全 文 ：第 36卷 第 12期 东　北　林　业　大　学　学　报 Vol.36 No.12
2008年 12月 JOURNALOFNORTHEASTFORESTRYUNIVERSITY Dec.2008
利用 SSR对杨属部分种及杂种的分析鉴定
　　　　　　　　　　　王　辉　　　　　杨敏生　朱建峰
(河北省林业科学研究院 ,石家庄 , 050061)　　　　　　(河北农业大学)　　　　
　　摘　要　利用 SSR标记对 17个杨树优良品种进行遗传多样性分析。从 25对杨树引物中筛选出 12对优良引物
并进行 PCR扩增 ,共扩增出 138个位点 ,其中多态性位点 133个 ,所占比率为 96.38%。基因型间的平均遗传距离为
0.243。聚类分析结果表明, 各杨树品种间存在一定的遗传差异 ,同时也较准确的进行了各优良品种的分子鉴别。
关键词　SSR;杨树;杂种;遗传关系
分类号　S512.1SSRAnalysisofSomeSpeciesandHybridsinPopulus/WangHui(HebeiAcademyofForestryScience, Shijiazhuang
050061, P.R.China);YangMinsheng, ZhuJianfeng(AgriculturalUniversityofHebei)//JournalofNortheastForestry
University.-2008, 36(12).-4 ～ 6
SSRwereusedtodetectthegeneticdiversityamong17 Populuscultivars.Twelvepairsofprimersoutof25 werescreenedoutandamplifiedusingPCR, and138 SSRmarkerswereobtainedfromthosecultivars, ofwhich133 werepoly-
morphiclociandthepercentageofpolymorphiclociwas96.38%.Theaveragegeneticdistancebetweenthegenotypesof
thecultivarswas0.243.Clusteranalysisshowsthattherearegeneticdiferencesbetweenthe17 Populuscultivars.The
molecularidentificationofsuperiorcultivarswasalsomadeaccurately.Keywords　SSR;Poplars;Hybrids;Geneticrelationships
　　我国杨树品种约有 60种 ,其主要分布于北方 、西南及华
中地区。杨树具有适应性强 、生长速度快和丰产等特性 , 已被
广泛地作为短期轮伐的造林树种。近年来 , 随着杨树育种工
作的蓬勃发展 , 大量杨树新品种不断涌现 , 据统计仅近几年出
现的杨树新品种就有 50多个 [ 1] 。现在杨树品种繁多 ,对杨树
品种进行准确的区分已成为当务之急 ,同时也给杨树的育种
工作提供理论基础。
林木品种鉴定是林木育种研究的重要内容。 20世纪 80
年代后 , 分子生物学的迅猛发展及实验技术的突破 , 使人们可
以在基因组水平上对生物进行指纹分析 , 形成了分子标记分
类技术。其中 , 简单序列重复(Simplesequencerepeats, 简称
SSR, 也称微卫星 DNA)标记技术无疑是一种近为理想的方
法 [ 2] 。 SSR具有高度的重复性 、相对简单的带型和共显性遗
传模式 , 是一种非常稳定可靠的 DNA指纹技术 , 已成功的应
用于品种鉴定 、物种的分类系统比较 ,并作为构建遗传图谱的
重要工具 [ 3] 。本实验利用 SSR标记进行杨树品种鉴定研究 ,
为将来的林木品种和类型鉴定以及育种工作提供科学的理论
依据。
1　材料与方法
17个杨树品种取自河北农业大学林学院杨树品种收集
圃(表 1);SSR引物 [ 6-7]由上海生物工程技术服务有限公司
合成 , 其名称和序列见表 2。
DNA的提取:基因组 DNA的提取采用改良 CTAB法 , 采
用琼脂糖凝胶电泳的方法对 DNA进行检测。
SSR-PCR扩增引物筛选:用 SSR引物对各供试材料基
因组 DNA进行 PCR扩增 , 筛选出有稳定扩增条带且多态性
第一作者简介:王辉 , 1981年 9月生 , 河北农业大学园林与旅游
学院 ,硕士研究生;河北省林业科学研究院。
通讯作者:杨敏生 ,河北农业大学林学院,教授。
收稿日期:2007年 12月 3日。
责任编辑:潘　华。
高的引物进行 PCR扩增实验 [ 8] 。
SSR-PCR反应体系:20μL反应体系, ddH2O12.8μL, 10×
PCRBufer2 μL, dNTP(20 mmol/μL)2 μL, 前段和末端引物
50mmol/L各 1μL。 TaqDNA聚合酶 0.2μL(1U),模板 DNA
1μL。
SSR-PCR反应程序:PCR扩增 94 ℃预变性 5min, 95 ℃
变性 50s, 52℃复性 50s, 72℃延伸 1min, 35个循环 ,最后 1
个循环结束 , 然后 72℃延伸 7min。
表 1　实验材料与来源
品种代码 品　　种 来　　源
1 银毛杨(Poplus.alba×P.tomentama) 白杨杂交种
2 银中杨(Poplusalba×P.berolinensis) 银白杨 ×中东杨
3 毛白杨(P.tomentosa) 白杨杂交种
4 中林 2001(P.deltoidescv.`Lux ×P.Deltoidesvar.missouriensis) 美洲黑杨杂种
5 加拿大杨(P.euramericana C`anadensis (Dode)Guiuier) 欧美杨杂交种
6 黑林 5号(P.psedosimoni×P.nigracv.)×(P.simoni×P.nigra)欧洲黑杨杂交种
7 中林 46(P.deltoidescv.`Lux ×P.Deltoidesvar.misouriensis) 美洲黑杨杂种
8 I-214(Poplus.euramericanacv.`I-214) 欧美杨杂交种
9 741杨(P.alba×(P.davidiana+P.simoni)×P.tomentosa) [银白杨 ×(山 +小)] ×毛白杨
10 欧美杨 107(P.euramericanacv.`Neva ) 欧美杨杂交种
11 欧美杨 108(P.euramericanacv.G uariento) 欧美杨杂交种
12 84K(Populusalba×P.glandulosa) 白杨杂交种
13 廊坊 1号(P.shanhaiguanensis×(P.pyramidalis+P.deltoids)) 山海关 ×钻天杨 +63
14 廊坊 2号(P.deltoids`lux ×P.shanhaiguanensis) 69 ×山海关
15 山海关杨(P.shanhaiguanensis) 黑杨派
16 冀秦 1号(P.deltoids) 欧洲黑杨杂交种
17 冀秦 2号(P.deltoids) 欧洲黑杨杂交种
　　注:其中 1、2、3、9、12为白杨派(Sect.Popul), 4、5、6、7、8、10、11、13、14、 15、
16、17为黑杨派(Sect.Aigeiro)[ 4-5]。
电泳分析:灌制 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶 , 上样 , 电泳
采用恒流 20mA, 时间 2 h, 剥胶染色。随后用双层玻璃纸夹
心法保存凝胶。
数据统计:每个条带按有或无记录 , 有扩增条带赋值 1,
无赋值 0。 SSR-PCR扩增产物在 100 ～ 400 bp间的条
带 [ 9-10] 。
表 2　SSR引物名称和序列
引物名称 引物序列(5′— 3′) 产物长度 重复序列
WPMS13 GATCCTGAACAATGTCGTACTTC 141 (GT)22
ACGATAACCTGCGAGAAATGT
WPMS14 CAGCCGCAGCCACTGAGAAATC 245 (CGT)28-3
GCCTGCTGAGAAGACTGCCTTGAC
WPMS15 CAACAAACCATCAATGAAGAAGAC 216 (CCT)14-3
AGAGGGTGTTGGGGGTGACTA
WPMS16 CTCGTACTATTTCCGATGATGACC 158 (GTC)8(ATCCTC)5
AGATTATTAGGTGGGCCAAGGACT
WPMS17 ACATCCGCCAATGCTTCGGTGTTT 146 (CAC)15-16
GTGACGGTGGTGGCGGATTTTCTT
ORPM016 GCAGAAACCACTGCTAGATGC 238 (CTT15)
GCTTTGAGGAGGTGTGAGGA
ORPM023 ATTCCATTTGGCAATCAAGG 197 (AT)…(AG)
CCCTGAAAGTCACGTCTTCG
ORPM026 GCTGCAGTCAAATTCCAAAA 213 (CA)8
CGAGCGTCTTCTTCATGGAT
ORPM-028 GGATCGACTTCCAACCCATA 204 (AT)7
AATTCCCAGATGAAGGCTCA
ORPM-030 ATGTCCACACCCAGATGACA 210 (GT)n
CCGGCTTCATTAAGAGTTGG
PNI297272 GAAGGTGGCATAGTGGTT 170 (GA)n
CCCTCGGAATGAGAATAA
PNI297275 TAAAGGCATGACCAGACA 257 (CA)n
CCAGCACTATTGGAAACA
　　SSR数据的统计分析:按 NEI等的方法计算品种间的相
似系数(SG)和遗传距离(DG)。SG=2Nij/(Ni+Nj),
DG=1-SG。
式中:Ni为 i品种出现的谱带数;Nj为 j品种出现的谱带数。
Nij为 i品种和 j品种共有的谱带数。利用 NTSYSpc21软件进
行各供试材料间的 UPGMN聚类分析。
2　结果与分析
2.1　SSR扩增结果
利用筛选出的 12对引物对 17个供试材料进行 PCR扩
增 , 扩增产物经电泳得到指纹图谱。结果表明不同基因型间
具有不同的谱带类型 , 说明不同供试材料在 DNA水平存在一
定遗传差异。
图 1　引物 WPMS14电泳图谱
注:图中 1 ～ 17同表 1对应品种一致。
图 1为引物 WPMS14的 SSR谱带图。引物 WPMS14的 17
个 SSR谱带图共有 12个多态性位点 ,说明这对引物能很好的区
分 17个供试材料,同时表明所选材料也存在明显的遗传差异。
2.2　DNA的多态性分析
通过对 12 张图谱的统计分析 , 共检测到了基因组
DNA138个位点 ,其中多态性位点有 133个 , 占扩增总位点数
的 96.38%(见表 3),每对引物扩增的带数一般在 6 ～ 17条之
间 ,平均为 11.5条带。
表 3　SSR扩增位点及多态性
引物 扩增带数量 多态性带数量 多态性位点百分率 /%
WPMS13 　6 　 6 100
WPMS14 12 12 100
WPMS15 11 10 90.9
WPMS16 14 14 100
WPMS17 17 16 94.12
ORPM-016 12 12 100
ORPM-020 14 14 100
ORPM-026 6 6 100
ORPM-028 12 10 83.33
PNI297272 9 8 88.88
PNI297275 10 10 100
ORPM-030F R 15 15 100
总计 138 133 96.38
　　由结果可以看出 , 扩增带数最多的为 WPMS17引物 , 平
均 3.1条扩增带 ,最少的为 WPMS13号引物 , 平均 1.25条扩
增带。在扩增出的 138个位点的条带中 ,其中有 31条为各基
因型所共有的 , 这为 17个材料间的同源性提供了依据。 此
外 ,不同引物扩增的带数不同 ,而且不同基因型的扩增带数也
不一样 , 同时扩增出了多个品种的特异性带共 26条(见表
4)。这充分表明了杨树基因组 DNA的多态性 , 说明了不同供
试材料之间的遗传差异。
表 4　SSR引物特异性条带位点
品种 引　　物WPMS13 WPMS14 WPMS15 WPMS16 WPMS17 PNI297275 ORPM016 ORPM020 ORPM026 ORPM028 PNI297272 ORPM030
1 380bp 170bp
2 260bp 240bp 280bp、250bp
3 360bp 200bp 200bp
4 285bp
5 260bp、305bp 185bp 205bp、 235bp 310bp、320bp 230bp
6 260bp 350bp
7 130bp、295bp
8
9 400bp 270bp
5第 12期　　　　　　　　　　　　王　辉等:利用 SSR对杨属部分种及杂种的分析鉴定　　　　　　　　　　
续表 4
品种 引　　物WPMS13 WPMS14 WPMS15 WPMS16 WPMS17 PNI297275 ORPM016 ORPM020 ORPM026 ORPM028 PNI297272 ORPM030
10
11 150bp、160bp 290bp
12 310bp 180bp
13 380bp
14 350bp
15
16
17 390bp
　　各材料基因型间的遗传距离可知 ,杨树基因型间的平均
遗传距离(DG)为 0.243,基因型之间DG值范围为 0.029 ～ 0.387,
说明各杨树品种间存在着一定的差异。
2.3　聚类分析
为了确定各供试材料之间的遗传关系 , 通过 SSR遗传距
离矩阵按 UPGMA法进行了聚类分析 , 构建了供试材料基因
型之间的亲缘关系 , 见图 2。
图 2　17个杨树品种聚类分析
聚类分析中 , 把材料基因型间的遗传距离作为材料为一
类的依据。由聚类图可以看出 ,取 DG=0.24时可将 17个供
试材料划分为 3大类群。类群 I:银毛杨 、银中杨 、毛白杨 、741
杨 、84K,均为白杨派或白杨派内杂交种。其中银毛杨和银中
杨 、741杨和 84K遗传距离较近与毛白杨稍远 , 与其遗传和形
态特征相吻合;类群Ⅱ:黑杨派杨树品种 , 其中欧美杨 107和
欧美养 138、廊坊杨 1和廊坊杨 2、中林 2001和中林 46, 均是
来自相同或部分相同亲本的杂交种 , 遗传距离在 0.03 ～ 0.34
之间 , 与遗传关系相符;类群Ⅲ :冀秦 1号 、冀秦 2号为欧美杨
杂交种。类群Ⅰ为白杨派品种 , 类群Ⅱ 、Ⅲ为黑杨派品种。在
生理性状 、外部形态表现基本一致 ,说明了遗传本质差异对外
部形态特征的对应反映。
3　讨论
本研究利用 12对 SSR引物对 17个杨树品种进行遗传变
异分析 , 共得到 138个位点 , 其中 133个具有多态性 , 说明杨
树各供试材料间存在较大的遗传差异。 12对引物得到的位
点最少为 6个 , 最多为 17个 , 平均每对引物得到 11.5个位
点 ,扩增出的在 1 ～ 17个之间 , 杨树不同品种的聚类分析树状
图结果与形态学观察基本一致 , 这说明了遗传本质差异对外
部形态特征的对应反映。结果表明:SSR标记分析具有稳定
可靠的特点 ,可以直接应用特征性标记去进行品种的区别与
鉴定研究。本研究采用 SSR-PCR的引物 , 不仅在白杨和黑
杨中可扩增出清晰 、多态的扩增产物 ,而且可以推断在杨树其
他派的品种中也同样适用。
由于 SSR在基因组中广泛分布 ,因此 SSR指纹图能代表
一定的基因组特征。 SSR标记作为一种有效的基因型鉴定技
术 ,能够产生足够多的等位多态性 ,因而已成为育种系谱分析
的有效手段。 Donald等对 52个玉米杂交种和 586个自交系
进行 SSR分析 , 并对杂交种与自交系的亲子关系进行鉴
定 [ 11] 。现在杨树品种繁多 , 经常出现品种混杂的现象 , 因品
种区分不清造成的经济纠纷时有发生 , 给国家和个人带来了
很多不必要的经济损失。因此 , 利用本研究中的引物对混乱
的杨树品种进行 SSR指纹图区分 , 此方法简单 、快捷 、准确 ,
可以避免很多不必要的经济损失。
参　考　文　献
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