全 文 ：的主要判断标准是其药效成分的含量 ,目前大量研
究集中于考察丹皮来源 、采收期等对其药效成分含
量的影响〔7, 8〕 ,对储存过程中药效成分含量的变化
研究很少。本实验集中考察了 5个品种 、7个丹皮
组分在储存 15个月过程中含量的变化 ,结果显示丹
皮酚及其类似物含量随储存时间的增加而降低 , 5
个品种储存 9个月后的丹皮酚含量发生显著变化;
芍药苷及其类似物含量随储存时间的增加而增加 ,
多数品种也在储存 9个月后含量发生显著变化 。因
此 ,建议丹皮在采收后 9个月以内使用较好 ,储存时
间越短 ,丹皮酚及其类似物含量越高 。
郭宝林等〔9〕提出丹皮酚类似物在储存过程中
有向丹皮酚转化的趋势 ,从本研究各组分含量变化
趋势和相关性分析来看 ,丹皮酚新苷 、丹皮酚原苷 、
没食子酰丹皮酚苷与丹皮酚之间不存在直接的转化
关系。丹皮酚具有一定的挥发性 ,其含量在储存过
程中减少可能与挥发有一定关系。芍药苷及其类似
物含量相关性显著 ,但变化趋势一致 ,它们在储存过
程中含量显著增加的原因还有待进一步研究。
参 考 文 献
[ 1] 国家药典委员会 .中华人民共和国药典.一部.北京:
化学工业出版社 , 2005:119.
[ 2] 李嘉珏 .中国芍药与牡丹 .北京:中国林业出版社 ,
1999:1-10.
[ 3] 于津 , 郎惠英 ,肖培根 .牡丹根中的新成分———丹皮酚
新苷的鉴定 .药学学报 , 1986, 21:191.
[ 4] KariyoneT, TakahashiM, TakaishiK.Glycosides.Com-
ponentsofPaeoniasufruticosa.L.Pharmaceuticalbulle-
tin, 1957, 76(8):917.
[ 5] MasayukiY, EmikoU, AtsuhiroK, etal.Galloyloxypae-
oninorin, suffruticosidesA, B, C, andD, fivenewantiox-
idativeglycosides, andsuffruticosideE, apaeonolglyco-
side, from ChineseMoutanCortex.Chem PharmBul,
1992, 40:2248.
[ 6] KitakawaI, YoshikawaM, TsunagaM, etal.Thecompo-
nentsofMoutancortex———theresearchonMoutancortex
(rep.2).NaturalMedicines, 1979, 33(3):171.
[ 7] 白志川 .不同采收期川丹皮多组分化学成分变化规律
研究 .中国农业科学 , 2006, 39(5):997-1003.
[ 8] 方成武 , 刘晓龙 ,周安 , 等.安徽南陵凤丹皮最佳采收期
的考察 .现代中药研究与实践 , 2006, 20(5):21-24.
[ 9] 郭宝林 , 巴桑德吉 ,肖培根 , 等.中药牡丹皮原植物及药
材的质量研究 .中国中药杂志 , 2002, 27(9):654-657.
(2007-12-03收稿)
基金项目:贵州省种植业结构调整综合配套技术试验示范项目 [黔农(2005)08号 ]作者简介:陶刚 ,男 ,在读博士研究生 ,助理研究员 ,研究方向:真菌分子系统学;Tel:0851-3760818, E-mail:tg729@sina.com。＊通讯作者:刘作易 ,男 ,博士 ,教授 ,博导;Tel:0851-3761761, E-mail:liuzuoyi@yahoo.com.cn。
·鉴别 ·
贵州中药材钩藤属植物的分子鉴定
陶　刚 1, 2 , 刘　涛 3 ,朱　英1, 4 ,刘作易 1, 5＊
(1.贵州省农业生物技术重点实验室 ,贵州贵阳 550006;2.贵州省植物保护研究所 ,贵州贵阳 550006;3.
贵州省果树科学研究所 ,贵州罗甸 550100;4.贵州省生物技术研究所 ,贵州贵阳 550006;5.贵州省农业科
学院 ,贵州贵阳 550006)
　　摘要　目的:对来自贵州钩藤原产地类似钩藤的 4个中药植物材料的 rDNAITS序列进行分析 ,并构建了它们
的系统发育树 , 从遗传本质上对这些材料的分类地位和种类鉴定提供分子证据。方法:对 4个中药植物材料的 rD-
NAITS区进行了 PCR扩增 、测序 , 运用 ClustalX、BioEdit和 PAUP＊ 4.0 beta10等软件对 ITS区序列进行分析。结
果:获得 rDNAITS1、ITS2和 5.8SrDNA完整序列 , 以 Mitragynarubrostipulata(AJ492621)和 Mitragynarubrostipulata
(AJ605988)为外群 ,构建这 4个类似钩藤的植物材料的系统发育树。结论:研究材料属于药用钩藤属的重要种类 ,
并且是与 Uncariarhynchophyla具有很近亲缘关系的 4个相近种类。
关键词　钩藤属;中药材;系统发育树;分子鉴定
中图分类号:R282.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2008)06-0825-04
MolecularIdentificationofMedicinalPlantGenusUncariainGuizhou
TAOGang1 , 2 , LIUTao3 , ZHUYing1 , 4 , LIUZuo-yi1, 5
(1.TheKeyLaboratoryforAgri.BiotechnologyofGuizhou, Guiyang550006, China;2.GuizhouInstituteofPlantProtectionGuiyang
·825·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 6期 2008年 6月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2008.06.004
550006, China; 3.GuizhouCitrusInstitute, Luodian550100, China; 4.GuizhouInstituteofBiotechnology, Guiyang550006, Chi-
na; 5.GuizhouAcademyofAgri.Sci, Guiyang550006, China)
Abstract　Objective:ToanalyzerDNAITSregionsoftheMedicinalPlantGenusUncariainGuizhouandconstructtheirphyloge-
netictreeinordertosupplymolecularevidenceoftaxonomyandidentificationoftheseMedicinalPlantsingeneticlevel.Methods:The
ITSgenefragmentsofthe4MedicinalPlantswerePCRamplifiedandsequenced.TherDNAITSregionswereanalyzedbymeansofthe
softwareofClustalX, BioEditandPAUP＊ 4.0 beta10.Results:TheentiresequencesofrDNAITS1, ITS2, and5.8SrDNAwereob-
tained, TheMaximum-parsimonytreeoffourITSregionstogetherwiththoseofsimilarsequencesfromGenBankwerefound, asMitray-
narubrostipulata(AJ492621)andMitragynarubrostipulata(AJ605988)weredesignatedasoutgroup.Conclusion:The4 medicinal
plantsarethe4speciesinthegenusUncaria, andaremostlysimilartotheUncariarhynhcophyla.
Keywords　Uncaria;ChineseMedicinalPlant;Phylogenetictree;MolecularIdentification
　　钩藤属 (UncariaSchreb.)植物多具有药用价
值 ,它属于茜草科(Naucleeae),用于药材的常见种
类为钩藤(Uncariarhynhcophyla(Miq.)Jacks)、大叶
钩藤 (U.macrophylaWal)、华钩藤 (U.sinensis
(Oliv.)Havil)、毛钩藤(U.hirsutaHavil.)和柄果钩
藤(U.sesifructusRoxb.)。中药钩藤具有清热平
肝 、息风定惊之功效 ,用于治疗风热头痛 、头晕目眩
等症〔1〕 ,为中医儿科要药和现代治疗高血压方剂中
的常用药材 。钩藤在贵州具有丰富的中草药资源 ,
但是随着需求量不断的增加 ,野生资源也极为有限 ,
致使钩藤资源逐渐减少并面临着枯竭的危险。而
且 ,在钩藤的资源和种类鉴定等调查研究方面的基
础研究工作 ,特别是从植物分子系统学方面进行的
研究还很少 。本文以贵州钩藤原产地的类似钩藤的
重要药用植物为材料 ,用 rDNAITS区序列为依据建
立各材料间的系统发育关系 ,从遗传本质上对这些
材料的分类地位和种类鉴定提供分子证据 ,也为合
理开发和有效利用贵州中药植物资源提供理论依
据 。
1 　材料与方法
1.1 　材料来源　实验材料采集自贵州省黔东南州
剑河县 。这些材料是类似钩藤的中药材植物 ,但从
形态特征上并不能确定它们的种类关系。根据植株
的叶片形状 、钩的着生状态等特征选择有差别的植
株 ,取健康较幼嫩的植株叶片 ,用灭菌纸袋带回实验
室备用 。
1.2 　植物材料基因组 DNA的提取　采用 CTAB
法提取植株基因组 DNA:取 1 ～ 2 g新鲜叶片放在预
冷的灭菌研钵中 ,加入适量的液氮并研磨成灰白色
粉末状 ,移至 2.0 mL离心管中 ,加 600 μL预热的
CTAB裂解液 (CTAB2%, Tris-HCl100 mM, NaCl
1.4M, EDTA20 mM, β -巯基乙醇 1%, PVP1%, pH
8.0),充分混匀 , 65℃保温 1h,其间轻摇混匀几次;
加等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),轻摇 5 min,
12000 r/min、离心 10 min。取上清至另一离心管
中 ,加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1),抽提 5 min,
12000 r/min离心 10min,取上清至另一管中 。再根
据情况重复本次操作 ,直至在两相分层处无杂物 ,一
般重复抽提一次即可。向抽提后的液相中加入 0.1
倍体积的 KAc(5 M)混匀 ,再加入 0.8倍体积的异
丙醇混匀 ,于 -20℃静置 30 min;吸出 DNA至 1.5
mL离心管中 ,用 70%乙醇洗涤 2次 ,吹干后将其溶
于适量的 TE中 ,于 4℃或 -20℃保存备用。
1.3　植物材料的 ITS序列的 PCR扩增　采用通用
引物 ITS5-ITS4〔2〕扩增 ITS:反应体系为 50μl,其中:
DNA模板(约 25 ng), MgCl2(2.5 mmol/L), dNTP
(200 μmol/L), ITS5、ITS4(0.25 μmol/L), TaqDNA
聚合酶(1.5U, ), 10×PCRBufer(100 mmol/LTris-
HClpH8.3, 500 mmol/LKCl, 0.01% gelatin)。扩
增反应程序为:95℃预变性 3 min后进入循环 , 94℃
50s, 52℃ 52s, 72℃ 60s。进行 35个循环 , 72℃ 10
min,进入 8℃,反应结束 ,于 4℃或 -20℃保存备用。
上述反应在 BIO-RAD公司的 PCR扩增仪中进行。
1.4　PCR产物的纯化及测序 　采用北京 TIAN-
GEN公司的纯化试剂盒进行琼脂凝胶的回收和
PCR产物纯化 ,由上海生工生物工程技术服务有限
公司进行双向测序 。
1.5　ITS序列分析及系统发育树的构建　本研究
得到植物材料的 ITS序列以及来自 GenBank与这些
种类相近似的 ITS序列见表 1,一起用于分子系统
发育分析 。通过 Clustal-X1.81〔3〕软件包进行相似
序列的比对 ,再运用 BioEditversion5.0.6对比对的
结果进行手工校正 ,把上述处理的序列数据通过
PAUP＊ 4.0 beta10〔4〕进行分子系统发育分析 ,构建
系统发育树。
通过最大简约法分析(MaximumParsimonyA-
nalysis)建立最大简约树 ,应用启发式搜索法作为获
得聚类树的方法 ,应用树二等分再连接法(Tree-Bi-
section-Reconnectio, TBR)作为启发式搜索的算法。
在系统进化分析中碱基序列间空缺作为碱基缺失处
·826· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 6期 2008年 6月
　　表 1　 用于系统发育分析的钩藤属植物及相近属植物的 rDNAITS区序列
种名 Genbank登录号 种名 Genbank登录号
Uncariarhynchophyla AJ346900 Gyrostipulacomoriensis AJ346866
Uncariaafricana AJ414545 Breonadiasalicina AJ346857
Uncariaguianensis AJ414546 Naucleadiderrichi AJ346855
Uncariasp. AJ414547 Naucleasubdita AJ346876
Gyrostipulafoveolata AJ346867 Naucleaxanthoxylon AJ346877
Breoniadecaryana AJ346859 Mitragynarubrostipulata AJ492621
Janotiamaccrostipula AJ346869 Mitragynarubrostipulata AJ605988
理 ,把所有碱基状态处理为无序并且不加权 。通过
1000步重复获得的自展检验(Bootstrap)数值标记
在分支上。
2 　结果与分析
2.1 　植物材料基因组 DNA提取　琼脂糖凝胶电
泳图谱见图 1,各个提取物均呈现一条清晰整齐的
主带 ,无降解 ,通过本方法得到的植物材料基因组
DNA,作为模板进行 PCR扩增。
图 1　钩藤基因组 DNA电泳图谱
2.2 　植物材料的 ITS序列测定及系统发育树的构
建　本实验根据形态特征有差别的植物选择有代表
性的植株 4个 ,并测得它们的 ITS序列 GT-1、GT-2、
GT-3和 GT-5 , 这些序列包括 ITS1、 ITS2和 5.8S
rDNA区段 ,大小在 500-600bp之间 。
上述序列与 GenBank中已经发表的钩藤属植
物或与它们亲缘关系相近属的序列一起 ,采用最大
简约法分析 ,并以 Mitragynarubrostipulata(AJ492621)
和 Mitragynarubrostipulata(AJ605988)为外群建立
一棵最大简约树 。见图 2。
从构建的钩藤材料与相近属种类的系统发育树
可以看出 , 第一分支为茜草科 (Naucleeae)植物的
Breonadiasalicina单独聚为一类 ,它不同于该科的
其它属 。第二个分支为茜草科的 Breonia、Janotia和
Gyrostipula3个属 ,但这个分支的总支持强度和小分
支的支持强度都不高(分别为 76%、55%和 56%),
说明这 3个属的亲缘关系很近 ,同时也反映出这个
分支也仍然有其他的聚类关系 。在该系统发育树中
获得最大支持强度的分支是茜草科的 Nauclea属中
的几个种类 ,在遗传水平上反映了这几个种的亲缘
图 2　根据 ITS＆ 5.8S序列得到的最大简约树图
注:分支上的数值表示等于或大于 50%的 Bootstrap值
关系 ,支持强度达到 100%。本实验得到的 4个目
的序列与钩藤属(Uncaria)的几个种类聚类在一起 ,
而且与钩藤(U.rhynchophyla)聚在一个子分支上 ,
支持强度达到 100%, 反映了实验材料与钩藤
(U.rhynchophyla)之间有很近的亲缘关系。
这 4个材料之间又形成了一个小分支 ,虽然支
持强度仍有分歧(74%),但基本上反映了它们间的
系统发育关系。从聚类树上可以看出 , 4个材料之
间有很近的亲缘关系 ,其中 GT-3和 GT-5在 ITS区
的差异最小 ,而 GT-1和 GT-2则有较 GT-3和 GT-5
更多的 ITS区的碱基替代 。这个结果与实验材料的
形态特征是一致的:从采集材料的叶片和钩的着生
状态来看 , GT-1的叶对生 ,叶片为长椭圆形 ,叶尖尾
尖 ,叶脉细小 ,叶色深绿色 ,叶面光滑 ,叶柄红褐色;
钩反转弯曲向叶背 。 GT-2的叶对生 ,叶片为矩圆
·827·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 6期 2008年 6月
形 ,叶尖尾尖 ,叶脉较粗 ,叶色深绿 ,叶面皱褶 ,叶柄
绿色;钩反转弯曲向叶背。 GT-3的叶对生 ,叶片为
椭圆形 ,叶尖为狭急尖 ,叶脉细小 ,叶色绿色 ,叶面光
滑 ,叶柄略带红色;钩弯曲向叶面 。 GT-5的叶对生 ,
叶片为宽椭圆形 ,叶尖狭尾急尖 ,叶脉较小 ,叶色绿
色 ,叶面光滑 ,叶柄绿色;钩反转弯曲向叶背 。 GT-1
和 GT-2有明显的差别特征 ,而 GT-3与 GT-5钩的着
生状态不一致 ,其它均相似 ,所以 GT-1和 GT-2之间
的差别要比 GT-3与 GT-5的差别要大 。
钩藤(U.rhynchophyla)是中药钩藤类中最常用
的一个种类 ,研究表明它的植株中有效的药理成分
含量在药用钩藤种类中是最高的。从聚类树体现出
的系统发育关系 ,可以说明我们所研究的 4个材料
属于药用钩藤种类 ,并且具有很高的药用价值 。
3 　讨论
本实验研究的 4个材料是从贵州的原产地采集
的 ,从形态特征上有明显的差别 ,也是当地常用的中
药材料 。但是 ,这些材料的分类地位和种类鉴定仍
不清楚 ,也缺少可靠的分子分类的证据 ,从而限制了
这些药材的有效利用 。
从本研究构建的系统发育树可以看出 ,钩藤属
与 Nauclea属形成分支的聚类关系在遗传本质上很
好地体现了茜草科这些属的进化层次 ,在形态上与
已知的种类鉴定分类是一致的。因此 ,从笔者采集
的植株材料在该聚类树子分支中的位置可以推断 ,
这些材料是钩藤属的种类 ,并且这 4个材料与钩藤
属的 Uncariarhynchophyla这一种类很相似 ,有很密
切的亲缘关系 ,它们组成了一个高支持强度的拓扑
分支 。从这棵树反映茜草科的进化关系层次上还可
以推断 ,笔者研究的 4个材料应该属于钩藤属相近
的 4个种 ,但对它们种类的进一步鉴定还要进行相
关的深入研究 。
致谢:本文在软件分析和系统树构建等方面得到中国科学院微
生物研究所真菌地衣系统科学重点实验室的刘杏忠老师 , 以及该实
验室的博士生杨恩策同学很大的帮助 ,特此感谢。
参 考 文 献
[ 1] 国家药典委员会 .中华人民共和国药典 .一部 .北京:
化学工业出版社 , 2005:180.
[ 2] WhiteTJ, BrunsTD, LeeSB, etal.Amplificationand
directsequencingoffungalribosomalRNAgenesforphylo-
genetics.In:InnisM A, GelfandDH, SninskyJJ,
WhiteTJ(eds).PCRProtocols:aGuidetoMethodsand
Applications.Acad.Press.SanDiego, CA.1990:315-
322.
[ 3] ThompsonJD, GibsonTJ, PlewniakF, etal.TheClustal
windowsinterface:flexiblestrategiesformultiplesequence
alignmentaidedbyqualityanalysistools.NucleicAcids
Res, 1997, 24:4876-4882.
[ 4] SwoffordDL.PAUP＊.PhylogeneticAnalysisUsingParsi-
mony(＊andOtherMethods).Version4.SinauerAssoci-
ates, Sunderland, Massachusets, 1998.
(2007-12-24收稿)
《中药材 》杂志来稿要求
1　来稿以科研论文 、经验总结 、简报 、译文等形式均可。科研论文及经验总结必须观点明确 , 有分析 ,有结论 , 避免材料堆积
罗列 , 字数一般在 4000字以内(包括图表)。简报及会议消息 ,字数一般在 1000字以内。译文可节译或全译 , 要求鄱译准确 ,
文字流畅。
2　凡 2000字以上的文章 ,请作者写好 200字左右的摘要 ,放在正文之前。研究论文 , 请附上英文标题 、英文摘要及关键词
(一般 3 ～ 5个)。
3　稿件力求语句通顺 ,简明精炼 ,用 A4纸打印清楚;外文用印刷体书写或打字;表格要简炼 , 两端开口 , 不用纵线 , 栏头左上
角不用斜线 , 除栏头外 ,表身中不用或少用横线;插图用绘画纸黑墨水笔正确绘制 , 要求黑白分明 , 图注文字用铅笔标明。照
片要清晰 , 尽可能附上底片。编号写成 “图 1”, “表 1”字样。
4　计量单位 ,应按国际统一计量单位和符号书写 , 如:m, cm, mm, kg, g, h, min, s;等。
5　标目 , 一般采用 1、1.1、1.1.1三级 ,层次的序号后不用黑点。
6　参考文献请在文中引用处用方括号顺序以数字标注。文献数目过多的不必全列出 , 只举重要的和新的 ,并按下列格式书
写。
[期刊 ]作者 .文题 .刊名 ,年 , 卷(期):起页-迄页 .
[书籍 ]作者或编者 .书名 .版本 .出版地:出版社(商), 出版年:起页-迄页 .
·828· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 6期 2008年 6月