全 文 ：Vol. 31 No.4
Dec. 2013
第 31卷 第 4期
2013年 12月
经 济 林 研 究
Nonwood Forest Research
收稿日期：2013-05-15
基金项目：国家自然科学基金项目“苹果属四倍性皱叶矮生株系的生殖特征及形成机理研究”（30971975）。
作者简介：张丽杰（1972—）女，辽宁阜新人。博士研究生，从事林木种质资源及生物技术的研究。Tel：02488487150，
E-mail：zhanglijie_106@sina.com。
通讯作者：董文轩（1963—）男，河北三河人。教授，博士，博士研究生导师，从事果树种质资源的研究。Tel：13998813246，
E-mail：wxdong63@126.com。
植物的生殖发育阶段是其整个生命过程中
非常重要的阶段。由于植物的无融合生殖习性具
有重要的生物学意义，并在缩短育种周期、固定
杂种优势等方面具有重大潜力，因此，植物无融
合生殖研究已是生物学研究的热点之一。SERK
(Somatic Embryogenesis Receptor-like Kinase) 基
因，全称为“体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激
酶基因”[1]，是体胚发生过程中最重要的基因，通
常认为，SERK基因与无融合生殖习性密切相关。
SERK基因最初为 Schmidt等人 [2]在胡萝卜 Daucus
carota的下胚轴中发现。随后，有关研究者又在
拟南芥 Arabidopsis thaliana[3]、玉米 Zea may[4]、
苜蓿 Medicago truncatula[5]等植物中克隆和鉴定了
SERK基因。目前，科学家们已经从向日葵 Helian
thusannuus[6]、 鸭 茅 Dactylis glomerata[7]、 可 可
Theobroma cacao[8]、蜜柑 Citrus unshiu[9]、草地早
熟禾 Poa pratensis[10]等植物中分离到不同的 SERK
基因。有关研究结果证明，SERK基因广泛存在于
双子叶植物、单子叶植物及裸子植物中，组成了
一个新的基因家族 [11]。
无融合生殖现象在苹果属多倍体植物中普遍
存在。无融合生殖后代是母本的复制品，不含有
来自父本的遗传物质，保持了母本的全部特征。
平 邑 甜 茶 Malus hupehensis（Pamp.）Rehd. var
苹果属无融合生殖相关 SERK4 基因
表达载体的构建
张丽杰，董文轩
（沈阳农业大学 园艺学院，辽宁 沈阳 11 0866）
摘 要：为了探讨 SERK4基因影响苹果属平邑甜茶及其杂种后代 33#株系无融合生殖能力的分子机理，以平邑
甜茶及其杂种后代 33#子房 cDNA为模板，利用聚合酶链式反应（PCR）扩增出 SERK4基因，再将 SERK4基因
克隆到植物表达载体 pBI121中，获得了 SERK4基因的植物表达载体 pBI121-MhSERK4和 pBI121-MhdSERK4。
测序结果表明，pBI121-MhSERK4和 pBI121-MhdSERK4载体构建成功，可用于后续的转基因研究。
关键词：苹果属；MhSERK4基因；表达载体
中图分类号：S661.1 文献标志码：A 文章编号：1003—8981(2013)04—0078—04
Construction of SERK4 expression vectors of related apomicxis gene in Malus
ZHANG Li-jie, DONG Wen-xuan
(College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, Liaoning, China)
Abstract: I n order to expl ore molecular mechanism of SERK4 gene affects the apomicxis ability of Pingyi Tiancha (Malus
hupehensis var. pingyiensis) and hybrid strain 33#. SERK4 gene was amplifi ed by PCR, an d then SERK4 gene was cloned
in plant expression vector pBI121. the expression vectors of pBI121-MhSERK4 and pBI121-MhdSERK4 were obtained.
The sequencing results show that the vector construction of pBI121-MhSERK4 and pBI121-MhdSERK4 is successful, and
it can be used in the subsequent transgenic research.
Key words: Malus; MhSERK4 gene; expression vector
DOI:10.14067/j.cnki.1003-8981.2013.04.016
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pingyiensis Jiang是苹果属 Malus湖北海棠 Malus
hupehensis Rehd.的一个变种，是典型的无融合生
殖型三倍体植物。平邑甜茶具有非常高的无融合
生殖能力，其无融合生殖率在 95%以上；但其杂
交后代四倍性皱叶矮生株系的无融合生殖能力却
显著降低。
为了探索 SERK4基因在苹果属平邑甜茶及其
杂交后代 33#无融合生殖习性上的功能与作用，
阐明该基因在植物胚胎发育过程中的表达特性，
以平邑甜茶及其杂种后代 33#株系的 cDNA为模
板，扩增出 MhSERK4 和 MhdSERK4 基因 cDNA
全长，再将其克隆到植物表达载体 pBI 121中，获
得了 MhSERK4和 MhdSERK4基因的植物表达载
体 pBI121-MhSERK4 和 pBI121-MhdSERK4，旨在
将其转化到番茄中，为进一步研究 SERK基因影响
无融合生殖的机理提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 植物材料
供试的植物材料为苹果属三倍体无融合生殖
型 平 邑 甜 茶 Malus hupehensis (Pamp.) Rehd. var.
pingyiensis Jiang及其与扎矮山定子 M. baccata杂
交的后代四倍体皱叶矮生株系 33#的花期子房。
1.2 菌株与质粒
克隆载体 PGM-T购自天根生物公司，植物表
达载体 pBI121和农杆菌由沈阳农业大学张志宏教
授馈赠。
1.3 试 剂
限制性内切酶 XbaI和 SmaI、T4DNA连接酶、
AMV反转录酶等试剂购自 TAKARA生物公司，
DNA Marker购于北京天根生化科技有限公司，质
粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒均购
于上海生物工程公司。
1.4 方 法
1.4.1 引物设计与合成
根据已获得的平邑甜茶及其与扎矮山定子
杂交获得的杂种后代 33# 株系无融合生殖基因
MhSERK4 和 MhdSERK4 基因的 CDS 编码区设
计引物，在开放读码框两端分别设计上游引物和
下游引物，上游引物引入 XbaI酶切位点，下游
引物引入 SmaI酶切位点。引物由赛百盛生物公
司合成。
MhSERK4和 MhdSERK4引物设计如下：
上游引物 SF为 5’GGTCTAGAATGACGTCTT
CCACCTCTGTTTC 3’；
下游引物 SR为 5’ACCCCGGGTCATCTAGG
ACCGGACAACTCAT 3’。
1.4.2 平邑甜茶及其杂交后代皱叶矮生 33#株系
RNA的提取及 RT-PCR扩增
采用常规 CTAB法提取平邑甜茶及其杂交后
代皱叶矮生 33#株系的子房 RNA，在 20 μL的反
应体系中加入 RNA样品，在 AMV反转录酶作用
下合成 cDNA第一链。其反应程序为：65 ℃水浴
5 min，立即置于冰上 2～ 3 min，在 PCR仪中
37 ℃ 2.5 h，70 ℃ 15 min，使酶失活，反转录合
成 cDNA。
1.4.3 目的基因的扩增
目的基因的扩增采用 20 μL反应体系。上下
游 引 物 各 1 μL，dNTP 2.0 μL，ExTaq 0.25 μL，
10×Buffer 2.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 补足至
20 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性 5 min（94 ℃
变性 40 s，60 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 2 min）；
30 个循环；72 ℃后延伸 10 min。PCR 产物用
1.0%琼脂糖凝胶进行电泳纯化，去除引物及引物
二聚体，试剂盒回收目标条带。
1.4.4 pBI121-MhSERK4和 pBI121-MhdSERK4的
构建
将平邑甜茶及其杂种后代 33# 株系进行
PCR 扩增获得的 cDNA 全长序列测序正确的
PGM-MhSERK4 和 PGM-MhdSERK4 克隆载体与
CaMV35S组成型启动子驱动的 pBI121植物表达
载体分别用限制性内切酶 XbaI和 SmaI进行双酶
切，XbaI的识别位点为 TCT AGA，SmaI的识别
位点为 CCC GGG。酶切体系为 20 μL：XbaI和
SmaI各 1 μL，BSA 2 μL，10×Buffer 2 μL，目的
基因质粒14 μL。用琼脂糖凝胶电泳检测目的片段；
使用 AxyPrep胶回收试剂盒回收目的片段，并利
用 NEB公司生产的 T4DNA连接酶将 MhSERK4
和MhdSERK4基因定向插入 pBI121表达载体中报
告基因的位置，然后连接转化，挑取单克隆进行
PCR鉴定，将以 PCR法鉴定出的阳性克隆送北京
华大生物有限公司测序。
2 结果与分析
2.1 RNA质量检测
取 3 μg所提平邑甜茶和杂交后代 33#株系的
RNA，在 1%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，结
果如图 1所示。图 1显示，RNA条带清晰且完整。
使用美国 Beckman 公司生产的核酸蛋白分析仪检
测 RNA 的含量和质量，结果表明：OD260/OD280的
比值分别为 1.916 1和 1.926 3，说明 RNA的纯度
较高，无蛋白污染，可以用于后续的试验。
80 第 4期张丽杰，等：苹果属无融合生殖相关 SERK4基因表达载体的构建
2.2 目的基因的 PCR扩增
以平邑甜茶和杂种后代 33#子房 cDNA为模
板，采用设计的引物序列进行 PCR扩增，结果如
图 2所示。由图 2可知，扩增出约 1 836 bp的片段，
其大小与预期的结果一致，可以用于下一步的试验。
2.3 pBI121-MhSERK4载体的鉴定
用回收试剂盒回收 PCR产物，并且用 XbaI
M：左 1 kb、右 200 bp DNA标记；泳道 1～ 4：pBI121表达载体；泳道 5～ 8：平邑甜茶；泳道 9～ 12：33#
M: left 1 kb DNA marker; right 100 bp DNA marker; Lane 1-4: expression vector of pBI121; Lane 5-8: Pingyi Tiancha; Lane 9-12: 33#
图 3 双酶切鉴定结果
Fig. 3 Identifi cation result of double enzyme digestion
M：1 kb DNA标记；泳道 1～ 2：平邑甜茶；泳道 3～ 4：33#
M:1 kb DNA marker; Lane 1-2: Pingyi Tiancha; Lane 3-4: 33#
图 4 PCR鉴定结果
Fig. 4 PCR identifi cation result
泳道 1：平邑甜茶；泳道 2：33#
Lane 1: Pingyi Tiancha; Lane 2: 33#
图 1 RNA质量检测结果
Fig. 1 Result of RNA quality detection
M：DL2000 DNA标记；泳道 1：平邑甜茶；泳道 2：33#
M：DL2000 DNA marker; Lane 1: Pingyi Tiancha; Lane 2: 33#
图 2 PCR扩增结果
Fig. 2 Result of PCR amplifi cation
3 讨 论
成功构建载体是进行转基因研究的前提。植物
表达载体 pBI121是从根癌农杆菌双元质粒衍生而
来的，属组成型的表达载体，其大小为 14 753 bp，
带有多个克隆位点，上游带有 CaMV35S启动子，
下游带有 GUS报告基因 [12]；因此，pBI121是常
用的植物表达载体 [13]。在载体构建过程中会受到
多种因素的影响，不同的基因及不同的载体需要
不同的反应条件和体系。此外，基因序列的大小
和载体的不同也是影响载体构建的重要因素。为
了分析从苹果属分离出来的 MhSERK4基因的生
物学功能，通过 DNA测序和序列酶切位点分析，
以 XbaI和 SmaI限制性内切酶双酶切带有目的基
和 SmaI酶切 PCR产物，用限制性内切酶 XbaI和
SmaI酶切载体 pBI121，鉴定结果如图 3所示。然
后连接转化，挑取单克隆作 PCR鉴定，鉴定结果
见图 4。最后选取该阳性菌送往华大生物有限公司
进行测序分析，分析结果表明，其与 PCR扩增的
cDNA序列的同源性达 99.69%，说明是我们需要
的目的基因。这一结果与预期结果一致。
81第 31卷 经 济 林 研 究
因全长片段的克隆载体和 pBI121植物表达载体，
经 1%琼脂糖凝胶电泳分析回收后，成功构建了
MhSERK4和 MhdSERK4植物遗传转化载体，目前
正在进行转基因的研究。
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[本文编校：伍敏涛 ]