全 文 ：河 北 农 业 大 学 学 报
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n iv es r it y of H eb e i
V o l
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4
〔无t . 9 9 18
期月第
19
第 4卷 `
,年 1 O
苹果属植物 R A P D 分析的影响因素及其稳定性研究 `
刘孟军
(河北农业大学中国枣研究中心 ,保定 07 10 1)
S ih n Y o gn 一 U K aY
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r c h Ins t i t u t e
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n 4 4 03 10
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.
of K o r比
摘要 以富士苹果和山定子为试材对苹果属植物 R A P D 分析的最佳反应条件及其可重复性等
进行了研究。 结果表明 , R户尸D 反应的各个条件因子 ,包括模板 D N A 浓度 、 引物浓度 、 dN T P 浓
度 、 D N A 聚合酶的种类和浓度 、 P C R 扩增循环数以及反应总体积等都对 R A P I〕结果有显著影
响 ,都有其最适用量范围。 各因子在低于最适值时会导致扩增带数的减少甚至无带 , 高于最适
值则会出现带的弥散或缺失 。 苹果属植物 RA p D 分析的最适反应条件为: 35 一 50 沙 反应混合
液中时 ,含模板 D N A S一 20呢 , 引物 2 0一 40飞 ( 0 . 13一 0 . 2 7尸M ) , d N I , P l (X) 一 20() 月功 ,玖胭玛翻e
T
a 〔l酶 0 . 8一 1 . 6 个单位 。 取样部位 、 时期 、 及 D N A 提取方法等对 R A PD 结果均无 显著影响。
在最适反应条件下 , R A P D 分析具有良好的稳定性和可重复性。
关键词 苹果 ; 山定子 ; R A P D ; 反应条件 ; 重复性
中图分类号 所 6 1 . 1
R A P D ( R
a n d o l l l A m p lif ed olP
y n 1 0印 hi c D N A , 随机扩增 多态性 D N A )是 19 0 年 由
w i l liams 等 [
’ ]与 w e l s h 和诫cl e l lan d [ 2 ]2 个研究小组在 P C R (几 l卿 e aser Ch a i n Rea c t ion , 聚
合酶链式反应 )的基础上发展起来的 1 种可对未知序列的基 因组 D N A 进行多态性检测 的
分子标记技术 。 和经典意义上的 P C R 相比 , 它具有随机引物易得 、无需预知核昔酸顺序 、多
态性检测率高以及可对整个基 因组进行检测等优点 。 和经典的分子标记技术 RF LP ( R e -
st ir ct ion F
r a g rn e nt eL
n g t h olP
y 比 oL 印hi sm ,限制性片段长度多态性 )相比 , R A尸D 具有 自动化
程度高 、简便快速 、 费用较低 、信息量大 、无放射性污染等优点 。 正因如此 , RA P D 技术 自问
世以来短短几年间已广泛应用于基因定位 、遗传连锁 图谱构建 、 遗传多样性分析 、 种质鉴定
以及起源 、演化和分类等诸多领域 , 成为当今最重要的分子生物技术之一〔3〕。 然而 , R A p l〕
也有其固有的缺点 , 即对反应条件 比较敏感 ,需要较严格的反应条件 。 因此 ,在进行 R八尸1)
分析时 , 首先要摸清其在供试材料上的最佳反应条件 ,建立起具有高度重复性的反应体系 。
苹果是我 国第一大果树 ,也是世界上最重要的果树之一 ,本研究拟通过对影响苹果属植
物 RA P D 分析诸因素的研究 , 建立起具有高度重复性和稳定性的苹果属 RA尸D 反应技术体
系 , 为 日后苹果属植物 D N A 水平上的研究提供参考 。
, 中韩青年科学家交流项 目
刘孟军 男 , 1 96 5 年 4 月生 ,研究员 , 理学博士 ,从事果树种质资源和分子 生物学研究
19 8 一 0 4 一 30 收稿 199 8 一 0 6 一 10 收修改稿
第 4 期 刘孟军等 :苹果属植物 R A尸D 分析的影响因素及其稳定性研究
1 材料与方法
1
.
1 材料
供试材料为富士苹果 ( 几轰Zl us P “ mi l avc .Fuji )和山定子 (初改lus 加 c at a)及其 2a生种
间杂种实生苗 , 分别采 自韩国国家园艺研究所苹果种质资源圃和杂种苗温室盆栽保存圃 。
幼叶在 5一 7 月间采集 , 枝皮在早春休眠期采集 , 不能及时提取 I〕N A 的材料保存于 一 70 ℃
冰箱 。
L Z D N A 模板制备
①改 良的高盐低 PH 值法 (中科院植物所系统与进化植物学开放实验室方法 )
②尿素法 (韩国国家园艺研究所生物工学实验室方法 )
1
.
3 R八卫D 分析
实验在韩国国家园艺研究所生物工学实验室进行 。 采用美国 0 伴orn 生物技术公 司的
10 碱基随机引物 , P找扣吐牡a 公司的 必汀P ,切斑亿” 旧e 和 B M 公司 (仅在 比较不同来源 T a q 酶
对 RA P D 结果的影响时用 )的 T aq 酶 , P C R 扩增使用 PE 一铭0 基因扩增仪 。 基本反应体系
为 50汕 反应体积中含 20 gn 模板 D N A 、 20 gn 引物 、 10 拜M d N T p 、 0 . 8 单位及卿脸” m e T a qp -
N A 聚合酶 、 5沁 10 X 酶稀释液和 35 . 6沁 重蒸水 ,反应液上扭盖 50 拜L 矿物油 , P C R 扩增程
序为 94℃预变性 5而 n ,然后 9 4℃ 1而 n , 3 7℃ 1而n , 72℃ Zn五n 循环 50 圈 ,最后在 72 ℃下延
伸 5而n 。 反应产物在电泳前存放于 4℃ 。 在做各影响因素的试验时 ,只改变相应因子 ,其它
条件不变 。
扩增产物在 1 . 2 %琼脂糖胶上电泳 , 电泳和制胶缓冲液用 0 . 5 x 的 T B E 。 电泳结束后
凝胶在 0 . 5滩南 I L 的 BE (澳化乙锭 )中染色 20 一 30 而 n , 而后在吨以二从溶液中清洗数秒钟 ,
于紫外灯下观察并照像 。
2 结果与分析
2
.
1 反应条件对 R A P D 结果的影响
实验结果表明 , R A I〕D 反应的各个条件因子均对 R A P I) 反应结果都有不同程度的影响 ,
这些 因子包括模板 I〕N A 浓度 、 弓l物碱基顺序 、 aT q D N A 聚合酶的种类和浓度 、 dN T P 浓度 、
P C R 反应循环数和 P C R 反应体积等 。
2
.
1
.
1 模板浓度对 RA P D 结果的影响 无论富士还是山定子 , 在其它反应条件不变的情
况下 , 50 拌L 反应体积中模板 D N A 用量在 1 一 320 gn 间均有扩增产物 。 富士苹果 D N A 用量
从 s gn 增加到 320 gn (相差 6 4 倍 )其 R A P D 谱带基本不变 , 山定子的 R八尸D 谱带至少在模板
D N A 用量从 s gn 提高到 20 gn (相差 4 倍 )之间保持稳定 (20 gn 以上缺乏完整的实验数据 尚
无法定论 ) 。 可见 ,相对来说 RA尸D 结果对模板 D N A 浓度不太敏感 。 然而 , 当模板 1〕N A 浓
度低于 s gn 时 , R A P D 带数明显减少 (见图 1 ) 。
2
.
1
.
2 引物浓度对 RA P D 结果的影响 不同引物对 R八r D 结果的影响在富士苹果和山定
子上表现一致 。 可以看出 ,在反应总体积为 50 拌L 其它因素不变的条件下 , 引物用量从 s gn
到 2 0gn (增加 4 倍 )间 , 随用量增加 RA尸D 带数增加 ,但超过 20 gn 以后 , RA p l〕谱带基本保
持稳定 (至少在 SOgn 以内 , 见图 2 ) 。
2
.
1
.
3 T a q 酶来源及其浓度对 R A P D 结果的影响 T a q D N A 聚合酶的种类和浓度都对



第 4 期 刘孟军等 : 苹果属植物 RA D P分析的影响因素及其稳定性研究 3 5
子为试材确定的最佳 RA I〕 D反应条件 , 与已往报道基本相符并具一定 的优越性 , 在苹果属
植物中可望有较广泛的适用性 。
R AP D 技术自 1 9 9 0 年问世以来 ,其重 复性 和可靠性一直是一个颇受争议的问题 。 的
确 ,和经典的 P C R 技术相比 , RA尸D 结果不仅带 型复杂 、 一些弱带难 以计数 , 而且容易受到
反应条件的影响 。 然而 ,随着 R A P I) 技术的不断成熟 , 越来越 多的证据表明 RA尸D 结果虽
然会因反应体系中各种成分 以及热循环程序等多种因素的改变而改变 , 但只要所用反应条
件和试验材料相同 , 不同研究者或不同研究室完全可以获得高度一致的结果 。
到 目前为止 , 通过对反应条件的优化 , R A尸D 技术的可重复性 已在枣 、小麦 、 紫杉 、脊椎
动物 、真菌和细菌等绝大多数供试生物材料上得到证实【“ 一川 。 本研究表明 , 只要严格采用
最佳反应条件 , R A尸D 结果 的可重复性是相当高的 , D N A 提取方法 (只要纯度达到要求 ) 、器
官 、组织及其发育阶段等对 R AP D 结果都无明显影响 , 通过使用高纯度 D N A 和优化 了的反
应条件以及只计数清晰的主带 , 同一样 品在不同重复和计数间的误差频率可控制在 3 % 以
下 。 此外 ,许多科学家通过与已公认的经典科学方法进行比较研究 , 从侧 面证明了 R AP D
技术的可靠性 ,如 P ar e nt J . G 等 ( 1 996) 用 R A P D 技术进行细菌鉴定取得了与经典的标准生
化测试方法完全一致的结果 l[ 〕。 总之 , 从绝大多数研究结果看 , 只要严格控制反应条件 ,
R A P D 技术的可重复性及可靠性是不容质疑的 。
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19 96
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(编辑 : 黄金祥 )
5 4 河 北 农 业 大 学 学 报 第 2 1卷
F a et o s rIn fl u en ci n g R A P D A n a ly si s i n G en u s 几 J dl u s
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