全 文 ：收稿日期:2015-08-12
基金项目:辽宁中医药大学杰出青年基金(20121228);辽宁省高等学校杰出青年学者成长计划(LJQ2014101);“我国水生、耐盐中药资源
的合理利用研究”项目(201407002)
作者简介:陈思有(1990-)，男，在读硕士研究生，专业方向:中药种质资源鉴定;Tel:18512451533，E-mail:284812122@ qq. com。
* 通讯作者:许亮，Tel:15998541918，E-mail:861364054@ qq. com。
棘豆属蒙药材的 DNA条形码鉴定研究
陈思有1，吴亚男1，许 亮1* ，冯全君2，王 冰1，康廷国1，赵 容1
(1. 辽宁中医药大学，辽宁 大连 116600;2. 赤峰市创新中蒙药研究所有限公司，内蒙古 赤峰 024000)
摘要 目的:利用 ITS2 序列对棘豆属蒙药材进行分子鉴定。方法:对棘豆属正品药材硬毛棘豆 Oxytropis fetiss-
ovii Bge.、多叶棘豆 Oxytropis myriophylla (Pall.)DC. 样品和伪品大花棘豆 Oxytropis grandiflora (Pall. )DC. 样品的
ITS2 序列进行了 PCＲ扩增和测序。为扩大研究范围，又从 GenBank中下载了棘豆属与黄芪属植物样本的 ITS2 序
列。经 ITS2 Database网站处理截取 ITS2 序列，并采用 MEGA 5. 10 计算相关数据，基于 K2P 模型构建聚类树(NJ
树)。并从 ITS2 网站上获得样本及下载序列的 ITS2 二级结构信息，分析各样本间 ITS2 序列二级结构的差异。结
果:棘豆属药材的 ITS2 序列较短，序列长度为 216 ～ 218 bp，有利于 DNA的提取、PCＲ扩增和测序。多叶棘豆 Oxyt-
ropis myriophylla (Pall.)DC.、硬毛棘豆 Oxytropis fetissovii Bge. 与大花棘豆 Oxytropis grandiflora (Pall. )DC. 的种内
遗传距离大于种间遗传距离。在 NJ树模型中，棘豆属正品药材与非正品样品可以区分开;与黄芪 Astragalus mem-
branaceus (Fisch.)Bge. 比较也可以区分开。结论:以 ITS2 序列为标准的 DNA条形码能够有效的鉴定棘豆属药材。
关键词 ITS2;分子鉴定;棘豆属;二级结构
中图分类号:Ｒ282. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2016)02-0284-05
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2016. 02. 012
DNA Barcoding of Mongolian Oxytropis Medicinal Materials
CHEN Si-you1，WU Ya-nan1，XU Liang1，FENG Quan-jun2，WANG Bing1，KANG Ting-guo1，ZHAO Ｒong1
(1. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China;2. Neimenggu Chuangxin Mongolian Medicine Ｒe-
search Institute Ltd.，Chifeng 024000，China)
Abstract Objective:To identify Oxytropis medicinal materials using ITS2 sequence. Methods:The second internal transcribed
spacer(ITS2)of Oxytropis fetissovii，Oxytropis myriophylla and Oxytropis grandiflora medicinal material samples was amplified by PCＲ
and sequenced. To expand scope of the research topic，ITS2 sequences of related species were downloaded from GenBank. Sequences as-
sembly and consensus sequence generation were performed by ITS2 Database. The related data analysis and processing was performed u-
sing software MEGA 5. 10 and the NJ tree was constructed. The ITS2 secondary structure was predicted using ITS2 web server，and the
differences of the ITS2 secondary structures of the samples were analyzed. Ｒesults:Oxytropis medicinal materials ITS2 sequence was
shorter，with sequence length of 216 ～ 218 bp，which was in favor of DNA extraction，PCＲ amplification and sequencing. Genetic dis-
tances of Oxytropis myriophylla，Oxytropis fetissovii and Oxytropis grandiflora were much larger than the genetic distances of them-
selves. In the NJ tree，Oxytropis medicinal materials and counterfeits could be distinguished，and Oxytropis medicinal materials could be
distinguished from Astragalus membranaceus. Conclusion:The DNA barcode based on ITS2 sequence is a powerful and efficient tool for
identification of Oxytropis medicinal materials.
Key words ITS2;Molecular identification;Oxytropis;Secondary structure
蝶形花科棘豆属植物在蒙医药中多有药用〔1〕，
具有重要的药用价值，同时棘豆属植物在我国有丰
富的野生资源〔2〕。棘豆属蒙药材具有清热解毒、生
肌愈疮、止血、镇痛、抗炎等功效〔3，4〕，其中硬毛棘豆
Oxytropis fetissovii Bge. 、多叶棘豆 Oxytropis myrio-
phylla (Pall. )DC. 在《蒙药正典》《内蒙古中草药》
《认药白晶鉴》等中蒙药典籍中均有记载，而大花棘
豆 Oxytropis grandiflora (Pall. )DC. 则为棘豆属非正
品来源。
DNA条形码(DNA barcoding)技术是一种运用
分子生物学手段鉴定中药材的方法，与传统的中药
材鉴定方法相比，不但可以迅速、准确地辨别和鉴定
中药材品种，而且不需要研究人员具备丰富的植物
形态学与中药鉴定学经验，是一种高科技现代化的
中药材鉴定技术〔5〕。该技术通过从中药材中提取
到合适的 DNA片段进行鉴定，其中内转录间隔区 2
(Internal Transcribed Spacer 2，ITS2)序列长度适合
扩增与测序，而且具备易操作、鉴定准确等优点，在
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中药鉴定研究中应用越来越多，已经成为一种方便
有效的中药材的鉴定方法〔6〕，DNA条形码技术也已
成为 2015 年版中国药典收录的鉴定方法之一。
本研究对棘豆属 2 种正品药材与 1 种棘豆属非
正品样品进行 DNA鉴定，从多叶棘豆 Oxytropis myr-
iophylla (Pall. )DC. 、大花棘豆 Oxytropis grandiflora
(Pall. )DC. 、硬毛棘豆 Oxytropis fetissovii Bge. 的样
品中提取 DNA，并对其 ITS2 序列进行研究分析，旨
在为多叶棘豆药材与硬毛棘豆药材的准确鉴定提供
参考。
1 材料与方法
1. 1 材料、仪器与试剂
1. 1. 1 材料:材料来源见表 1，包括采集样品和在
GenBank中获取的序列，共 2 属 6 个物种 25 个样
本。实验样品经笔者王冰教授鉴定。
1. 1. 2 仪器:MG96G型 PCＲ仪(杭州朗基科学仪
表 1 棘豆属和黄芪属药用植物的样本信息
样本编号 基原物种 拉丁学名 采集地 GenBank登录号
A1 大花棘豆 Oxytropis grandiflora (Pall.)DC. 辽宁凤城市 KT372215
A2 大花棘豆 Oxytropis grandiflora (Pall.)DC. 辽宁凤城市 KT372235
A3 大花棘豆 Oxytropis grandiflora (Pall.)DC. 辽宁凤城市 KT372216
A4 大花棘豆 Oxytropis grandiflora (Pall.)DC. 辽宁凤城市 KT372217
A5 大花棘豆 Oxytropis grandiflora (Pall.)DC. 辽宁凤城市 KT372218
A6 大花棘豆 Oxytropis grandiflora (Pall.)DC. 辽宁凤城市 KT372219
B1 多叶棘豆 Oxytropis myriophylla (Pall.)DC. 内蒙古通辽市 KT372220
B2 多叶棘豆 Oxytropis myriophylla (Pall.)DC. 内蒙古通辽市 KT372221
B3 多叶棘豆 Oxytropis myriophylla (Pall.)DC. 内蒙古通辽市 KT372222
B4 多叶棘豆 Oxytropis myriophylla (Pall.)DC. 内蒙古赤峰市 KT372223
B5 多叶棘豆 Oxytropis myriophylla (Pall.)DC. 内蒙古赤峰市 KT372224
B6 多叶棘豆 Oxytropis myriophylla (Pall.)DC. 内蒙古赤峰市 KT372225
B7 多叶棘豆 Oxytropis myriophylla (Pall.)DC. 辽宁朝阳市 KT372226
B8 多叶棘豆 Oxytropis myriophylla (Pall.)DC. 辽宁朝阳市 KT372227
B9 多叶棘豆 Oxytropis myriophylla (Pall.)DC. 辽宁朝阳市 KT372228
B10 多叶棘豆 Oxytropis myriophylla (Pall.)DC. 辽宁朝阳市 KT372229
C1 硬毛棘豆 Oxytropis fetissovii Bge. 辽宁朝阳市 KT372230
C2 硬毛棘豆 Oxytropis fetissovii Bge. 辽宁朝阳市 KT372231
C3 硬毛棘豆 Oxytropis fetissovii Bge. 内蒙古赤峰市 KT372232
C4 硬毛棘豆 Oxytropis fetissovii Bge. 内蒙古赤峰市 KT372233
C5 硬毛棘豆 Oxytropis fetissovii Bge. 内蒙古赤峰市 KT372234
C6 硬毛棘豆 Oxytropis fetissovii Bge. 内蒙古赤峰市 KT372236
D1 小花棘豆 Oxytropis glabra (Lam. )DC. GenBank KJ143729
D2 黄花棘豆 Oxytropis ochrocephala Bge. GenBank KJ143723
E 黄芪 Astragalus membranaceus (Fisch.)Bge. GenBank HQ891827
器有限公司);Tanon-4100 凝胶图像处理系统(上海
天能科技有限公司);台式冷冻离心机(Fresco) ;
HH-S型数显恒温水浴锅(巩义予华仪器有限责公
司);EPS-600 型电泳仪(上海天能科技有限公司)。
1. 1. 3 试剂:5k DNA Marker(北京全式金生物技
术有限公司);EB(上海 Sangon 公司);Taq Master-
Mix(康为世纪);植物基因组 DNA 提取试剂盒(离
心柱型，TIANGEN);琼脂糖等。其余试剂均为分析
纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 DNA的提取:通过植物基因组 DNA提取试
剂盒提取总 DNA，用硅胶将新鲜叶片干燥，取干燥
叶片，用研钵研碎，将研好的样品粉末取约 30 mg，
按照试剂盒说明书完成对总 DNA的提取。
1. 2. 2 PCＲ 扩增及测序:引物包括正向引物
ITS2F:5-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3，反向引物
ITS3Ｒ:5-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3。PCＲ 反
应体系 50 μL，正反引物各 2. 0 μL(2. 5 μmol /L)，25
μL Taq Master Mix，总 DNA 4. 0 μL(约 40 ng) ，加
ＲNase-Free Water补足至 50 μL。扩增程序:94 ℃预
变性 5 min;94 ℃变性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延
伸 45 s，40 个循环;72 ℃延伸 10 min。扩增产物用
琼脂糖凝胶电泳检测，由北京华大基因研究中心纯
化及测序。
·582·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 39 卷第 2 期 2016 年 2 月
1. 2. 3 序列分析及系统树构建:测序后所得序列
通过 ITS2 Database 网站处理，使用 HMMer 注释方
法去除两端 5. 8S和 28S区段获得 ITS2 序列〔7〕。将
所有序列用软件 MEGA 5. 10 对数据进行分析、处
理〔8-10〕。用 NJ Tree(邻接)法构建系统聚类树，鉴定
分析各物种〔11，12〕。
2 结果与分析
2. 1 PCＲ扩增结果 棘豆属 ITS2 序列的琼脂糖凝
胶电泳检测 PCＲ 扩增结果的凝胶成像如图 1 所示。
由图 1 可知，棘豆属植物样品 ITS2 序列的 PCＲ 扩
增均成功;样品 ITS2 序列也均测序成功。表明棘豆
属蒙药材 ITS2 序列长度适合 PCＲ扩增与测序。
图 1 棘豆属植物样品 ITS2 正反引物的 PCＲ扩增结果
注:M为 5k DNA Marker;A1 ～ A6 与 B1 ～ B10 为样品编号
2. 2 种内和种间变异 棘豆属 5 种 24 个样本的
ITS2 序列长度为 212 ～ 218 bp，GC 含量为 51. 63%
～53. 36%。应用 MEGA 5. 10 软件对样品进行多序
列比对，5 种物种间的碱基变异位点有 5 个，为 36、
42、95、123、158 bp。大花棘豆、多叶棘豆和硬毛棘
豆种内 K2P遗传距离都为(0. 000)，没有发现种内
变异。大花棘豆与多叶棘豆、小花棘豆的种间 K2P
遗传距离(0. 014)，与硬毛棘豆、黄花棘豆的种间
K2P遗传距离(0. 019)，大于 3 种棘豆属植物种内
K2P遗传距离(0. 000)。多叶棘豆与硬毛棘豆种间
K2P遗传距离为(0. 005)，虽然大于两者的种内遗
传距离(0. 000)，但两者种间 K2P 遗传距离相对较
小，可以推断两者亲缘关系较近。而小花棘豆与大
花棘豆种间 K2P 遗传距离为 0. 014，与多叶棘豆种
间 K2P遗传距离为 0. 009，与硬毛棘豆、黄花棘豆种
间 K2P遗传距离为 0. 014。结果表示，5 种棘豆属
植物的种内遗传分化明显低于种间遗传分化，表明
可以使用 ITS2 片段分析物种种内种间 K2P 遗传距
离对 5 种棘豆属植物加以区分，见表 2。
2. 3 系统树聚类分析 棘豆属植物 ITS2 序列构建
表 2 棘豆属样本 ITS2 序列的 K2P遗传距离
A1 A2 A3 A4 A5 A6 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 C1 C2 C3 C4 C5 C6 D1
A2 0. 000
A3 0. 000 0. 000
A4 0. 000 0. 000 0. 000
A5 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000
A6 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000
B1 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014
B2 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 000
B3 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 000 0. 000
B4 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 000 0. 000 0. 000
B5 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000
B6 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000
B7 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000
B8 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000
B9 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000
B10 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000
C1 0. 019 0. 019 0. 019 0. 019 0. 019 0. 019 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005
C2 0. 019 0. 019 0. 019 0. 019 0. 019 0. 019 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 000
C3 0. 019 0. 019 0. 019 0. 019 0. 019 0. 019 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 000 0. 000
C4 0. 019 0. 019 0. 019 0. 019 0. 019 0. 019 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 000 0. 000 0. 000
C5 0. 019 0. 019 0. 019 0. 019 0. 019 0. 019 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000
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续表 2
A1 A2 A3 A4 A5 A6 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 C1 C2 C3 C4 C5 C6 D1
C6 0. 019 0. 019 0. 019 0. 019 0. 019 0. 019 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000
D1 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 009 0. 009 0. 009 0. 009 0. 009 0. 009 0. 009 0. 009 0. 009 0. 009 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014
D2 0. 019 0. 019 0. 019 0. 019 0. 019 0. 019 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 014 0. 019 0. 019 0. 019 0. 019 0. 019 0. 014 0. 014
的 NJ系统聚类树(图 2)中表示，同属 3 种样品序列
和 GenBank获取的 2 种植物序列都可以被区分，大
花棘豆与小花棘豆、黄花棘豆被聚为一个分支，并且
具有较高的支持率(高于 50%)。硬毛棘豆与多叶
棘豆被聚为一个分支，但支持率较低(低于 50%)。
所有的棘豆属植物都与同科不同属的黄芪区分开。
而且通过 NJ系统聚类树可发现，大花棘豆与小花棘
豆、黄花棘豆的亲缘关系较近，硬毛棘豆与多叶棘豆
的亲缘关系较近。结果表明，使用 ITS2 序列片段
NJ系统分类树也可以将棘豆属的硬毛棘豆、多叶棘
豆、大花棘豆等近缘种很好的区分开。说明运用
ITS2 序列 NJ系统分类树可以鉴定棘豆属蒙药材。
图 2 基于 ITS2 序列构建的棘豆属及黄芪属
25 个样品的 NJ系统聚类树
注:分支上部数值表示 NJ分析对该分支的支持强度(≥30%)
2. 4 棘豆属 ITS2 序列的二级结构分析 通过 ITS2
DataBase 网站对大花棘豆、多叶棘豆和硬毛棘豆进
行二级结构预测，如图 3，3 种植物的二级结构大体
一致，在茎环(Loop)的数目、大小、位置以及螺旋发
出时的角度都几乎相同。
3 讨论
图 3 棘豆属 ITS2 序列的二级结构比较
A. 大花棘豆 B. 多叶棘豆 C. 硬毛棘豆
本研究中的多叶棘豆和硬毛棘豆均被《内蒙古
蒙药材标准》所收录，为应用十分广泛、野生资源丰
富的蒙药材〔13〕。棘豆属蒙药材的主要化学成分为
黄酮类成分，同时有研究表明多叶棘豆药材和硬毛
棘豆药材中成分基本一致〔2〕。由于我国的棘豆属
植物种类众多，而且多数具有毒性，对棘豆属蒙药材
的准确鉴定就尤为重要。棘豆属蒙药材的传统鉴定
方法主要依靠形态学特征鉴别，但环境因素有可能
对形态特征造成影响或改变，导致药材的鉴定存在
一定难度，所以对其药材的准确鉴定对棘豆属蒙药
材安全使用显得至关重要。
目前对棘豆属蒙药材的鉴定研究主要是以传统
形态学特征为依据，通过分子生物学手段对其药材
进行鉴别的研究还较少。本研究收集来自辽宁、内
蒙古的 22 个药材样品为实验材料，其 ITS2 序列适
合 DNA提取扩增和测序，说明本实验方法适用于棘
豆属蒙药材，而且 DNA 条形码 ITS2 鉴定技术可以
有效的从来自不同产地的样品中获取 DNA 条形码
序列。本实验将来自辽宁凤城市白云山的大花棘豆
作为棘豆属非正品样品与多叶棘豆和硬毛棘豆比
较。利用对 ITS2 序列的比对和分析对棘豆属植物
进行鉴别，通过对同属种内和种间遗传距离、异属种
间遗传距离比较、系统聚类树分析及 ITS2 序列二级
结构的比较，其结果表明，在属、种的水平上，ITS2
序列种间变异均大于种内变异，说明棘豆属蒙药材
可以通过 ITS2 序列鉴定;且棘豆属药材的 ITS2 序
列较短。中药材中 DNA 容易发生降解，所以短的
DNA序列易于从已经降解的样品序列中获取〔14〕，
这会使棘豆属蒙药材在实际鉴定中的难度降低。在
棘豆属植物二级结构比较中发现其二级结构差异化
小，只在相同位置相差 1 个鸟嘌呤和 1 个腺嘌呤，对
于棘豆属植物二级结构的分析有待进一步研究。综
上所述，棘豆属蒙药材可以通过 ITS2 序列鉴别，并
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且 ITS2 序列可以作为 DNA条形码候选序列。棘豆
属药材分布广泛，药效明确，该结论对棘豆属药材的
标准化及安全使用、分子鉴定等方面具有重要的意
义。
参 考 文 献
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