全 文 ：山西农业科学2016，44（9）：1237-1242，1249 Journal of Shanxi Agricultural Sciences
基于生物信息学方法的荞麦属microRNAs及其靶基因预测
高 帆 1，宋 韡 2，谢树莲 1
（1.山西大学生命科学学院，山西太原030006；2.山西体育职业学院，山西太原030006）
摘 要：MicroRNA是一类具有转录后基因调控功能的非编码小分子RNA。以传统的试验方法发现和鉴定新的
miRNA是一项繁琐的工作。以生物信息学方法从数据库中筛选miRNAs及其靶基因能够极大地提高效率。植物中
已报道了大量的miRNAs，但荞麦属的尚未见报道。通过荞麦ESTs和GSSs的严格筛选，共预测到13个荞麦属
miRNAs（分属11个miRNA家族）。预测的miRNAs在不同的植物中表现出保守性，miRNA家族成员表现出多样
性。共预测到17个潜在的靶基因，这些靶基因的功能包括代谢、生长发育、胁迫响应、信号转导等，表明miRNAs
在植物生命活动中具有重要作用。miRNA家族系统进化分析表明，金荞麦的miRNAs进化与甜荞麦关系密切。
以生物信息学方法从已知的数据库中预测并挖掘荞麦属新的miRNAs及其靶基因是可行的。
关键词：MicroRNA（miRNA）；生物信息学；荞麦属；靶基因
中图分类号：Q752 文献标识码：A 文章编号：1002-2481（2016）09-1237-07
Prediction of microRNAs and Their Target Genes Using
Bioinformatics Methods in Genus Fagopyrum
GAOFan1，SONGWei2，XIEShulian1
（1.CollegeofLifeSciences，ShanxiUniversity，Taiyuan030006，China；2.ShanxiSportsVocationalSchool，Taiyuan030006，China）
Abstract：MicroRNAs（miRNAs）aresmallmolecularnon-codingRNAswhich playimportantrolesin post-transcriptionalgene
regulation.DiscoveringandidentifyingnewmiRNAsistedioususingtraditionalexperimentalmethods.SearchingformiRNAsfromRNA
databases with bioinformatics methods can improve the efficiency of seeking new miRNAs and their targeted genes greatly. A large
numberofmiRNAsarereportedinplants,butresearchonthegenusFagopyrumha retu nednoresultssofar.Afterpredictionsearching
expressed sequence tags （ESTs）and genome survey sequences （GSSs）from buckwheat with miRNAs reported from all plants, we
predicted13miRNAsin11miRNAfamiliesusingstrictscreening.ThepredictedmiRNAssequencesembodiedconservativeindifferent
plants, but the number of the miRNAs distribution embodied diverse. Seventeen potential targets were predicted by our analysis of the
predictedmiRNAswithmRNAsandESTsinplants.Thetargetedproteinswerenecessaryinmetabolism,growthanddevelopment,stress
response, signal transduction and so on, which suggested the miRNAs played an essential role in life processes. Phylogenetic analysis
suggestedthatmiRNAsevolutionofF. cymosummightberelatedwithF. esculentums.DiscoveredandidentifiednewmiRNAsandtheir
targetedgenesingenusFagopyrum fromtheknowndatabaseswithbioinformaticsmethodsshouldbefeasible.
Key words：MicroRNA（miRNA）;bioinformatics;Fagopyrum;ta ge gene
收稿日期：2016-04-05
基金项目：山西省煤基重点科技攻关项目（FT201402-15）
作者简介：高 帆（1985-），男，山西长治人，实验师，博士，主要从事生物信息研究工作。谢树莲为通信作者。
doi:10.3969/j.issn.1002-2481.2016.09.01
荞麦属（Fagopyrum）是蓼科（Polygonaceae）植物
中被人们熟知的类群，其中，有些种是常见杂粮作
物，如甜荞麦（F. esculentum）和苦荞麦（F. tatar－
icum）在许多国家都有栽培[1]；有的种具有药用价
值[2]，如苦荞麦、金荞麦（F. cymosum）和其他一些野
生种的提取物具有降低血糖和血脂[3-5]、抗菌、抗氧
化等功效[6-7]。发展和提高作物产量、有效改善作物
品质、挖掘并探究某些作物特殊的药用成分及其作
用机制是当前作物研究的热点[8-9]。预测并鉴定荞麦
microRNAs（miRNAs）及其靶基因，探究靶基因转录
后表达调控机制将有助于进一步了解荞麦生长发
育、营养代谢、药用机制以及遗传进化的详细进程。
miRNA是一类具有调控功能的非编码小分子
RNA。Lee等[10]在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis el－
egans）中首次发现了这类特殊的RNA分子。大多数
miRNAs长度约为19～25nt[11]。RNA聚合酶II和III
在miRNA基因转录中起着重要作用[12]。研究显示，
miRNAs在植物生长发育、生物代谢、胁迫响应、信
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山西农业科学2016年第44卷第9期
号转导及其他生命活动中均发挥着重要的作用[13]。
自2002年以来，植物miRNA的研究有了快速地发
展[14]。截止2016年8月，miRBase数据库已正式公
布了33种植物共约8450条miRNAs[15]。尽管如此，
作为一种重要的小杂粮作物，荞麦的miRNAs还未
有任何报道。预测荞麦属miRNAs将扩展植物miR-
NAs信息，并有助于深入研究该作物生命活动过程
中的某些基因的表达调控机制。这将为定向改良荞
麦种质，详细了解其药用机理，高效、精准、充分地
利用现有荞麦资源，提高我国荞麦品质奠定基础。
目前，获得miRNAs的主要方法有直接克隆[16]、
正向遗传[17]、深度测序[18-19]和生物信息[20]。由于材料获
取和试验成本等方面的困难，生物信息学方法以其
简单、快速、高效而倍受研究者的青睐[21-22]。与动物相
比，一些植物的 miRNA 序列相对保守[23]，因此，通
过生物信息学方法预测荞麦属miRNAs是可行的[24]。
本研究利用荞麦的ESTs和GSSs数据库，以已
知植物miRNAs为探针，采用多种生物信息手段筛
选候选序列并预测其前体结构，最终确定了荞麦的
miRNAs，此外还预测了miRANs的靶基因及其功
能，最后分析了荞麦miRNAs在植物中的保守性、
多样性及其不同家族间的系统进化关系。
1 材料和方法
1.1序列获得
从 miRBase21.0 数据库中（http://www.mirbase.
org/）下载所有植物的miRNAs及其前体序列，去除
冗余序列，保留的序列在同一miRNAs家族中不重
复并按照不同种类分组。由于荞麦的全基因组测序
尚未完成，本研究以ESTs（273条）和GSSs（85条）
为模板序列（从 Genbank 中下载获得，http://www.
ncbi.nlm.nih.gov），以整理的植物miRNAs数据库为
搜索序列，通过多重序列比对获取同源性较高的序
列作为荞麦候选miRNA序列。
1.2潜在 miRNA序列的预测
通过考察候选 miRNA 序列，并将其与 Rfam
（http://rfam.sanger.ac.uk）及 Genbank 数据库比对，
从中可获得潜在的荞麦miRNAs[25]。根据以下原则
筛选miRNA序列：（1）不一致的碱基不超过3个；
（2）百分比不超过（L-4＋m）/L，其中，L是长度（碱
基数），m 是不一致的碱基数；（3）去除 tRNA 和
rRNA及蛋白编码序列[26-27]；（4）去除重复序列。
1.3前体 miRNA次级结构的预测
为了进一步确认潜在的 miRNA 序列为荞麦
miRNAs，同时考察其前体是否能形成典型的颈环
状二级结构，是否含有星状miRNA（miRNA*），本研
究对荞麦miRNA的前体进行了预测。根据有关文
献报道，植物中前体 miRNA 长度通常约为
144.57± 6.91 nt[28]，本研究以 200 nt miRNAs 上游
和下游序列包括其本身作为源序列，分析预测前体
序列的二级结构[29]，长度限于60～250nt。参数设置
为：（1）选择概率值为0.5；（2）扫描窗口值为5个碱
基对、延伸窗口值为3个碱基对；（3）所需的前体
miRNA构建次级结构，其中，miRNA和miRNA*必
需位于“发夹”结构的一个臂上；（4）在臂上没有更
大或更多的隆起结构；（5）最小折叠自由能不超过
-75.3kJ/mol；（6）（A＋U）占比在30%～70%；（7）不
一致的碱基数目不超过6，在miRNA和其互补链中
无环状结构或间断出现。
1.4靶基因的预测
用 WMD3 在线分析软件（http://wmd3.weigel-
world.org/）结合BLASTX及Pfam软件（http://pfam.
sanger.ac.uk/）预测并分析 miRNAs靶基因及其功
能[25-27]，预测原则为：（1）不一致的碱基数不超过
5 个；（2）在位点2～12之间不一致的碱基数不超
过1个，其中在位点10～11之间不允许有碱基错
配；（3）在位点 13～21 之间错配的碱基数不超过
4个，且不能有2个连续的错配碱基；（4）选择的结
构具有最低的MFE值和最高的最小折叠自由能指
数（MFEI）[30]。以WMD3中主要植物的mRNAs作为
模板序列，包括模式植物和主要作物，如拟南芥、水
稻和玉米。由于 WMD3 和 Pfam 中尚未公布荞麦
mRNAs信息，本研究以ESTs和Genbank中的mR-
NAs作为比对数据。
1.5miRNA的保守性、 多样性及其家族成员间的
系统进化分析
通过BLASTn比对分析不同植物中miRNAs的
保守性[31-32]，进而分析不同种中miRNA家族成员的
数目及其保守性和多样性。在此基础上，利用
MEGA3.1工具，以邻接法构建不同荞麦miRNAs家
族成员间的系统进化树[33]。
2 结果与分析
2.1miRNAs 及其前体序列预测与特征分析
本研究从数据库中下载获得了 33 种植物的
miRNAs，通过序列比对在荞麦中预测到13个新的
miRNAs，筛选率仅为1.1%（表1）。
从表2可以看出，这13个预测的miRNAs的
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高 帆等：基于生物信息学方法的荞麦属microRNAs及其靶基因预测
表 1 潜在和特有的小分子 RNAs 汇总
筛选条件
重复去除
序列比对
miRNA序列预测
前体miRNAs预测
靶标预测
潜在
序列
1183
872
102
35
26
特有
序列
1150
350
41
13
17
超量筛
选率/%
97.21
29.59
3.47
1.10
1.44
筛选
率/%
97.21
40.14
40.20
57.14
65.38
长度为17～23nt，符合植物miRNA长度的标准[34]。
有文献报道，miRNA 中（A＋U）比例高于（G＋C），
但也不绝对[35]。本研究结果中（A＋U）在35.30%～
73.68%，基本与文献报道一致。
从图1可以看出，本研究获得的所有前体具有
典型的“发夹”结构，miRNAs总是位于前体结构的
一个臂上，以5′端居多。前体miRNAs长度为66～
153nt，平均106.77nt，大于动物（70～80nt）的长度
[30]。研究表明，miRNAs的MFEI应不小于0.85，本研
究结果在1.22～3.84，因此，预测结果是基本可信
的。13个预测的miRNAs隶属11个miRNA家族，
fes-miR162和fcy-miR1298家族各有2个，其余家
族各有1个。
表 2 预测的荞麦中 miRNAs 及特征
长度
（碱基）
18
18
20
19
17
20
21
23
21
17
18
17
17
miRNAs
fes-miR473
fes-miR162a
fes-miR162b
fes-miR545
fta-miR5038
fta-miR542
fta-miR632
fcy-miR2916
fcy-miR1298a
fcy-miR1298b
fes-miR378
fta-miR671
fta-miR3979
类型
EST
EST
EST
EST
EST
EST
EST
EST
EST
EST
EST
EST
EST
序列
CUCCUCCAAGGCUUCCAA
UCUGCAUGCAGAGGUUUG
UCUGCAUGCAGAGGUUUGGA
GCAAUGAAAUGUAGUUUUU
AAACUUGGCCUCUGUCC
AGGAACAGAUUGAUAUCUGU
AUAGCUGUUUCCUGUGUGAAA
AUCUGAUCGUCUUCGAGCCCCCA
UUCAAUCGGCUGUCCAGAUGU
UUCAAUCGGCUGTCCAG
GUUUGACUCCAAGUCCGA
ACCCUCGAUGGGCUGGA
GCUUCUCGCCUUCCCUG
前体
长度
107
69
138
107
87
133
112
153
112
93
144
66
67
基因组
FS999682.1
FS999670.1
FS999670.1
FS999650.1
GO898748.1
GO898764.1
GO496294.1
GO496286.1
GO496320.1
GO496320.1
GO496311.1
JK729375.1
JK729375.1
位点
3+
5+
5+
3+
5+
5+
5+
5+
3+
5+
5+
+
+
最小自由
能指数
2.15
2.63
1.53
3.84
2.82
2.24
2.13
1.22
1.99
2.15
1.85
2.59
2.57
（A+U）占
比/%
44.44
50.00
50.00
73.68
47.06
65.00
61.90
43.48
52.38
47.06
50.00
35.30
35.30
最小自由能/
（kJ/mol）
-128.11
-105.3
-105.07
-108.01
-104.53
-104.7
-105.03
-105.55
-106.54
-106.13
-104.86
-110.99
-111.79
注：带有下划线字母表示不一致的碱基；fes，fta和fcy分别表示荞麦、苦荞麦和金荞麦。
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2.2miRNAs的保守性和多样性预测
本研究采用序列比对的方法分析了荞麦miR-
NAs的保守性和多样性。结果表明，大多数miRNAs
家族是保守的，但miR162家族例外（图2）。miR473
和miR1298家族在5′端的前4个碱基完全相同，与
有关文献报道一致[36]。其他miRNAs也显示出与水
稻、拟南芥、玉米、葡萄、毛果杨和小立碗藓的同源
性。不同植物miRNAs的保守性也在一定程度上反
映出其进化的保守性。
表 3 预测的 miRNAs 家族靶标信息
可能的功能
适配蛋白
代谢
生长发育
未知
胁迫响应
代谢
信号转导
转录因子
代谢
架构
代谢
未知
信号转导
代谢
代谢
代谢
代谢
miRNAs家族
fes-miR473
fes-miR162
fes-miR545
fta-miR5038
fta-miR542
fcy-miR1298
fes-miR378
fta-miR671
fta-miR632
靶标基因
AT5G61210.1
AT2G22980.1
AT2G17200.1
NP1099774
BI800203
DY539240
NP453683
TC285536
TC423943
TC280739
Os04g01820.1
TC543044
TC546792
CB677810
NP226785
BM419056
BM038209
靶标蛋白
SNP33
丝氨酸羧肽酶
泛素家族蛋白
假定蛋白
NBS-LRR状蛋白
pfkB型糖激酶蛋白
推定转运蛋白
MYB转录因子
可能的硫胺素生物合成蛋白
谷氨酸盐受体前体
转运蛋白
预测蛋白
线粒体基底载体蛋白
鞘氨醇激酶
非手性马兜铃烯合成蛋白
过氧化氢酶
单链脱氧核糖核酸结合蛋白
从图2还可以看出，fcy-miR1298a与现代人的
hsa-miR-1298以及小鼠的mmu-miR-1298高度相
似，仅在第15个位点有1个碱基的差异。在三者中
发现的miR1298具有如此高的相似率是值得注意
的，通常不同物种间miRNAs的保守现象只见于同
界的不同种类中[37-38]，并且其调控的靶基因产物往
往相似。然而，动物和植物间miRNAs的保守性通
常不高，且其基因产物往往不同。由于这3个物种
的miR1298靶基因均是未知蛋白，并且三者的前体
miRNA序列和结构完全不同。因此，不能单纯地从
miR1298成熟体的保守性来推测其在人类和小鼠
中也完全是保守的。
本研究发现荞麦中预测的13个miRNAs也存
在于其他植物中（表 3），miR378，miR542，miR671
和miR1298家族至少存在于10种植物中。同时，本
研究也发现一些罕见的 miRNAs，如 miR3979，
miR5038 和 miR2916，仅见于 1 种植物中，基本属
于物种特异 miRNAs（novel miRNAs），这也反映了
植物miRNAs的多样性。
2.3靶基因及其功能预测
基于植物 miRNAs与其靶位点间严格碱基互
补的原则，本研究预测了荞麦miRNAs潜在的靶基
因及靶位点[20]，并通过蛋白质序列比对预测了靶基
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因的功能[27]。本研究通过ESTs从荞麦的9个miRNA
家族中获得了 17 个靶基因。在 fcy-miR2916 和
fta-miR3979 中未预测到任何靶位点及靶基因。
fes-miR473预测到的靶基因最多（5个靶基因）。预
测靶基因的功能包括代谢、生长发育、胁迫响应、信
号转导等方面。
9个靶基因与植物代谢过程相关，如NP226785
编码非手性马兜铃烯合成酶[39]，DY539240编码pfkB
型糖激酶蛋白[40]，AT2G22980.1编码丝氨酸羧肽酶[41]。
这几个酶蛋白在植物代谢中均起着十分重要的调
控作用。另外，本研究也预测了1个由AT2G17200.1
编码的泛素家族蛋白，与生物体的蛋白质降解、细
胞分裂、发育、免疫和其他一些复杂的生理过程紧
密相关[42]。由BM038209编码的单链脱氧核糖核酸
结合蛋白是 DNA 复制过程中的一种重要蛋白[43]。
更多关于fta-miR632家族基因的研究将有助于更
好地了解真核细胞DNA复制的调控机制。值得注
意的是，1个由BI800203编码的与生物胁迫响应相
关的靶基因也被预测到，发现该基因序列与抗病基
因家族（NBS-LRR）中的亮氨酸重复保守区十分相
似[44]，这对于深入了解荞麦的抗病机制有重要意义。
其他靶基因可能与生物体的转录和信号转导等有
关（表3）。
2.4生物信息学预测荞麦 miRNAs评价
以生物信息学方法预测 miRNAs及靶标较其
他方法简便且成本低，适用于从那些没有任何
miRNAs信息的物种中获取miRNAs。但是也存在不
足。首先是已报道的相似RNA序列较少会导致较
低的筛选率。本研究中被筛选出的miRNAs所占比
例仅为1.1%，低于玉米的5%，原因就在于玉米已
报道的相似序列较多[45]。因此，对于荞麦miRNAs的
深度挖掘，该种属的高通量测序工作仍是十分必要
的。其次，信息学手段预测到的miRNAs还需要进
一步的试验验证。如反转录实时定量PCR，RNA干
扰实验，过表达，northern杂交等，以及进一步地分
析miRNAs调控下的靶基因在不同组织、不同器
官、不同发育阶段的表达和目的蛋白的功能。这些
验证结果将有助于详细地了解在荞麦 miRNAs是
如何具体调控转录后基因表达的。
2.5荞麦 miRNAs系统进化分析
对荞麦属不同miRNA家族的前体序列进行聚
类，分析不同miRNA家族成员间的系统进化关系。
由图3可知，所有miRNAs被分成3组。组I含有的
家族成员数最多（9个家族成员），其又可分为2个
亚组。从图3还可以看出，同一家族的miRNAs通
常聚在一起且遗传一致性为100%，说明了同一家
族miRNAs成员间的进化保守性。不同家族成员的
miRNAs通常不会聚到一起，如组Ⅱ和组Ⅲ中fta和
fes-miRNA家族分别聚类在2个组中，其原因可能
是：一方面预测到的miRNA基因家族成员数较少，
造成比对数据范围狭窄；另一方面，可能是这些m
iRNAs 确实参与调控了该物种不同的生理生化
活动[33]。
有研究报道了荞麦的起源问题[46]，认为甜荞起
源于我国西南部较温暖地区，其祖先是大野荞（F.
megaspartanium），苦荞起源于青藏高原东部海拔较
高的寒冷地区，其祖先是毛野荞（F. pilus）。图3显
示，金荞麦的3个miRNAs均与甜荞的miRNAs聚
为一簇，这似乎也暗示了2个物种的亲缘关系较
近。考虑到金荞麦多为野生，广泛分布于与甜荞起
源地气候条件相似的温暖潮湿地区[47]，本研究推测
金荞麦与甜荞可能有共同的祖先——大野荞，甜荞
可能是大野荞经过长期进化，其中一部分种经过人
为采集、种植、驯化逐渐演变成的栽培种；金荞麦则
进化相对保守，未经过人为驯化或不适宜大面积种
植，仅能适应原始的野生条件。
3 结论
本研究以生物信息学方法预测了荞麦属的
13 个miRNAs，属于11个miRNA家族。不同物种
间的miRNAs序列既有保守性，也有多样性；荞麦
miR1298家族与智人和家鼠同源性很高，推测其在
动植物界中可能广泛存在。本研究共预测到17个
靶基因，其中多数与植物的代谢调控有关。不同荞
麦种间的miRNA家族系统进化分析显示，甜荞与
金荞麦可能起源于共同的祖先。本研究有助于荞麦
属miRNAs及靶基因表达调控机制的研究，这对荞
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麦的生长调控、抗病、药理、遗传和进化等方面的研
究具有十分重要的意义。
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续往下生长。其原因可能为：（1）生根培养基里生长
素和细胞分裂素的浓度或二者比例，不适合皂角继
续生根生长。（2）皂角在生根培养过程中，可能产生
某种有害或抑制其生长的物质[20]，导致其生根后不
再生长，最后根部腐烂死亡。（3）琼脂和蔗糖的浓度
可能影响培养植株的生长和发育，进而导致植株生
长周期过长或者抑制了植株的生长。由于时间所限
且进行琼脂和蔗糖最适浓度研究所需步骤较多较
繁琐，因此，未能得到好的结果。
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