全 文 ：江苏农业学报(JiangsuJ.ofAgr.Sci.), 2008, 24(6):875～ 877
一种改良的提取草莓属叶片总 RNA的方法
蔡斌华 1 , 　张计育 1 , 　高志红1 , 　渠慎春 1 , 　佟兆国1 , 　靡　林 2 , 　乔玉山 1 , 　章　镇1
(1.南京农业大学园艺学院 ,江苏 南京 210095;2.江苏省丘陵地区镇江农业科学研究所 ,江苏 句容 212400)
收稿日期:2008-08-18
基金项目:江苏省农业资源开发局项目(2008KJ-D47);江苏省科技
攻关项目(BE 2007351);江苏省科技支撑计划项目
(BE2008373)
作者简介:蔡斌华(1964-),女,江苏江阴人 , 大专 ,实验师 ,主要研究
果树分子生物学与遗传育种。 (Tel)025-84395724;(E-
mail)cbh4014@126.com
通讯作者:章　镇 , (Tel)025-84395724;(E-mail)zhangzhen nj@hot-
mail.com
　　摘要:　探索一种新的适合草莓属(Fragariaspp.)组培苗 、大田苗叶片总 RNA的快速高效提取方法。试验以
草莓叶片为材料 , 用改进的 CTAB法对其 RNA进行提取 , 并对提取的 RNA进行了电泳检测 、含量测定和 RT-PCR
检测。结果表明:用该 RNA提取方法提取的 RNA具有 28SrRNA、18SrRNA和 5.8SrRNA3条清晰的条带 ,且无
降解。 OD260 /OD280在 1.83至 2.14之间 ,具有较高的纯度 , 且含量较高。用该 RNA提取方法提取的 RNA逆转录成
cDNA,经 PCR扩增出现清晰的条带 , 说明该 RNA提取方法提取的 RNA可以满足进一步分子生物学试验的要求。
关键词:　草莓属;总 RNA;提取方法
中图分类号:　Q503　　　文献标识码:　A　　　文章编号:　1000-4440(2008)06-0875-03
AnImprovedMethodforIsolationofTotalRNAfromtheLeavesofFragaria
spp.
CAIBin-hua1 , 　 ZHANGJi-yu1 , 　GAOZhi-hong1 , 　QUShen-chun1 , 　 TONGZhao-guo1 , 　MILin2 , 　
QIAOYu-shan1 , 　ZHANGZhen1
(1.ColegeofHorticulture, NanjingAgriculturalUniversity, Nanjing210095, China;2.ZhenjiangInstituteofAgriculturalSciencesoftheNing-zhenHily
District, Jurong212400, China)
　　Abstract:　 AfastandeficientmethodforisolationoftotalRNAfromtheleavesofstrawberry(Fragariaspp.)in
vitroandfieldwasdevelopedintheexperiment.TheRNAsamplesoftheleavesofstrawberrywereisolatedbyimproved
CTABmethod, andthepurityandquantityofeachRNAobtainedwasevaluatedbyagarosegelelectrophoresis, UVscan-
ningandRT-PCRanalysis.ThetotalRNAofstrawberryleavesextractedbythismethodshowedclearbandsof28SrRNA、
18 SrRNAand5.8 SrRNA, andthevaluesofOD260 /OD280 werebetween1.83 and2.14.ThecDNAreverselytranscrip-
tedfromtheextractedRNAexhibitedclearbandbyRT-PCR, whichmeantthatthequalityandpurityoftheRNAcould
meetthedemandsofmolecularbiologyexperiment.
Keywords:　Fragariaspp.;totalRNA;extractionmethod
　　能够提取高质量的 RNA是进行 cDNA文库构
建 、基因克隆 、基因表达分析 、转基因植株鉴定 、植物
病毒检测等分子生物学研究的基础。目前用于植物
细胞总 RNA提取的方法很多 ,主要有苯酚法 [ 1] 、氯
化锂沉淀法 [ 1] 、异硫氰酸胍法 [ 2] 、SDS/酚抽提法 [ 3] 、
或应用商品化的 Trizol等各类试剂盒。由于植物体
内所含的物质成分差异较大 , RNA的提取方法差异
也很大[ 4] 。草莓是一种蔷薇科草莓属 (Fragaria
spp.)多年生草本植物 ,叶片中含有较多的糖类 、蛋
白 、色素和酚类等化合物 ,这些物质的存在严重地影
响总 RNA的提取 ,如果去除不彻底 ,将也会影响反
转录以及后期的试验。关于草莓 RNA的提取方法 ,
国内外学者做了一些研究 , Thompson等利用 QIA-
GEN公司生产的植物 RNA提取试剂盒 (Plant
RNeasyKit)能够快速地(约 1 h)从草莓叶片中提
取出较高质量的总 RNA[ 5] , 但是这种试剂盒很贵 ,
提取成本很高 ,提取每个样品大约需要 70元 。杨洪
一等 [ 6]采用改进 CTAB法也能够从草莓叶片中提取
875
总 RNA, 但是操作时间较长 (约 10 h), 增加了
RNA降解的机率 ,而且费时费力 , DNA污染较严
重 [ 7] 。本研究拟在总结前人研究成果的基础上 ,建
立一种快速 、高效的适合草莓属植物叶片总 RNA的
提取方法。
1　材料和方法
1.1　试验材料
试验材料为南京农业大学果树生物技术试验室
保存的花药培养的组培苗丰香和雪蜜;盆栽苗丰香 、
雪蜜 、明宝和指示植物 UC5,共 4个品种 。
1.2　试剂的配置
RNA提取缓冲溶液 (CTAB):1.4 mol/LNaCl、
0.1 mol/LTris-HCl(pH=8.0)、20 mmol/LEDTA
(pH=8.0), 2% CTAB、2%β-巯基乙醇 , 5.0 mol/L
KAc(pH=4.8),水饱和酚(pH=4.5),氯仿 ,异戊
醇 , DEPC处理 ddH20。除 Tris-HCl用 DEPC处理过
的 ddH2O配制外 ,其余试剂均用 ddH2O配制 , DEPC
处理后进行高压灭菌 。
1.3　总 RNA的提取
方法 1:称取新展开的草莓叶片或组培苗叶片
约 0.1 g,于液氮中迅速研磨成粉末 ,加入含有 700
μlCTAB裂解液的 2 ml离心管中 , 65 ℃水浴 15 ～
30 min,加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1),旋涡混
匀;12 000 r/min离心 10 min,取上清 ,加入 1/2体
积的水饱和酚(pH=4.5),混匀 , 冰上放置 2 min,
再加入 1 /2体积氯仿∶异戊醇(24∶1),旋涡混匀 4 ～
5 min;12 000 r/min离心 10 min,取上清 ,加入 1 /3
体积的 KAc(5 mol/L, pH=4.8),混匀 ,在冰上静置
5 min后 , 再加入等体积的氯仿 ∶异戊醇 (24∶1);
12 000 r/min离心 10 min,取上清 ,加入 1 /4体积的
LiCl(10 mol/L), -20 ℃静置 1 h;12 000 r/min离
心 10 min,弃上清 ,用 70%的乙醇洗涤沉淀 2次 ,室
温干燥 ,溶于 50 μlDEPC处理的 ddH2O中 , -70 ℃
保存备用。方法 2:提取方法参考杨洪一等 [ 6]的改
进 CTAB法 。
1.4　总 RNA的完整性及纯度检测
取 2 μl的总 RNA,用 1%的琼脂糖凝胶电泳进
行检测 ,电压为 150 V左右 ,当溴酚兰到达胶面 1 /3
时取出 ,于紫外成像系统上拍照分析。 RNA在 Bio-
photometer上检测浓度 ,体系为 1 μlRNA样加入 49
μlDEPC处理 ddH2 0 , RNA浓度 、 OD280 /OD260和
OD260 /OD230直接从仪器上读取。
1.5　RT-PCR检测
RT反应体积为 20 μl, 其中包括 1 μl的总
RNA, 0.5 μl的 Oligo(DT)18 , 0.5 μl的 Random
Primers,其它反应成分和操作步骤参考 M-MLV反
转录说明书进行。
参考 Thompson等 [ 5]的研究设计引物 ,目的基因
为线粒体 NADH脱氢酶基因 ND2亚基(ndhB)。上
游引物为 5′-GGACTCCTGACGTATACGAAGGATC-3′,
下游引物为 5′-AAACAACGCTTGTAAGGAGTCC-3′。
引物由上海英俊生物技术有限公司合成 。取 1 μl
cDNA进行 PCR,反应体系与反应程序参考张志宏
等[ 6]的方法。扩增产物于 1.0%的琼脂糖凝胶电泳
检测。DNA片段回收按照琼脂糖凝胶回收试剂盒说
明书进行 (大连宝生物工程公司), 回收片段与
PMD19-T载体(TaKaRa)连接转化后测序 ,测序由上
海博亚生物技术有限公司完成。登录 NCBI, 用
BLAST分析软件 ,对已经登录 GENBANK的 ndhB序
列与本试验克隆到的序列进行同源性比较。
2　结 果
2.1　RNA的浓度和质量分析
分别取组培苗和大田苗不同品种的草莓叶片
100 mg, 提取总 RNA。 RNA浓度为 310 ～ 1 120
μg/ml, 且所有样品的 OD260 /OD280在 1.83至 2.14
之间 , OD260 /OD230值均大于 2.0。说明提取的 RNA
较纯且含量较高 , DNA含量较少 ,多糖 、蛋白 、酚类
等杂质污染也较少 。从图 1可以看出 , 28.0SrRNA、
18.0SrRNA和 5.8SrRNA3条带整齐 、清晰 ,说明
总 RNA在提取过程中没有降解 。而方法 2(图 2)提
取的 RNA没有降解 ,但 DNA含量较高 ,而且操作时
间较长(10 h)。表明方法 1提取草莓属大田苗和组
培苗叶片总 RNA,不仅能得到高质量的 RNA,而且
方法简便 、效率较高(约 4 h)。
2.2　RT-PCR检测
RT-PCR是分子生物学研究的常用技术之一 ,
RNA的质量会严重影响后续试验的进行 。为了检
测 RNA的质量 ,本试验根据线粒体 NADH脱氢酶
基因 ND2亚基(ndhB)设计引物 ,引物跨越内含子
区域 ,只对剪接后的 mRNA进行特异扩增 ,可以较
好地检测 RNA的质量 。 PCR电泳结果如图 3 ,以
cDNA为模板扩增得到大约 570 bp的片段 ,并且条
876 江 苏 农 业 学 报 　2008年 第 24 卷 第 6期
1 ～ 4分别为大田 UC5、明宝 、雪蜜和丰香的叶片。 5和 6分别为
雪蜜和丰香组培苗叶片。
1 -4:TheleavesoffieldplantsofUC5, Mingbao, Xuemi, and
Fengxiang, inturn.Lanes5 and6:TheleavesofXuemiandFengx-
ianginvitro, respectively.
图 1　方法 1提取草莓不同品种的大田苗和组培苗的总 RNA电
泳结果
Fig.1　TheagarosegelelectrophoresisoftotalRNAextracted
fromtheleavesofstrawberryplantsinthefieldandin
vitrobymethod1
1 ～ 4分别为大田 UC5、明宝 、雪蜜和丰香的叶片。 5和 6分别为
雪蜜和丰香组培苗叶片。
1 -4:TheleavesoffieldplantsofUC5, Mingbao, Xuemi, and
Fengxiang, inturn.Lanes5 and6:TheleavesofXuemiandFengx-
ianginvitro, respectively.
图 2　方法 2提取草莓叶片总 RNA的电泳结果
Fig.2　TheagarosegelelectrophoresisoftotalRNAextracted
fromtheleavesofstrawberrybymethod2
带整齐 、清晰。登录 NCBI,用 BLAST分析软件 ,在
BLAST数据库中对测序结果进行同源性分析 ,本试
验扩增得到的 ndhB与已经登录 GENBANK的 ndh
B序列的同源性达到 100%。说明反转录合成的
cDNA质量好 ,也进一步说明了用方法 1提取草莓
属叶片 RNA具有较高的质量 ,能满足分子生物学试
验的要求。
3　讨 论
草莓叶片 ,尤其是大田苗叶片中富含多糖 、色素
类物质 ,并且 DNA含量较高。我们用杨洪一等[ 6]改
进的 CTAB法提取草莓大田苗叶片 ,虽然提取的
RNA条带清晰 、整齐 ,可是难以去除 DNA的污染 ,
并且费时(约 10 h)。方法 1我们使用 β -巯基乙醇
来防止酚类化合物的氧化变褐。加入 1.4 mmol/L
NaCl,用于去除 DNA对 RNA污染的基础上 ,加入酸
1:对照 1(无反转录对照);2:对照 2(无模板对照);3:ndhB基
因;4:DNAmarker。
1:Control1(WithoutRT);2:Control2(Withouttemplate);3:ndhB
gene;4:DNAmarker.
图 3　ndhB基因的 RT-PCR电泳结果
Fig.3　TheRT-PCRofndhBgene
酚使 DNA变性 ,结合较长时间的涡旋震荡 ,不仅使
DNA断裂成小片段 ,蛋白质充分变性 ,而且可以使
用氯仿∶异戊醇(24∶1)对变性的蛋白质等一些次生
物质的萃取更加彻底。同时使用酸酚可以去除大量
色素 。在多糖的去除上 , 采用 1 /3体积的 KAc(5
mol/L),不仅可以去除多糖 ,而且可以彻底去除色
素类物质 。最后使用 1/4体积的 LiCl(10 mol/L)选
择性地沉淀 RNA,达到充分去除 DNA污染的目的。
利用此方法提取草莓属叶片 RNA不仅可以从组培
苗 、大田苗提取出高质量的 RNA,而且快速 、高效 、
成本低 ,更重要的是提取时间短 ,整个过程仅需 4 h,
所提取的 RNA符合分子生物学实验的要求。
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877蔡斌华等:一种改良的提取草莓属叶片总 RNA的方法