全 文 ：应用与环境生物学报　2001 ,7(2):143～ 146 　 　
Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X 　 2001-04-25
　
发根农杆菌 T-DNA基因对 3种葛属植物毛状根
形态和葛根素含量的影响＊
刘传飞1 ＊＊　李　玲2 　潘瑞炽2 　金乐红1
(1江西农业大学农学院　南昌　330045)
(2华南师范大学生物系　广州　510631)
摘　要　野葛 、山葛和三裂叶葛的离体叶片与发根农杆菌 R1601 直接感染诱导出毛状根并能够合成葛根素 , 毛状根
离体培养后均出现两种形态:一种是有较高的葛根素含量的典型毛状根 ,另一种是葛根素含量低但生长速率较快的愈
伤组织化毛状根.两类毛状根均有 rolB 基因存在 ,表明 rolB基因对所有毛状根的诱导和生长是必需的.aux1 存在于所
有愈伤组织化毛状根 ,而在典型毛状根中的检出率为 20%～ 50%, 表明 aux1 基因有诱导毛状根产生愈伤组织的作用.
含有 ags基因的毛状根葛根素含量低于不含 ags基因的毛状根葛根素含量 ,表明 ags基因不利于次生代谢物合成.表
3 参 12
关键词　发根农杆菌;葛属;毛状根;形态;葛根素
CLC　Q946.8 ∶Q78 ∶Q943.1
EFFECTS OF AGROBACTERIUM RHIZOGENE T-DNA GENES ON
MORPHOLOGY AND PUERARIN CONTENT IN THREE PUERARAE PLANTS
LIU Chuanfei1 ＊＊ , LI Ling2 , PAN Ruichi2 &JIN Lehong1
(1 School of Agronomy , Jiangxi Agricultural Universi ty , Nanchang　330045, China)
(2 Department of Biology , South China Normal University , Guangzhou　510631 , China)
Abstract　Direct in vitro infection of leaves in vitro of three puerarae plants , Pueraria lobata (Willd.)Ohwi.,
P.lobata var.montana (Lour.)van der Maesen.and P .phaseoloides (Roxb.)Benth.,with R1601 strain of
Agrobacterium rhizogenes induced hairy roots with the capacity to produce puerarin.Hair roots cultured in vitro
showed two morphologies:One was typical hairy roots with high puerarin content , and the other was callus-like
hairy roots with low puerarin content and fast growth.Rol B gene in all typical and callus-like hairy roots indicted
that rol genes were necessary for induction of all transformed roots showing typical hairy root and callus-like mor-
phologies.Aux1 gene , existed in all callus-like hairy roots but only in 20%～ 50%typical hairy roots , suggested
a significant role of aux genes in induction of callus on transformed roots.Puerarin content in hairy roots harboring
ags gene was lower than that in those without ags gene , suggesting that the detriment of ags gene to secondary
metabolite production.Tab 3 , Ref 12
Keywords　agrobacterium rhizogene;puerarae;hairy root;morphology ;puerarin
CLC　Q946.8 ∶Q78 ∶Q943.1
　　发根农杆菌能够感染大多数双子叶植物和少数
单子叶植物 ,并在感染部位产生大量生长迅速 、多分
支的毛状根[ 1] .离体毛状根能在无激素基本培养基上
快速生长 ,是生产植物次生代谢物的良好培养系统 ,
特别适合根部次生代谢物的生产 ,受到人们的广泛
收稿日期:2000-09-25　　接受日期:2000-11-08
＊广东省科委重点项目(99002)和江西省自然科学基金资助
＊＊现通讯地址为:南京大学生命科学学院生物科学与技术系 , 南京
210093.Email:liuchuanfei@163.net
重视[ 2] .毛状根的诱导是发根农杆菌质粒 Ri T-DNA
上基因转移到植物细胞并表达的结果.根诱导基因
rol 和生长素基因aux 分别位于 Ri TL-DNA和 Ri TR-
DNA 上 ,与毛状根的诱导和形态密切相关 ,而位于 Ri
TR-DNA上的农杆碱合成基因 ags在转化细胞中合成
农杆碱作为细菌的 C源和N源[ 3] .植物次生代谢物的
形成往往与器官分化密切相关 ,虽然 Ri TL-DNA和 Ri
TR-DNA对毛状根的生长和形态的重要作用有一定研
究 ,但其基因对次生代谢物生产的直接作用很少报
道[ 4] .野葛(Pueraria lobata (Willd.)Ohwi.)是我国传
统中药 ,有解表退热 ,生津止渴和止泻的功能 ,主治表
症发热 、无汗 、口渴 、头痛项僵 、麻疹不透 、泻泄和痢疾
等 ,其有效成分为葛根素等异黄酮类化合物[ 5] .山葛
(P.lobata var.montana (Lour.)van der Maesen.)和
三裂叶葛(P .phaseoloides (Roxb.)Benth.)与野葛同为
葛属(Puerarae)植物 ,次生代谢物成分相似 ,均是我国
重要的药用资源植物[ 6] .我们已用发根农杆菌 R1601
成功对上述三种葛属植物进行遗传转化[ 5] .本文主要
研究发根农杆菌Ri T-DNA基因 rolB 、aux1和 ags 对3
种葛属植物毛状根生长形态和次生代谢物含量的影
响.
1　材料与方法
1.1　毛状根诱导
分别从野葛 、山葛和三裂叶葛种子的无菌苗(h ≈
8 cm)上切取中部叶片 ,与对数生长期的发根农杆菌
R1601菌液直接感染获得毛状根[ 5] .诱导毛状根所需
时间指从外植体与农杆菌感染直到在外植体上出现
明显毛状根分化所经历的时间;毛状根诱导率(%)=
(产生毛状根外植体数/感染外植体总数)×%(感染
30 d统计).
1.2　毛状根培养
切取经诱导外植体上生长的毛状根根尖(l=2 ～
4 cm)除菌后[ 7]培养在无激素 1/2MS固体培养基中 ,
置于 25 ℃暗培养 ,每4 wk继代1次.愈伤组织化毛状
根(%)=(离体培养愈伤组织化毛状根数/离体培养
的毛状根总数)×%
1.3　毛状根基因组 DNA提取和 Ri T-DNA基因扩增
毛状根基因组 DNA提取按 CTAB法[ 8] .PCR反应
缓冲液总体积 25 μL , 内含 200 ng 毛状根基因组
DNA ,12.5 pmol/ μL 寡核苷酸引物 ,200 μmol dNTPs ,1
unit Taq酶活性.PCR反应条件为 ,94℃预变性 5 min ,
然后 94℃变性 1 min ,55℃退火 1 min ,72℃延伸反应 2
min ,共 30个循环 ,最后 72℃延伸反应 5 min.取 PCR
反应混合物 5 μL 于1.5%琼脂糖凝胶电泳 ,并在紫外
灯下检测 ,以 φх174DNA-haeIII为核酸分子量 Marker ,
rolB 、aux1 和 ags 基因片段分别为 862 bp , 534 bp 和
343 bp[ 4] .
1.4　毛状根葛根素提取和含量测定
称取干样 0.2 g ,加 10 mL 95%乙醇研磨成匀浆 ,
倒入具塞试管于 4℃浸提 48 h ,经 4 000×g 离心 5
min和 φ0.45 μm滤膜过滤 ,定容于 25 mL容量瓶.反
相HLPC 法测定 ,色谱条件为 , Beckman色谱仪 ,阵列
式二极管紫外检测器(168 Detector , 125 Solvent Mod-
ule),检测波长 λ=248 nm , C18色谱柱.流动相为 V
(methanol):V(water)=1:1 , v=1.2 cm/min ,进样量 20
μL ,在此条件下 ,葛根素保留时间为 2.17 min[ 9] .
2　结果与讨论
2.1　毛状根离体培养形态 、生长与葛根素形成
在实验的 3种葛属植物中 ,发根农杆菌 R1601均
能诱导其外植体产生毛状根 ,但诱导毛状根产生的外
植体百分率和所需时间不同(表 1).三裂叶葛叶片外
植体产生毛状根的百分率为 28%,而野葛和山葛叶片
外植体分别为 15%和17%;三裂叶葛与农杆菌 R1601
感染 10 d就陆续分化出明显的毛状根 ,而野葛和山
葛叶片外植体均需要 15 d 后才出现毛状根.三种葛
属植物的毛状根均主要出现在叶中脉及细脉位置 ,多
数密集丛生 ,感染 30 d 后均不再分化出新的毛状根.
表 1　培养 1月后葛属植物毛状根的生长和葛根素含量
Table 1　Growth and puerarin content of hairy root in plants after a month culture
测定项目
Test item
野葛
P.lobata(Willd.)
Ohwi
山葛 P.lobata
var.montana
(Lour.)van der Maesen
三裂叶葛
P.phaseoloides
(Roxb.)Benth
毛状根诱导所需时间(t/ d)＊ Time of hairy root induction 15 15 10
毛状根诱导率(w/ %)of hairy rooting explants＊ 15 17 28
愈伤组织化毛状根率(w/ %)of roots with callus-like morphology ＊ 12 15 22.6
愈伤组织化毛状根鲜重(m/ g)(mar/ g)of callus-like roots＊＊ 4.5 4.8 6.2正常毛状根鲜重(m/ g)of hairy roots＊＊ 2.3 2.5 3.0
愈伤组织化毛状根葛根素含量(w/ %)(w(puerarin)/ %)of callus-like roots＊＊ 1.8 0.1 0.2
正常毛状根葛根素含量(w/ %)(w(puerarin)/ %)of hairy root s＊＊ 2.8 0.3 0.3
　　＊% obtained over 20 experiments.＊＊average of 30 determinations.FW represents fresh weight , DW represents dry weight.
144　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　应 用与 环境 生物 学 报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 7卷
表2　愈伤组织化毛状根和典型毛状根基因组中 rolB , aux1 , ags基因的 PCR检测
Table 2　PCR study of the presence of rolB , aux1 , ags genes of Ri
T-DNAinserted in the genome of callus-like or typical hairy roots＊
物种 Plant species 形态 Morphology 毛状根基因 rolB 生长素基因 aux1 农杆碱基因 ags
野葛 callus-like 100% 100% 100%
P.lobata (Willd.)Ohwi hairy root 100% 20% 30%
山葛 P.lobata var. callus-like 100% 100% 100%
montana (Lour.)van der Maesen hairy root 100% 20% 20%
三裂叶葛 callus-like 100% 100% 100%
P.phaseoloides(Roxb.)Benth hairy root 100% 50% 60%
　　　　＊ The data of each treatment was average of 10 determinations
　　将毛状根根尖(l ≈2 ～ 4 cm)从外植体上切下在
附加 250 mg/L cetofaximine 的MS固体培养基上除菌 2
d ,然后置于MS固体培养基上 ,毛状根快速生长并表
现出两种完全不同的形态特征.大多数毛状根仍然维
持典型的毛状根特征(快速生长 、多分支 、负重力向
性),但12%～ 22.6%毛状根则出现高度愈伤组织化 ,
并一直保持到此后的继代培养 ,最后完全丧失根的形
态特征.毛状根的生长速率与形态密切相关 ,有愈伤
组织化趋势的毛状根生长速率明显快于典型毛状根 ,
培养 130 d 后 ,前者的生物量接近后者的 2倍(表 1).
在3种葛属植物转化根中 ,三裂叶葛转化根生长速率
最快 ,而野葛和山葛转化根的生长速率非常接近.
毛状根离体培养愈伤组织化现象在许多植物中
广泛存在 ,由于细胞的脱分化 ,其中的次生代谢物含
量可能发生较大变化.在 3 种葛属植物转化根中 ,愈
伤组织化毛状根中的葛根素质量分数值(w/ %)均明
显低于相应的典型毛状根中的葛根素 w/ %(表 1).
2.2　毛状根的形态 、葛根素含量与 Ri T-DNA 基因
rolB 、aux1和 ags的关系
为了研究发根农杆菌 Ri T-DNA 基因 rolB 、aux1
和 ags 与转化根形态 、葛根素含量的关系 ,分别随机
选择野葛 、山葛和三裂叶葛愈伤组织化毛状根和正常
毛状根的 10 种不同品系继代物 ,对其基因组中上述
基因进行 PCR.结果(表2)表明 ,在 3种葛属植物转化
根中 ,愈伤组织化毛状根基因组中均存在 rolB 、aux1
和 ags基因 ,而正常毛状根基因组中 ,只有 rolB 基因
全部存在(100%),扩增出 aux1基因的几率为 30%～
60%,扩增出 ags 基因的几率为 20%～ 50%, 可见
rolB基因是诱导愈伤组织化毛状根和正常毛状根所
必需的 ,而 aux1基因可能诱导毛状根的愈伤组织化.
为了研究农杆碱合成基因与毛状根中次生代谢
物形成关系 ,随机选择 3种葛属植物毛状根系扩增
ags基因并测定其葛根素含量(表 3).结果表明 ,不含
ags基因的毛状根葛根素含量明显高于相应的含 ags
基因的毛状根葛根素含量 ,这种现象在 3种葛属植物
毛状根上表现一致 ,由此说明 ,农杆碱基因的导入不
利于毛状根次生代谢物的合成.
表 3　ags基因和葛根素含量的关系
Table 3　Relationship of ags genes and puerarin production＊
物种
Plant species
ags wa r(puerarin)/ %
野葛 + 3.2
P.lobata(Willd.)Ohwi - 2.5
山葛 P.lobata var. + 0.15
montana(Lour.)van der Maesen - 0.08
三裂叶葛 + 0.34
P.phaseoloides(Roxb.)Benth - 0.10
　＊Each value is the average of ten deteriminations.+ represents presence of
ags gene;-represents absence of ags gene.
3　讨 论
野葛 、山葛和三裂叶葛的转化根离体培养后均出
现两种形态变化 ,一种仍然维持典型的毛状根形态 ,
另一种是愈伤组织化毛状根.两种形态的毛状根中均
存在 rolB基因 ,说明 rolB 基因对 3种葛属植物毛状
根的诱导与生长是必需的.Nabata 认为 rolB基因是
TL-DNA 区上诱导毛状根最有效的基因 ,而该区上其
余基因可能与 rolB基因协同作用[ 10] .
由于 TL-DNA 在转化细胞中相对稳定 , 而 TR-
DNA在转化细胞很不稳定 ,容易发生缺损或降解[ 11] ,
这可能使 3种葛属植物转化根的生长形态发生变化.
愈伤组织化毛状根中均含有 TR-DNA区上的 aux1基
因 ,说明 aux1基因可能诱导毛状根的愈伤组织化.3
种葛属植物典型毛状根中有 20%～ 60%含有 aux1基
因 ,培养过程中仍然维持典型的毛状根形态 ,推测
aux1基因在这些毛状根中不表达.aux1基因与生长
素的合成有关 ,因此 aux1基因诱导毛状根的愈伤组
织化可能与生长素的合成有关.外源生长素同样能够
诱导毛状根愈伤组织化[ 12] .
含有 ags基因的愈伤组织化毛状根中的葛根素
含量低于不含有 ags 基因的愈伤组织化毛状根中的
葛根素含量 ,说明 ags基因的存在不利于葛根素类次
生代谢物的生产 ,可能是农杆碱的合成需要消耗大量
145　2期 刘传飞等:发根农杆菌 T-DNA 基因对 3种葛属植物毛状根形态和葛根素含量的影响 　　
的碳源之故[ 3] .
虽然 3种葛属植物典型毛状根中的葛根素含量
明显高于相应的愈伤组织化毛状根中的葛根素含量 ,
但前者的生长速率明显快于后者 ,两者的葛根素产量
并无显著差异.3种葛属植物的转化根中 ,野葛转化
根的葛根素含量最高.因此 ,就葛根素的生产而言 ,可
以选择不含 aux 基因的野葛典型毛状根或不含 ags
基因的野葛愈伤组织化毛状根进行扩大培养.
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