全 文 ：梨属 DNA提纯方法的比较研究
马兵钢1 , 赵宗胜2 , 冯建荣1 , 高剑峰3 , 蒋迪军1 , 牛建新1
(1 石河子大学农学院园艺园林工程系 ,石河子 832003;
2 石河子大学农学院动物科学系 ,石河子 832003;
3 石河子大学生物科学系 ,石河子 832003)
提要:通过比较试验 , 使用SDS-氯仿-异戊醇法 ,并添加 BME及 Vc ,可简便 、快速地从梨属成熟叶
中提取大分子量能且很好地被酶切的 DNA ,有效地去除了梨属植物组织中富含的多酚类 、单宁 、色素及
多糖类杂质。
关键词:梨属;库尔勒香梨;DNA;纯化方法
中图分类号:S661.2　　　文献标识码:A　　　文章编号:1007-7383(2000)04-0277-05
提取高质量的 DNA是分子克隆的关键步骤 ,目前关于植物 DNA的提取有许多方法 ,
如CTAB法[ 1 ,2] 、SDS法[ 3 ,4]及高盐低 pH 法等[ 5 ,6] 。通过这些方法已成功地提纯了许多动
植物的 DNA。刘萍还在农作物上进行了 DNA提取方法与植物种类的效应比较研究[ 7] ,结
果表明 ,不同的植物应采取不同的提取方法 ,植物种类与提取方法互作效应的方差分析表
现极为显著。而对梨 、葡萄 、棉花等单宁类物质 、酚类及色素物质含量较高的物种来说 ,其
DNA的提取 、纯化较为困难 ,以一般 SDS法提取的梨 DNA质量不高 ,褐变严重 ,无法用于
扩增[ 8] 。Sayuri Teramoto等以 CTAB法提取梨 DNA ,然后过柱纯化作 RFLP 用[ 9] ,虽然能够
成功 ,但药品成本较高 ,操作复杂 ,对微量提取难于做到 。本试验试图对 DNA 的微量快速
提取法———SDS法做一些改进 ,加入 BME 和Vc作为抗氧化剂 ,使用氯仿∶异戊醇作为抽
提剂 ,以得到一种简便迅速的梨属 DNA的提纯方法 ,可获得能完全酶切的高纯度 DNA 。
1　材料与方法
1.1　材料
大香水梨 、库尔勒香梨分别取自石河子大学农学院园林系果树试验站和库尔勒沙依
东园艺场 。1999年 8月 10日取成熟叶片 ,用 dH2O清洗除去表面污物 ,用滤纸吸干表面残
留水分 ,标记分装 ,置-20℃冰箱冷冻保存备用。种子样品从贮藏果实中剖出 ,剥去种皮 ,
标记分装后 , -20℃冷藏备用 。
1.2　DNA的提取方法
1.2.1　CTAB 1次裂解法(方法1)
参照文献[ 9] 。取 0.2 g 组织 ,加入 1 mL DNA提取 buffer(700 mmol/L NaCl ,100 mmol/
L Tris-HCl pH8.0 ,20 mmol/L EDTA pH8.0 ,1.5%CTAB ,1%BME)。按不同有机溶剂的抽提
方法分为 4个处理 ,A:加入等体积的水饱和酚 ,缓慢颠倒混匀 10 min ,12 000 r/min离心 10
第 4 卷　第 4期
2000年 12 月 　　　　　　 石河子大学学报(自然科学版)Journal of Shihezi University(Natural Science)　　　　　　Vol.4　No.4Dec.2000
收稿日期:1999-12-10
DOI :10.13880/j.cnki.65-1174/n.2000.04.004
min ,取上层水相 ,再依次用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽
提1次;B:依次用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇 ,氯仿∶异戊醇各抽提 1次;C:用等体积的氯仿
∶异戊醇抽提 1次;D:对上清液不进行抽提。
1.2.2　CTAB 2次裂解法(方法2)
取0.2 g 组织 ,加入 1mL DNA提取 buffer(500 mmol/L NaCl , 100 mmol/L Tris-HCl pH
8.0 ,20 mmol/L EDTA pH8.0 , 1.0%SDS),再加入适量石英砂 ,冰浴研磨至糊状 ,移入 1.5
mL Eppendorf管中 ,4℃12 000 r/min离心2 min ,弃上清 ,重新加入 1mL DNA提取 buffer ,以
同样条件离心 2min ,弃上清 ,加入1 mL65℃预热的裂解 buffer(700 mmol/L NaCl ,50mmol/L
Tris.HCl pH8.0 ,10 mmol/L EDTA pH8.0 ,1.5%CTAB , 1%BME)悬浮沉淀 ,以后处理步骤同
方法 1。
1.2.3　SDS法(方法 3)
参照文献[ 10] 。取 0.2 g组织 ,加入1 mL DNA提取 buffer(500 mmol/L NaCl ,100mmol/
L Tris-HCl pH8.0 ,50 mmol/L EDTA pH8.0 ,1.5%SDS , 1%BME)。
1.2.4　改良SDS 法(方法 4)
取0.2 g组织 ,加 1 mL DNA提取 buffer(700 mmol/L NaCl ,100 mmol/L Tris-HCl pH8.0 ,
50 mmol/L EDTA pH8.0),再加 3%BME 、0.1 g/g 鲜重样品Vc 、适量石英砂 ,冰浴研磨 ,匀浆
转入 1.5 mL Eppendorf管中 ,加预热的 3%SDS ,65℃水浴 20 min , 12 000 r/min离心 2 min ,
取上清 ,加等体积氯仿∶异戊醇 ,缓慢混匀10min ,4℃12 000 r/min离心5 min ,取上层水相 ,
加KAc至 2.5 mol/L ,混匀 ,0℃放置 10 min ,4℃12 000 r/min离心5 min ,取上清 ,加 1/10体
积的 10 mol/L NH4Ac(pH5.2),混匀 ,再加 2/3体积-20℃预冷的异丙醇 ,混匀 ,0℃放置 10
min ,即出现絮状DNA沉淀 ,12 000 r/min离心 30 s ,弃上清 ,加 500μL的 75%乙醇 ,漩涡振
荡使沉淀悬浮 ,12 000 r/min离心 30 s ,弃上清 ,再重复洗 1 、2次 ,真空抽干或吹干(使乙醇
挥发干净 ,但不能使水完全挥发),于 100 μL TE(100 mmol/L Tris-Cl ,1 mmol/L EDTA pH8.
0)中溶解沉淀[ 8 , 11～ 14] 。该方法根据在提取 buffer 中添加不同抗氧化剂分为 3 个处理 ,E:
添加 3%BME;F:添加 0.1 g/g鲜重样品Vc;G:添加 3%BME及 0.1 g/g 鲜重样品 Vc。
1.3　DNA质量检测
将提纯的 DNA样品适当稀释 ,经 755型分光光度计检测 ,读取 260 nm 、280 nm 和 230
nm的 OD值 。
1.4　DNA的电泳检测
以0.8%的琼脂糖凝胶(含EB 0.5μg/mL)电泳分析 ,4V/cm稳压电泳 45min后停止 ,
于ZF型紫外分析仪下观察并照像。
1.5　DNA的酶切
首先对RNA进行消化(在DNA粗取液中加 RNase酶液至终浓度为 10μg/mL , 37℃,60
min)后 ,用限制性内切酶 ECOR I 进行酶切(20 μL 酶切反应体系包含:ddH2O 16.3 μL;
RE10×buffer 2.0 μL;Acetylated BSA 10 μg/μL ,0.2μL;DNA 1 μg/μL;1.0μL ,ECOR I ,10 U/
μL ,0.5μL。37℃水浴 2 h),用 1%琼脂糖凝胶电泳 ,染色 ,紫外检测并拍照。
278　　　　　　　　　　　　　　石河子大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　第 4 卷
2　结果与分析
2.1　CTAB不同裂解方法及不同抽提方法对 DNA提纯效果的影响
从表 1和图 1中可以看出 ,方法 1和方法 2在使用抽提剂的情况下均可获得较理想
的DNA粗提液 ,A260/A280为 1.67 ～ 1.85 ,A260/A230为1.72 ～ 1.95。DNA粗提液的颜色
从灰白色到浅褐色。电泳后 ,DNA带整齐 、清晰 ,基本无拖尾现象 , RNA 带亦较弱 ,表明
DNA的纯度较高且降解少。对同一种抽提方法 ,方法 1和方法 2的提纯效果有一定的差
异 ,但差异并不十分显著 。其中 ,以方法 2 并在抽提过程中使用了苯酚的效果为最好 ,
A260/A280均在 1.84以上 ,A260/A230均在 1.91以上 ,且抽提后样液的颜色和 DNA 粗提
液的颜色均是所有 CTAB 法中最淡的 ,分别为浅褐色和灰白色 ,但该法操作过程较为繁
琐。不使用任何抽提剂所获得的 DNA粗提液质量相对较差 ,电泳后DNA条带较暗 。
表 1　不同的抽提方法对 CTAB法叶片 DNA提纯效果的影响
抽提处理 抽提后样液颜色方法 2 方法 1
DNA提取液颜色
方法 2 方法 1
A260/ A280
方法 2 方法 1
A260/A230
方法2 方法 1
A 浅褐色 绿褐色 灰白色 浅褐色 1.85 1.82 1.95 1.80
B 浅褐色 绿褐色 灰白色 浅褐色 1.84 1.83 1.91 1.77
C 褐色 褐色 浅褐色 浅褐色 1.79 1.67 1.86 1.72
D 褐色 褐色 褐色 褐色 1.61 1.52 1.67 1.66
2.2　SDS提取方法及不同抗氧化剂对 DNA提纯效果的影响
将方法3作为对照 ,分别加入不同的抗氧化剂作为处理(表 2 ,图 2)。结果表明 ,所有
提纯方法中种子的提取液总是为白色 ,而叶片的提取液则表现出深浅不同的颜色 。在叶
片和种子的DNA提纯过程中 ,同一种提纯方法表现出的提纯效果较为相似。用一般 SDS
提纯方法 ,叶片使用氯仿∶异戊醇抽提后为褐色 ,最终获得的 DNA粗提液为浅褐色 ,A260/
A280及 A260/A230值很低 ,电泳不能得到清晰可见的 DNA带。
　　
　　1 方法 2 , 处理A;2方法 2 ,处理 B;
　　3 方法 2 , 处理 C;4 方法 2 ,处理 D;
　　5 方法 1 , 处理A;6 方法 1 , 处理 B;
　　7 方法 1 , 处理 C;8 方法 1 ,处理 D;
　　9 方法 3 , 叶片;10 方法 3 ,种子
图 1　不同抽提方法获得的 DNA 电泳图谱
　　　　　　
1 叶片 ,处理 E;2 叶片 ,处理 F;
3 叶片 ,处理 G;4 种子 ,处理 E;
5 种子 ,处理 F;6～ 7种子 , 处理G;
8 处理 E 的沉淀再提物;9 处理 F 的沉淀
再提物;10 处理G 的沉淀再提物
图 2　不同抗氧化剂处理 DNA电泳图谱
279　第 4 期　　　　　　　　马兵钢 , 等:梨属 DNA提纯方法的比较研究
　　使用方法 4 ,添加不同的抗氧剂处理均得到了较好的效果 ,使用氯仿∶异戊醇抽提后
的样液及 DNA粗提液的颜色均较淡 ,A260/A280 和 A260/A230的值分别在 1.61以上和
1.71以上 ,电泳后得到的DNA带较为清晰 、整齐 ,但 RNA相对含量较 CTAB法高。3种不
同抗氧化剂处理中 ,加入 0.1 g/g 鲜重样品 Vc效果较差 ,而同时加入入 3%BME及 0.1 g/
g 鲜重样品 Vc的效果较好。该处理的叶片 DNA粗提液颜色为白色至透明状 ,A260/A280
在1.80以上 ,A260/A230在 1.85以上 ,且 DNA电泳条带整齐 ,无拖尾 ,降解少 。
表 2　不同抗氧化剂对 SDS法 DNA提纯效果的影响
处理 抽提后样液颜色叶片 种子
DNA提取液颜色
叶片 种子
A260/ A280
叶片 种子
A260/A230
叶片 种子
CK 褐色 白色 浅褐色 白色 0.75 0.62 0.83 0.51
E 粉绿色 白色 灰白色 白色 1.76 1.79 1.89 1.79
F 米黄色 白色 灰白色 白色 1.63 1.61 1.74 1.71
G 浅红色 白色 白色 白色 1.82 1.80 1.85 1.91
1 叶片 , 处理 E;2 种子 ,处理 E;3 叶片 , 处理 F;
4 种子 ,处理 F;5 叶片 ,处理 G;6 种子 ,处理 G;
图 3　改良 SDS法的 ECORI酶切图谱
2.3　改良 SDS法的 DNA样本酶切结果
3种添加抗氧化剂处理的改良 SDS 法
所获得的 DNA粗提液经 RNase 消化后 ,再
经ECOR I 酶切后得到酶切图谱(图 3)。
由图 3可以看出 ,3种处理的 DNA粗提液
均能被限制性内切酶ECOR I 酶切 ,其中以
同时加入 3%BME及 0.1 g/g 鲜重样品 Vc
的处理酶切较完全。
3　小结与讨论
1)本试验改良了 SDS 提纯方法 ,不使
用CTAB 、苯酚而较为简便 、快速 、低成本地提纯了较高纯度的梨DNA ,能完全被ECOR I酶
切而进一步用于分子生物学试验。
2)在改良SDS法中 ,进行抽提后 ,加入2.5 mol/L KAc可更有效地沉淀蛋白质 ,较使用
含酚抽提剂反复抽提去除蛋白更简便 、经济和广谱。分别对 3种处理离心后的沉淀再次
悬浮提取 DNA后 ,得到的 DNA粗提液经电泳后均不能得到清晰的 DNA条带(图 2),说明
该方法能较完全地从组织中提纯 DNA。
3)在有条件的情况下 ,将研磨置于液氮条件下 ,且在抽提过程中多用酚∶氯仿∶异戊醇
抽提 1遍 ,或在获得 DNA粗提物之后再用酚∶氯仿∶异戊醇等重新抽提 1遍 ,则结果更为
理想 。
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A Comparison of DNA Extraction Methods in Pyrus
MA Bing-gang1 , ZHAO Zong-sheng2 , FENG Jian-rong1
GAO Jian-feng3 , JIANG Di-jun1 , NIU Jian-xin1
(1 Department of Horticulture &Forestry Engineering , Agricultural College , Shihezi University , Shihezi 832003 , China;
2 Department of Animal Science , Agricultural College , Shihezi University , Shihezi 832003 , China;
3 Department of Biology Science, Shihezi University , Shihezi 832003 , China)
Abstract:We often fall to get good effect from extracted DNA of Pyrus.This problem has been
attributed to high content of phenolic terpenoids , tannin , pegments , polysaccharide , and so on.The
methodology of DNA purification described here uses SDS and BME ,Vc which could effectively re-
move them from the homogenate.The isolated DNA is the high purity and high molecular weight
DNA that can be suitable for digestion with restriction enzyme.
Key words:Pyrus;Kurle fragrant pear;DNA;isolation methods
281　第 4 期　　　　　　　　马兵钢 , 等:梨属 DNA提纯方法的比较研究