
Shoot culture
平均加倍率
Chromosome doubling
efficiency
M － AC 46． 51(43)* 47． 50(40) 77． 08(48) \ \ 58． 55(131)
S － AC 28． 57(14) 56． 52(23) 16． 00(25) 27． 36(106) 50． 79(126) 37． 07(294)
S － ABC 0． 00(32) 66． 67(33) 0． 00(12) 11． 87(219) 50． 00(8) 17． 11(304)
注:I:50mg /L秋水仙碱，处理时间 16h;II:200mg /L的秋水仙碱处理 8h;III:300mg /L的秋水仙碱处理 2h;* 括号内数字为处理植株数
Note:I:50mg /L colchicine treated for 16h;II:200mg /L colchicine treated for 8h;III:300mg /L colchicine treated for 2h;* Chromosome doubling
efficiency was followed by number of treated plants
2． 2 不同浸根处理的加倍效率
对 M － AC、S － AC和 S － ABC 均进行了三种水
平的秋水仙碱浸根处理，结果显示(如表 1) ，M － AC
利用 300mg /L 的秋水仙碱处理 2h 的加倍效率最
高，达 77． 08%;S － AC采用 200mg /L的秋水仙碱处
理 8h 加倍效率最高，达 66． 67%;S － ABC 采用
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200mg /L的秋水仙碱处理 8h 加倍效率最高，为
56． 52%。不同的材料，不同的浸根处理方式对秋水
仙碱加倍效率都没有显著性影响。
2． 3 不同处理方式的加倍效率
分析浸根与滴生长点、幼芽培养的加倍效率，结
果显示(表 1) ，三种处理均能使三种材料成功加倍，
但加倍效率各有不同。经方差分析发现，三种不同
的处理方式之间存在显著性差异(P = 0． 01)。幼芽
培养(50． 57%)显著高于浸根处理(44． 07%) ，而浸
根处理的加倍效率显著高于滴生长点处理
(17． 54%)。根据三种处理的数据分析结果显示，
幼芽培养对幼苗的加倍效果最好。
2． 4 不同材料的加倍效率
三种来源不同的单倍体材料在三种不同的处理
下都获得了染色体加倍的植株，说明秋水仙碱诱导
染色体加倍具有普遍性。
3 讨论
在前人的研究基础上，本研究选择加倍效果相
对好的几种处理方式，即浸根处理、滴生长点和幼芽
培养来诱导小孢子单倍体材料(M － AC)、人工合成
三倍体材料(S － ABC)和人工合成甘蓝型油菜单倍
体材料(S － AC)的染色体加倍。结果显示各处理的
效率存在显著性差异，其中以幼芽培养的诱导效率
最高，浸根处理居中，而滴生长点对幼苗的加倍效率
最低。造成处理间差异的主要原因是幼芽在含秋水
仙碱的分化培养基中处理的时间足够长，可彻底抑
制单倍体细胞的后期分裂时纺锤体的形成，导致双
倍体的产生，而这种双倍体在分化培养基的诱导下
大量繁殖，形成愈伤组织，愈伤组织分化长成的苗即
为加倍的苗。而其他两个处理时，尽管染色体加倍
的原理一样，但是加倍细胞的分化和增殖速度低于
幼芽培养，从而造成其加倍效率低。此外秋水仙碱
浓度、处理方法、实验环境、实验材料对处理方法的
反应等也可以对染色体加倍效率产生影响［9 ～ 11］。
本研究发现，通过浸根和滴生长点获得的加倍
植株表现出大量的局部加倍现象，多数加倍植株均
为分枝加倍的嵌合体，而只有秋水仙碱培养基幼芽
培养诱变的植株表现全株加倍。有报道自然加倍的
材料也表现全株加倍［12］。周永明［13］等用秋水仙碱
对 52 份甘蓝型油菜品系(种)和相互间的杂种离体
小孢子的单倍体二倍化技术进行了研究，其中也观
察到大量的嵌合体现象。针对这种现象，周永明提
出小苗经秋水仙碱浸根处理并移栽到土壤中后，剪
掉有花蕾的主茎和侧枝，可促使其产生更多的二倍
化侧枝，从而提高加倍效率。
根据本研究的结果，单倍体材料之间加倍效率
虽然差距较大(变幅为 17． 11% ～ 58． 55%) ，但差异
不显著性，其中甘蓝型油菜小孢子单倍体植株的加
倍效率最高，人工合成甘蓝型油菜单倍体植株的加
倍效率其次，人工合成的三倍体植株(基因组为
ABC，分别来自两个不同物种)加倍效率最低。两套
基因组结构的人工合成甘蓝型油菜单倍体的加倍效
率高于三套基因组结构的人工合成三倍体材料。
Chen等［14］用相同的处理时间和相同的秋水仙碱浓
度诱导 7 个甘蓝型油菜品系的小孢子植株加倍，其
再生植株加倍率在 44% ～ 93%之间，变异范围也非
常大。因此，秋水仙碱诱导植株染色体的加倍效率
受基因组差异和环境的共同影响。
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