全 文 ：环球中医药 2015 年 11 月第 8 卷第 11 期 Global Traditional Chinese Medicine，November 2015，Vol. 8，No. 11 1309
·巴西草药研究专题·
基金项目:国家国际科技合作专项(2011DFA31370)
作者单位:450004 郑州，河南省药品审评认证中心(余春霞) ;
北京中医药大学中药学院［臧艺玫(硕士研究生)、顾选、吴浩忠、刘
春生、马长华］，针灸推拿学院(赵百孝) ，中医养生学研究所［韩丽
(硕士研究生) ］;北京华邈中药工程技术开发中心(顾选)
作者简介:余春霞(1972 － ) ，女，本科，工程师。研究方向:中药
制剂与分析。E-mail:ycxzzh@ 126． com
通讯作者:刘春生(1964 － ) ，教授，博士生导师。研究方向:药
用植物与分子生药学。E-mail:max_liucs@ 263． net
基于性状—显微—DNA 条形码联用的巴西
牛至属植物药 HORTELA基原鉴定研究
余春霞 臧艺玫 顾选 吴浩忠 马长华 韩丽 刘春生 赵百孝
【摘要】 目的 利用性状—显微—DNA条形码联用的方法对巴西牛至属植物药 HORTELA 进
行基原鉴定研究。方法 应用性状鉴定的方法初步对药材进行真伪鉴别;再应用显微鉴定的方法
验证性状鉴定结果;最后提取样品 DNA，扩增 ITS序列，利用 NCBI数据库中的 BLAST功能分析相似
度，对样品品种进行 DNA条形码鉴定。结果 性状—显微—DNA 条形码综合分析结果表明，该样
品为牛至属植物 Origanum elongatum(Bonnet)Emb． ＆ Maire．的干燥地上部分。结论 HORTELA可
能为多基原植物类药材，其来源为牛至属 Origanum elongatum (Bonnet)Emb． ＆ Maire． 和薄荷属
Mentha rotundifolia (Linn．)Huds．干燥地上部分。
【关键词】 牛至属; 基原鉴定; DNA条形码
【中图分类号】 R284． 1 【文献标识码】 A doi:10. 3969 / j. issn. 1674-1749. 2015. 11. 009
The variety identification of HORTELA in Brazil based on a combined analysis of macroscopic-mi-
croscopic-DNA barcoding YU Chun-xia，ZANG Yi-mei，GU Xuan，et al． Henan Province for Drug E-
valuation Certification Center，Zhengzhou 450004，China
Corresponding author:LIU Chun-sheng，E-mail:max_liucs@ 263． net
【Abstract】 Objective To study the variety identification of HORTELA of Origanum Linn． in Bra-
zil with a combined analysis of macroscopic-microscopic-DNA barcoding． Methods Macroscopic identifi-
cation was used to identify the authenticity of samples preliminarily;then the results was verified by micro-
scopic identification;finally，ITS sequences were amplified by PCR and sequenced，and BLAST in NCBI
(basic local alignment search tool)database was used to calculate the similarity of sequences to identify va-
riety of samples． Results The combined analysis of macroscopic-microscopic-DNA barcoding indicated
that Hortela collected from market in Brazil is the dried overground part of Origanum elongatum(Bonnet)
Emb． ＆ Maire． Conclusion HORTELA may be a multi-source herb ，which originates from the dried over-
ground part of Origanum elongatum(Bonnet)Emb． ＆ Maire and Mentha rotundifolia (Linn．)Huds．
【Key words】 Origanum Linn．; Variety identification; DNA barcoding
巴西草药 HORTELA 是巴西民族的常用药，作
者在巴西市场收集药材样本时发现，HORTELA 被人
们当做圆叶薄荷 Mentha Rotundifolia(又称为 Mentha
suaveolens)出售及使用，但初步观察其性状与圆叶
薄荷并不完全相同，因此有必要对该药材进行基原
鉴定研究。
传统的植物药鉴定有性状鉴定和显微鉴定
等，二者的优点是简单、易行，不足之处是其主观
性较强，且对属内近缘种药材的鉴别能力较
差［1-2］。DNA 条形码鉴定技术具有高效、准确、客
观优点［3-4］，其中内转录间隔区(internal transcribed
spacer，ITS)序列应用最为广泛［5-6］。本文提出性
状—显微—DNA条形码联用的方法对植物药进行
鉴定，首先通过性状鉴定初步对药材进行真伪鉴
别，再用显微鉴定的方法验证性状鉴定结果，然后
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应用 DNA 条形码鉴定的方法，利用 NCBI 核酸数
据库中已注册的 ITS 序列进行相似度分析，确定待
测样品的品种。
本实验拟采用性状—显微—DNA 条形码联用
的方法对巴西植物药 HORTELA 进行基原鉴定，为
保证其质量及安全用药提供依据。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
HORTELA药材 10 份，每份 200 g，2012 年 4 月
购买于巴西隆城市场药材集散地。样品的凭证标
本保存于北京中医药大学大学标本室。
1． 2 试剂
广谱植物基因组 DNA 快速提取试剂盒(北京
博迈德生物有限公司，批号:69632855) ;rTaq酶(上
海生工生物工程有限公司，批号:695672BE) ;乙醇
(北京化工厂，批号:1124120381060079) ;琼脂糖
(BIOWEST，批号:142045) ;ddH2O等。
1． 3 仪器
显微镜(OLYMPUSCX-21，中国) ;SY-601 超级恒
温水浴(天津欧诺仪器仪表有限公司) ;L-901 涡旋振
荡仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司) ;JA1103N
千分之一精密电子天平;SIGMA3K-15 低温高速离心
机(SIGMA公司) ;TECHNE TC-3000PCR扩增仪;Bio-
Rad电泳仪;水平电泳槽(北京六一仪器厂) ;JS-680B
全自动凝胶成像分析仪(上海培清科技有限公司) ;
GRANT制冰机;超纯水制备系统;KQ5200E 型超声
波清洗器;SANYO － 80℃超低温冰箱(SANYO 公
司) ;DHG-9145A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒
科学仪器有限公司)等。
1． 3 基于性状的鉴定方法
对 HORTELA 样品通过眼观、手摸、鼻闻、口尝
等方法观察其形状、大小、颜色、表面特征、质地、折
断面等的性状特征。
1． 4 基于显微的鉴定方法
每份样品取 30 mg研磨至粉末，取粉末少许，置
载玻片上，滴加水合氯醛液，在小火上微微加热透
化，加热时需续加水合氯醛液至透化清晰为度。为
避免放冷后析出水合氯醛结晶，可在透化后加稀甘
油少许，再加盖玻片。在显微镜下观察其显微特征。
1． 5 基于 ITS序列的 DNA条形码鉴定方法
取 10 份样品，观察形态，形态结果一致。每份
样品取 40 mg 进行 DNA 提取。各份样本分别用液
氮冷冻后研磨成细粉，按照广谱植物基因组 DNA 快
速提取试剂盒操作步骤提取样品 DNA，1%琼脂糖
凝胶电泳检查 DNA 纯度及完整性。采用 ITS 序列
通用引物对样品进行 PCR 扩增，ITS-R:5-CGTAA-
CAAGGTTTCCGTAGGTGAA -3， ITS-F:5-TTATT-
GATATGCTTAAACTCAGCGGG -3。PCR扩增条件:
50 μL体系含 2 × Taq PCR MasterMix 25 μL，ITS-R
(5 μmol /L)2． 5 μL，ITS-F(5 μmol /L)2． 5 μL，
DNA 模板 4 μL，ddH2O 16 μL。PCR 扩增程序:
94 ℃预变性 5 分钟，94 ℃ 变性 1 分钟，56 ℃ 退火 1
分钟，72℃ 延伸 1 分钟，35 个循环;72℃再延伸 10
分钟。PCR 产物经 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测，条
带单一明亮者即扩增成功。PCR 扩增产物经纯化
后，送上海生工生物工程有限公司测序部测序。各
样品均采用正向和反向测序，以保证测序的准确性。
利用 ContigExpress软件对测序获得的正、反向
序列进行拼接，以 TCGA /T 和 GACCC /TC 作为 ITS
序列边界截取 ITS 序列，然后利用相似度法分析
序列。
根据 NCBI 中相似度搜索法(basic local align-
ment search tool，BLAST)功能，检索样品的 ITS 序
列，本文以相似度 90%以上为属的鉴定依据，以相
似度 97%以上的最高相似度物种为物种鉴定依据，
获得鉴定结果。若 BLAST 比对后得到的序列相似
度均在 97%以下，则认为数据库中可能未注册该序
列，此时，根据“基于 ITS 序列的鉴定方法”仅能鉴
定到属水平;该属中未注册序列的物种可能为鉴定
结果。
2 结果
2． 1 性状鉴定结果
本样品叶多皱缩卷曲，完全展平后呈阔卵形或
阔椭圆形，有的为小碎末。长 0． 5 ～ 1． 2 cm，宽 0． 3
～ 1． 2 cm。表面棕褐色或棕绿色，有 1 mm 左右的
白色柔毛;叶背面棕灰色，柔毛较少，可见棕色小点
密集，叶脉明显。叶端渐尖或钝形，基部截斜，全
缘，有短叶柄。有特殊的清凉香气，味辛辣。茎呈
方形，直径 1 mm 左右，褐色或棕黄色。叶对生，节
略膨大。皮部易于木部分离，表面光滑。断面黄白
色，髓中空。质脆。有特殊的清凉香气，味酸、涩、
微苦。见图 1。
参考《中国植物志》的记载，可知本样品与圆叶
薄荷 Mentha rotundifolia(Linn．)Huds． 的叶片大小、
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叶片边缘锯齿等性状特征均不相符合，样品与牛至属
Origanum植物性状特征较为符合，但由于鉴定者经验
有限，暂不能根据其性状对该样品进行准确鉴定。
图 1 巴西植物药 HORTELA性状特征
2． 2 显微鉴定结果
本品粉末呈棕黄色，其显微特征如下:薄壁细
胞呈多角形;多为梯纹导管，有时可见螺纹导管;腺
鳞头部 8 个细胞，柄部为单细胞;气孔直轴式;纤维
成束。见图 2。
1．薄壁细胞 2．导管 3．腺鳞 4．气孔 5．纤维
图 2 巴西植物药 HORTELA的粉末特征图
由于显微特征专属性不强，且缺少参考资料，
无法根据显微特征对该样品基原进行准确鉴定。
2． 3 DNA条形码鉴定结果
10 份样品的测序峰图良好，测序结果一致，选
择一条序列用于后续分析。截取 ITS 片段后，经
BLAST分析，样品 ITS 序列与牛至属植物 Origanum
elongatum (Bonnet)Emb． ＆ Maire．(GU381465． 1)、
Origanum vulgare(GU381469． 1)、Origanum dictamnus
(GU381464． 1)、Origanum majoranae(JX162835． 1)、
Origanum rotundifolium(GU381463． 1)、Origanum sca-
brum(EU252138． 1)、Origanum syriacum(JX163036．1)、O-
riganum virens (EU252126． 1 )、Origanum dayi
(GU381466． 1)、Origanum onites(JX162994． 1)相似度
在 97%以上，其中，与 Origanum elongatum (Bonnet)
Emb． ＆ Maire． (GU381465． 1)的得分和相似度最
高，达到 99%。而样品 ITS 序列与薄荷属圆叶薄荷
Mentha rotundifolia(Linn．)Huds(AF369161． 1)的相
似度为 83． 76%，远低于与牛至属物种相似度。
根据现有数据库，由于样品与 Origanum elonga-
tum(Bonnet)Emb． ＆ Maire．(GU381465． 1)序列相似
度为 99%，且该物种在巴西分布［7］。因此，鉴定该样
品为Origanum elongatum(Bonnet)Emb． ＆ Maire．，但
目前暂无其性状及显微鉴定参考依据。
3 讨论
性状—显微—DNA 条形码联用的鉴定技术适
用于无背景信息或背景信息不准确的植物药基原
鉴定研究。第一步依据鉴定者的经验对样品进行
性状鉴定，该方法经济、快速，可鉴别出性状特征明
显的伪品;第二步通过显微鉴定方法提高性状鉴定
结果的客观性。两种传统鉴定方法的联合对样品
鉴定的准确性明显提高，但对于同属近缘种样品的
基原判断仍存在困难，且有相当数量的植物药性状
及显微特征未被记载，难以找到参考文献进行比对
核实。鉴于此，本研究团队在传统鉴定方法的基础
上，增加了第三步即 DNA 条形码鉴定方法，通过样
品的 ITS等序列分析对样品进行准确定种。性状—
显微—DNA条形码三种方法的联合实现了对样品
的多层次鉴定，达到了植物类药材准确、客观、快速
鉴定的要求。
本文研究表明，本次收集的 Hortela 样品的基原
植物为 Origanum elongatum (Bonnet)Emb． ＆ Maire．
而非圆叶薄荷 Mentha rotundifolia(Linn．)Huds，故
植物类药材 Hortela 可能存在同名异物现象。薄荷
属植物含有薄荷醇(Menthol)、香芹酮(Carvone)、薄
荷酮(Menthone )、α-蒎烯(α-Pinene)、β-蒎烯(P-Pi-
nene)、桧稀(Sabinene)、柠檬烯(Limonene)等成
分［7-8］，具有发汗、退热、抗炎、抗菌、镇痛、抗呼吸道
过敏等作用［7-9］;牛至属植物主要含有香芹酚(Car-
vacrol)、百里酚(Thymol)、伞花烃(Cymene)、γ-松油
烯(γ-Terpinen)等成分［10-11］，有抗菌、消炎、镇痛、调
节免疫、扩张支气管等功效［12-14］。牛至属植物与薄荷
属植物药的化学成分有差异但功效基本相同，故推测
Hortela为多基原植物类药材，其来源为牛至属 Origa-
num elongatum(Bonnet)Emb． ＆ Maire．和薄荷属 O-
riganum elongatum (Bonnet)Emb． ＆ Maire．干燥地上
部分，但该结论仍需进一步实验证实。
参 考 文 献
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(收稿日期:2015-08-18)
(本文编辑:蒲晓田)
基金项目:国家国际科技合作专项(2011DFA31370)
作者单位:100102 北京中医药大学中药学院［臧艺玫(硕士研究生)、顾选、肖瑶、刘春生、马长华］，针灸推
拿学院(赵百孝) ，中医养生学研究所(韩丽) ;北京华邈中药工程技术开发中心(顾选) ;河南省药品审评认证中心
(余春霞)
作者简介:臧艺玫(1990 － ) ，女，2013 级在读硕士研究生。研究方向:药用植物与分子生药学。E-mail:meiy-
ee0810@ sina． com
通讯作者:赵百孝(1963 － ) ，教授，博士生导师。研究方向:针灸推拿。E-mail:baixiao100@ gmail． com
基于 DNA 条形码—产地—形态分析联用
的巴西马钱属植物药 QUINA基原鉴定研究
臧艺玫 顾选 余春霞 肖瑶 赵百孝 刘春生 马长华 韩丽
【摘要】 目的 通过 DNA条形码—产地—形态分析联用的方法对巴西马钱属植物药 QUINA
进行基原鉴定研究，为这种药材的开发利用提供依据。方法 通过提取样品 DNA、PCR扩增及双向
测序，获得样品的内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)序列，利用 NCBI数据库中的 BLAST
功能计算相似度，对其基原进行 DNA条形码鉴定;根据其产地信息对 DNA 条形码鉴定结果进行筛
选和分析;依据其形态特征验证鉴定结果。结果 本次收集的植物类药材 QUINA 来源于马钱科马
钱属植物 Strychnos pseudo quina A． St． -Hil．的根皮。结论 DNA条形码—产地—形态三者联用的方
法可弥补单一鉴定方法的不足，能够快速、准确的对未知样品进行基原鉴定。
【关键词】 马钱属; ITS序列; 基原鉴定
【中图分类号】 R284． 1 【文献标识码】 A doi:10. 3969 / j. issn. 1674-1749. 2015. 11. 010
The variety identification of QUINA in Brazil based on a combined analysis of DNA barcoding-ori-
gin-morphology ZANG Yi-mei，GU Xuan，YU Chun-xia，et al． School of Chinese Materia Medica，Bei-
jing University of Chinese Medicine． Beijing 100102，China
Corresponding author:ZHAO Bai-xiao，E-mail:baixiao100@ gmail． com
【Abstract】 Objective To study the variety identification of QUINA of Strychnos Linn． with the
combined analysis of DNA barcoding-origin-morphology and provide an evidence for the exploitation of this
kind of herbal in Brazil． Methods ITS sequences were amplified by PCR from genomic DNA and se-