全 文 ：长江大学学报 ( 自科版 ) 2。。 6年 3月 第 3卷 第 1期 农学卷
J o u na r
l o f Yan g tz eU
n iv eo i ty ( N a tS ei E i dt )M
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20 0 6
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3 N o
.
I A『i 反 i v
芸蔓属植物器官离体再生影响因素研究进展
刘乐承 (长江大学园艺园林学院 ,湖北 荆州 4 34 02 5)
白远国 (荆州职业技术学院生物工程系 ,湖北 荆州 4 34 02 3)
〔摘要〕组 织培养技术对于 芸蔓属植物育种材料的保存与繁殖 以及 遗传改 良有着十 分重要 的意义 。 自 2。 世
纪 7 0 年代开 始以来 , 芸 蔓属 植物组 织培 养研 究取得了长足 的进展 。 就 基 因型 、 外植体 、 接种方法和培 养基
等影 响荟 荃属植物器 官离体 再生 因素的研究进展进行 了综述 。
〔关键词」荟 荃属 ; 组 织培养 ;器 官 ; 离体 ;再 生
[中图分类号 I Q 8 1 3 . 1 : 5 6 3 4 . I f文献标识码 I A f文童编号 1 1 6 7 3 一 1 4 0 9 ( 2 0 0 6 ) 0 1 一 0 1 7 5 一 0 4
植物组织培养的主要 目的是建立高频再生体系 ,获得最大的繁殖系数 。 植 物组织培养技术对于一些
具有重要价值的植物育种材料的保存与繁殖 , 发挥着无可取代的作用 ; 通过组织培养技术转基 因导人外源
目的基因又是植物遗传改 良的一种有效手段 。 因此高频再生体系的建立具有重要意义 。 自 20 世纪 70 年
代以来 ,芸荃属 ( B ar : “ ca )植物的组织培养研究取得了长足 的进展 ,在 甘蓝型油菜 、 芥菜 、 甘蓝 、花椰菜等
一系列物种上都建立了较好的再生系统 。 笔者对影 响芸墓属植物器官离体再生 因素 的研究进展作一综
述 。
1 基因型
许多研究表明 ,不同基因型的植物其再生频率有显著的差异 。 Y iuj 等 lj[ 研 究了 1 0 个甘蓝型油菜品
种子叶外植体对芽再生 的影响 , 发现其再生频率与基因型密切相关 ,不 同基因型子叶外植体不定芽再生频
率变化为 。写 一 97 环 。 Z h a n g 等川对 1 23 个大白菜品种进行了比较 , 除 8 个品种未能得到再生植株外 ,其
余 1 15 个品种都能以不定芽发生的方式再生植株 ,再生频率为 2 . 5 % 一 95 %不等 。 甘蓝及其变种 ( B . ol -
e r a c e a )较 白菜 ( B . c a m P e s t r i s )容易再生得多 [ 3一 6」。 属于 白菜类 的菜心 ( B . c a 州 P e s t r i s v a r . P a r a e h i n e n -
is )的芽再生频率低 , 易在愈伤组织上先形成根 , 而抑制芽的形成川 。 M盯 at a 等 〔`〕的研究表明 , 调控芽形
成的基因可能位于 C 基因组 。 因此 ,具有 C 基因组的甘蓝和花椰菜等容易再生 , 而缺少 C 基因组的大 白
菜等 (具 A A 基因组 )则 困难得多 。 因此 , 目前一般认为基 因组类型为 A A 的白菜类蔬菜要比基 因组类型
为 C C 的甘蓝类蔬菜难于再生 。
2 外植体类型
外植体类型对于器官再生频率有直接影响 。 在芸荃属植物上采用的外植体主要有真叶 、 生长点 、 子
叶 、 带柄子叶 、 下胚轴切断及各种花相关组织等材料仁“一川 。 目前芸墓属植 物离体培养 中常用的外植体有
无菌苗的子叶 、 下胚轴 、 根段以及大 田植株的花茎切段等 ; 而其 中最广泛采用的是无菌种子苗的子 叶一子
叶柄 L` 5一 ` 7〕 ,利用这一部分组织相对容易获得较高的再生频率 , 很可能是 由于这一部分外植体包含分化能
力较强的原生细胞和子 叶块营养 〔` 2〕 。 一般下胚轴的上部再生 出芽的能力强 , 而下部再生能力弱 。 埃塞俄
比亚芥菜下胚轴上部切段较下部切段早分化芽 , 芽再生率为 40 . 4 % , 而下部切段仅为 n . 3% 。 张松等困
在大白菜上也得出类似的结论 ,叶片的不 同部位再生能力不一样 , 而无子叶柄的比有子叶柄的子叶再生要
[收稿 B期〕2 00 6 一 0 2 一 2 4
〔第一作者简介」刘乐承 ( 19 64 一 ) ,男 ,湖北洪湖市人 ,浙江大学在读博士生 ,长江大学园艺园林学院副教授 .
长江大学学报 (自科版 ) 20 0 6 年 3月
困难的多 。 尽管大白菜子叶和胚轴均能诱导愈伤组织 ,但胚轴的愈伤组织较小 、 生长缓慢 ,诱导频率也低
于子叶 ,真叶不易进行分化和脱分化 。 虽然子叶等外植体具有简便 、 快速等优点 , 但其再生植株易为嵌合
体 ,基因型也可能是杂合的 。
3 外植体苗龄与极性
3
.
1 外植体苗龄
以无菌苗的子叶和下胚轴等为外植体时 , 苗龄显著影响芽再生频率 ,最常用的苗龄为 4 一 7 d 。 菜心
等发芽迅速 , 大约在播后第 3 d 子叶已平展 , 多用 4 一 s d 龄苗 l[’ 〕 ; 甘蓝和花椰菜等发芽则慢得多 , 在第 5
d 子 叶才能充分展开 , 多采用 6 一 7 d 龄苗 。 卫志明等 ls[ 〕以甘蓝为材料发现 ,尽 管苗龄相差非常小 ,但对
下胚轴芽分化频率影响非常大 , 苗龄为 s d 时 , 再生频率仅 1 8 . 07 % , 6 d 时则为 64 . 52 % 。 王 艳等发现苗
龄是影响甘蓝型油菜带柄子叶再生频率的一个 因素 ,选取低龄幼苗的带柄子叶可在一定程度上提高再生
频率 [` 6」 。
3
.
2 外植体极性
研究表明 , 以下胚轴和花茎为外植体时 , 极性是影响芽再生的重要因素〔` 叼 。 一般认为 ,近根端容易产
生根 , 远根端容易产生芽 。 在花椰菜上也发现 ,下胚轴远根端容易直接产生芽 ,而且芽的数量多 ; 近根端再
生芽则较困难 ,且多产生在愈伤组织上 。 但也有不 同的结论 , 如李树贤等 L20) 在结球甘蓝上发现 ,下胚轴不
定芽的发生没有明显极性 。
4 接种方法
许多研究表明 ,插植较平放芽再生率要 高得多 s[, l2j 。 菜 心子叶柄插入培养基 2 m m , 芽再生率可达
89 %
,而平放仅为 46 % 。 插植的方向对芽再生也有显著影响 。 外植体插植使子叶柄充分接触培养基 , 有
利于芽的再生 。 而平放的外植体常常 因膨大卷曲而不能充分接触培养基 , 出现玻璃化而逐渐褐化死亡 。
张松等 6j[ 在对大白菜的研究 中发现 , 叶片的放置方式对于愈伤组织的诱导影响不大 ,但对根和芽分化的作
用显著 。 花椰菜下胚轴倒插较正插容易再生芽 。
5 培养基
5
.
1 激素类型及浓度
( 1) 激素类型 激素是影响植株再生的决定性 因素 , 因而寻求适当的激素配 比是提高芽再生频率的重
要途径 。 不同作物类型 、 品种以及外植体对激素组成的要求有较大差异 。 在芸墓属植物组织培养中 , B A 、
C P P U
、
T D Z
、
N A A
、
K T 和 2 , 4一 D 等都有应用 。 B A 是芸墓属植物转化中最常用的一种激素 , 以花椰菜 、
结球甘蓝等子叶为外植体时 , 单独使用的质量浓度 以 4 一 5 m g · L 一 ` 为宜 , 与其他激素相结合时其质量浓
度则应适 当减小 。 对大 白菜外植体的分化 ,不 同种类的细胞分裂素的作用有 明显差异 , 6一 B A 的效果显
著优于 K T 和 T D Z[ 15) 。 甘蓝型油菜 9 12 品系带柄子叶在含 1 . 0 m g · L 一 ` 2 , 4一 D 的 M S 培养基上预培养
3 d
, 可使其分化频率提高 30 % 〔` 6〕 。 脱落酸 ( A BA ) 是组织培养中很少使用的一种激素 , 但是张鹏等圈发
现 ,低浓度 的脱落酸与 A g N 0 3配合有促进菜心不定芽分化的作用 。 白菜上也有类似报道 。 A B A 的作用
需进一步深入研究 。
(2 )激素配比 在芸墓属植物组织培养中 ,不 同激素的配比及其使用浓度 , 在不同的报道 中并不完全
一致 。 目前报道 中使用的最 多的组合是 B A 十 N A A ,但 浓度 因基因型的不 同而不 同卿一川 。 一般认为 ,
B A 和 N A A 结合使用优于单独使用的效果 。 张鹏等在进行菜心离体植株再生频率研究时发现 ,培养基 中
仅含 B A 或者 N A A 时 , 植株再生频率仅 为 7 . 8% 和 5 . 5% , 两者 同时使用再生频率提高 4 倍 , 且 B A Z
m g
·
L
一 `
+ N A A 1 m g
·
L 一 , 为最佳激素 配 比圈 。 同时发现 , 培养基 中附加 4 m g · L 一 ` A g N 0 3和 。 . 5
m g
·
L
一 `
A B A 时 ` 49 一 1 9 ’ 菜心再生频率高达 89 % , 比单独附加 A g N O 3或 A B A 都要高 。 相应的组织学
第 3卷 第 1期 刘乐承等 :芸挂属植物器官离体再生影响因素研究进展
研究表明 ,这一培养条件下愈伤组织的生长受到抑制 , 同时促进分生细胞团分裂 , 直接形成不定芽 。 王艳
等发现 6一 B A 4 . 0 m g · L 一 ` + N A A 0 . 02 m g · L 一 `诱导分化培养基中 ,最有利于甘蓝型油菜 9 12 品系的
芽苗再生 ,再生频率可达 70 % l6[ 〕 。
5
.
2 碳源
糖类作为碳源是组织培养过程中不可缺少的一种营养成分 , 也是影响组织培养是否成功的关键之一 。
至今已有 50 多种糖类被用于组织培养中 , 其中蔗糖是最主要和常用的碳源之一哪 , 26j 。 但 由于蔗糖的快
速代谢 ,引起细胞组织缺氧和酒精积累 ,在一些植物的组织培养中 , 常用别的糖类来代替蔗糖田」 。 蔗糖的
浓度对于组织培养也很重要 ,适当地浓度对于维持培养基地渗透势 ,提高再生频率具有重要意义 。 有报道
称提高蔗糖浓度还能减少组培 中的玻璃化现象〔侧 。
5
.
3 硝酸银
C hi 等〔29, 3。」首先发现培养基中添加 A g N O 3显著促进大 白菜 、 白菜和菜心的子 叶再生成芽 。 张鹏等〔 3` 」
报道 , 添加 4 ~ 8 m g · L 一 `的 A g N 0 3能显著地促进菜心再生芽 的分化 。 唐桂香等田〕在甘蓝型油菜的再
生研究中也得出同样的结果 。 余小林等 l[’ 〕发现 A g N O 。除了能提高不定 芽的诱导率外 , 还能克服褐化和
玻璃化等组织培养 中常见问题孟 于 占东等在大白菜子叶离体培养 中 ,采用添加 A g N O 。的处理 , 也显著提
高了天白菜子叶诱导不定芽发生频率〔 , 5〕 。 A g N O 。的作用机制 尚未完全清楚 。 目前一般认为 A g + 是较好
的乙烯活性抑制剂 ,能竟争性地作用于乙烯作用部位 ,防止外植体产生过多的乙烯对植株再生的抑制 。 另
外一种可能是 , A g + 与乙烯及多胺的生物合成代谢有密切关系 。 与乙烯的抑制作用相反 ,多胺促进器官的
发生 , 因此很有可能是由于 A g 十 的存在 ,使得 乙烯不能干扰多胺的合成 , 从而促进体细胞胚胎和芽发生的
频率sl[ 〕 。 但 A g + 的浓度过高则又会抑制器官的发生或产生畸形苗 ,这可能是因为 A g 十 是重金属离子 ,浓
度过高对植物体产生了毒害 。
5
.
4 琼脂
琼脂是植物组培中常用的一种中性支撑物 。 作为培养基的主要凝固剂 , 琼脂浓度过高 ,反而会大大降
低试管苗的繁殖系数 ,且生长缓慢阳〕 。 张凤兰等〔` 3〕采用不同琼脂浓度的培养基处理大 白菜 子叶外植体 ,
发现琼脂浓度对大 白菜不定芽再生的影响很大 , 琼脂浓度为 1 . 2 %和 1 . 6% 的处理 , 不定芽再生率和不定
芽数都高于 。 . 8%的处理 , 并且不定芽的分化早 。 特别是再生率较低 的 ` 夏宝 ’ 品种 , 在高浓度琼脂 的再生
培养基上不定芽再生率提高了 2 一 3倍 。 eP gn 等 3L’ J也曾报道甘蓝型油菜小抱子培养来源的不定胚在再
生培养基琼脂浓度较高时表现较高的植株再生率 ,并认为是 由于培养基 的水分状况 (水势 )不 同所致 。 于
占东等发现一定范围内提高琼脂浓度 , 可减少大白菜再生过程 中玻璃化苗的形成 ls[ 口 。
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t : T 6 e e f f e e t s o f d ie t a r y p r o t e i n l e v e l s o n g r o w t h p e r f o r m a n e e o f j a d e p e r e h ( s c
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T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t b o d y w e i g h t a n d i n e r e a s e w e i g h t o f 3 0
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e a n t d i f f e r e n c e w i t h b o d y l e n g t h
,
i n e r e a s e l e n g t h
, 争u r b v i v a l r a t e a n d p r o t e i n e f f i e i e n e y r a t e o f a l l t h e
P or t e i n g or u P ( P > 0
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0 5 )
.
T h e d i e t a r y P r o t e i n er q u ier m e n t fo r ja d e P e r e h
, t o g e t o P t im a l g r o w t h w a s
3 9
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7 1%
,
b a s e d o n b r o k e -n l i n e m o d e l 直n a l y s i s o f t h e w e i g h t i n e r e a s e .
K e y w o r d s : P r o t e i n r e q u i r e m e n t ; ja d e p e r e h ( S e o r t u m b a c o o ) ; i u v e n i l e
16 8肠 e Rel a lt o sn b iP 脚 on g
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A加 tacr t : T h e b o d y w e i g h t , b o d y l e n g t h , w h o l e l e n g t h , b o d y w id t h , b o d y h e i g h t , h e a d l e n g t h , i n -
t e r o r b i t a l s p a e e
, r o s t r u m w id t h
a n d e a u d a l p e d u n e l e h e i g h t o f O’ l o n t o b u t i s o b s c u r u s w e r e d e t e rm i n e d
a n d a n a l y s e d
.
T h e r e l a t i o n s h iP b e t w e e n b o d y l e n g t h a n d b o d y w e ig h t e a n b e e o n v e y e d b y e q u a t i o n 夕
= a x
b , a n d t h e r e la t i o n s h i p b e t w e e n b o d y l e n g t h a n d t h e o t h e r m e a s u r a b l e p a r a m e t e r s e a n b e e o n
-
v e y e d b y e q u a t i o n 夕= a + b x . W i t h b o d y l e n g t h i n e r e a s e , t h e r a t i o s o f b o d y h e i g h t / b o d y l e n g t h , i n -
t e r o r b i t a l s p a e e / b o d y l e n g t h a n d r o s t r u m w id t h / b o d y l e n g t h i n e r e a s e s i g n i f i e a n t l y
, a n d t h e r e s u l t
s h o w e d t h a t t h e f i s h b o d y f o r m e h a n g e s w i t h i n e r e a s i n g b o d y l e n g t h
.
K e y w o dr s : m o r p h o l o g i e a l p a r a m e t e r ; (习 o n r o b u t i : o bs e u r u : ; C h a n g h u L a k e
17 1 nA 幻y se o f t h e 晓n us A s e h e r s o n i a an d R e l a ted G凌n ear u s i n g 2 8 5 r DN A R几 p T ec h n iq ue
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亡 v L a b o f B 泣。 力e ` t泛e泣de a ” d Ch 亡m i c a l B i o l o f v 。 M泛” i` t r v o f E d u e a t汇。 ” , F u i i a ” A g r i c u l t u re a ” d F 〔』邝 s t r y 、
七r “ z 月 o u 一r 叼 i a n 0 0 V U U ` 一七月考n a j
C州〔N Y们g , M A UH 私fe i (肠止le 肛 。了L `fe & 廷~
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F可必n A加`以扭 , an d 凡脚 3ytr 山 i~ iyt , uF 幼 ou , F可必 , 35 0 0 2 ,以 i、 )
A加tacr t
:
E i g h t e e n i s o l a t e s o f e n t o m o p a t h o g e n i e f u n g i
,
i n e l u d i n g A s c h e “ o n i a , L e c a n i c i l l i u m a n d
B e a u v e r i a w e r e a n a l y z e d b y R F L P (
r e o t r i e t i o n f r a g m e n t l e n g t h p o l y m o r p h i s m ) a n a l y s i s o f a 2 8 5
r R N A g e n e f r a g m e n t
.
T h e d a t a o b t a i n e d b y f o u r d i f f e r e n t e n d o n u e l e a s e s w e r e u s e d t o e o n s t r u e t p h e
-
n o g r a m s b a s e d o n t h e U P G M A a l g o r i t h m
.
P o l y m o r p h i s m
s w e r e f o u n d b e t w e e n g e n e r a a n d s p e e i e s
,
w i t h f e w e r a m o n g i s o l a t e s w i t h i n s p e e i e s
.
P CR
一
R F L P w i t h i n t h e 2 8 5 r R N A g e n e w a s s u f f i e i e n t t o
d i s t i n g u i s h b e t w e e n A s e h e r s o n i a s P e e i e s
.
R F L P d a t a s h o w e d g e n e t i e d i v e r s i t y i n L e e a n i c i l l i u m 15 0
-
l a t e s a t a n i n f r a s P e e i f i e l e v e l
.
T h e U P G M A a n a l y s i s r e s u l t s i n d i e a t e d t h e e l o s e r t a x o n o m i e a f f i n i t y o f
L e e a n i c i l l i u m t o B e a u v e r 泛a e o m P a r e d t o A s e h e r s o n i a .
K ey w o r d s
: e n t o m o P a t h o g e n i e f u n g i ; 2 8 5 r R N A g e n e ; P C R
一
R F L P ; U P GM A
1 7 5 A d v a n c e on R砚记 a cr h o f t h e F ac tosr I
n if u e n c i n g i n vi t r o R eg e n er a t i o n o f B r a s s i c a o 邝an s
L尸U L-ec 加 n g ( C o l l e g e o f H o rt i c u l t u r 。 a , d aG r d e。 `二g , aY , g t z 。 饰 i* sr i t夕 , J i , g z h o u , H u be i 4 3 4 O2 5 , hC 诬n a )
日八1 Yi幻仆.俐。 ( eD P a 对~ t o f B i o o g i , 心。 r i n g
,
J泛n g z人。 “ Va ` a t 诬。 , a l a n d 7飞` h n i ca l C o z ze g e , J i , g 二 h o u , H “ 加泛 4 5 4 0 2 3 , hC 派翔 a )
A bs tacr t
:
P l a n t t i s s u 乒 e u l t u r e p l a y s a n im p o r t a n t r o l e i n e o n s e r v a t io n a n d p r o p a g a t i o n o f b r e e d in g
· 孤 ·
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a te r ia ls
, a s w e l l a s i n g e n e t i e im P r o v e m e n t i n B ar s s i e a
.
G r e a t p r o g r e s s h a s b e e n
s e a r e h o f t i s s u e e u l t u r e i n
·
B ar
s s i c a s i n e e 1 9 7 0 s
.
T h e a d v a n e e s o n
g e n o t y P e s , e x P l a n t s
,
i n e u b a t e m e t h o d a n d m e d ia
,
w h i e h i n f l u e n e e
B ar s s i c a w e r e d i s e u s s e d
.
r e s e a r e h o f t h e
m a d e o n t h e r e
-
fa e t o r s
, s u c h a s
i n v i t or r e g e n e r a t i o n o f o r g a n s in
K灯 w o川 s : B r a s s i e a ; t i s s u e e u l t u r e ; o r g a n ; i n v i t or ; r e g e n e r a t i o n
17 9 N we M
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n i , t砂 o f A g r i c u l t u。 , aY 月 g r z e R i* r F i认er i e s 及: 绍叮六 I月` t i t咐 e o f hC 止n e , e A o de m夕 o f F i : h er i e : sc i o c云: ,
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l l e g e君 o f sk a 凡` h a i iF hs e ir o nU 葱叱打泛yt , 励 a 月动 a i 2 0 0 0 9 0 , hC 王na
( B i o : c i e , c e肠 l l e砂 9 o f S h a ,动 a i F i , h e八 e , 山玄, 。 泣t , , hS a n砂 a 亡20 00 9 0 , hC i , a )
C月〔 N iJ , 2 卜仍O G劝叩 , LI U (aL bo ar
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\ 翔 n gt ez 找七t肥宁 尸 1功州口“ J在 “ 泌六力 I川 t ,名“ 阳 oj t力 1月吧`亡 Zk “ 心曰. ) oI 尸盆碗曰门妞` 汉:口艺“ 一 J t” g幼 OU * 月目笼 . 4 J 4 U UU , ` 内 忿皿 ,
丫口 O i- x 仍 (加加m ot 即 of nA mat l oM lec 咖 r 伪 t o g 曰祀 t i e: , B io cs 泛~ 肠 l肠爪 of w汕 a n 饰i~ y`t , w hu a , , H “处1 4 3 00 72 ,以 ian )
A b成派 t : T h e r e s e a r e h m e t h o a s a n d r e s e a r e h p r o g r e s s o f 。 h r o m o s o m e s w e r e s u m m a r i z e d t h r o u g h
e h r o m
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e r o i s o l a t i n g a n d m i e r o e l o n i n g
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, t h e p r o s p e e t o f m o l e e u l a r e y t o g e n e t i e s w a s a l s o r e v e a l e d
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1 8 5 S tud y on P
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t : T h e e o m P
o s i n g a n d P r o e e s s i n g o f e a r or t j ul e e s o y m i lk w e r e s t u d ie d
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s o y m i lk
a n d e a r r o t ju i e e w a s 3
,
l ; t h e d e f a t t e d 而 Ik w a s 1 0% ( w e i g h t p e r e e n t o f s o y m i lk ) ; F e r m e n -
t e d t e m p e r a t u r e w a s 4 2 ℃ , f e r m e n t e d t im e 4 h , aL c￡o ab e i l l “ s b“ l g a r i c u s : S t r e P t o e o c e u s t h e舰 o P h i -
zu : = x
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1
,
i n o e u l a t i o 。 q u a n t i t y 4 %
.
T h e
. 。 t a b i l i z i n g r e泣g e n t 。 w e r 。 e M e 一 N a : 0 . 2 5% 、 xa n t h a 。 g u m :
0
.
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.
K e y w or d s
: e a r r o t j u i e e ; s o y m i l k ; p r o e e s s i n g ; e o m p o s i n g
· 坷 ·