全 文 ：书第 44卷 第 6期 东 北 林 业 大 学 学 报 Vol．44 No．6
2016年 6月 JOUＲNAL OF NOＲTHEAST FOＲESTＲY UNIVEＲSITY Jun． 2016
1)国家自然科学基金项目(J1310002)。
第一作者简介:赵奉彬，男，1991 年 2 月生，北京林业大学自然
保护区学院，硕士研究生。E－mail:zhaofengbin@ bjfu．edu．cn。
通信作者:张志翔，北京林业大学自然保护区学院，教授。E－
mail:zxzhang@ bjfu．edu．cn。
收稿日期:2015年 10月 20日。
责任编辑:潘 华。
11种杨属植物的倍性鉴定及山杨天然三倍体的发现1)
赵奉彬 尚策 张莉梅 张志翔
(北京林业大学，北京，100083)
摘 要 在西藏芒康的山杨居群中发现有叶型明显偏大的山杨植株，通过与该地其他居群正常山杨的叶型比
较推测其为三倍体山杨，后经流式细胞述验证了上述推测，确定为中国首次发现的山杨天然三倍体植株，同时以白
杨组物种山杨和圆叶杨，青杨组物种冬瓜杨、梧桐杨、康定杨、滇杨、川杨、青杨、辽杨、德钦杨及大叶杨组大叶杨为
研究对象，采用流式细胞仪对每个种代表样本的染色体倍性进行检测。结果表明:这 11个物种全部为二倍体，青
杨、辽杨、大叶杨的倍性与前人报道结果一致，其余 8个种为首次报道。试验结果显示杨属物种的倍性相对稳定，
没有发现四倍体。倍性研究结合叶片研究表明，在青杨组中叶形大小仅为不同种之间存在的形态上的差异，而在
白杨组山杨中可能就是倍性的差异。
关键词 流式细胞仪;天然三倍体;杨树;倍性
分类号 S722．3;Q949．4
Ploidy Testing of 11 Poplar Species and Discovery of Natural Triploid Populus davidiana Dode / /Zhao Fengbin，
Shang Ce，Zhang Limei，Zhang Zhixiang(Beijing Forestry University，Beijing 100083，P． Ｒ． China)/ / Journal of North-
east Forestry University，2016，44(6):23－27．
We found a large leaves form of Populus davidiana at Mangkang in in Xizang． Compared with leaves type between the
big leaves aspen and norsmal aspen speculate the large one is triploid aspen． Then，we verified it using flow cytometry． It
was the first time that the natural triploid aspen was reported． We used the flow cytometry to determine the ploidy level of
the 11 species containing P． davidiana，P． rotundifolia in Section Leuce，P． lasiocarpa in Section Leucoides and P．
cathayana，P． haoana，P． maximowiczii，P． pseudomaximowiczii，P． purdomii，P． yunnanensis，P． szechuanica，and P．
kangdingensis in Section Tacamahaca． All 11 species were diploid． The results of P． cathayana，P． maximowiczii，P． lasio-
carpa were the same with those of previous research，and the rest was reported for the first time． Ｒesults manifested that the
species of the genus Populus shared stabilized ploidy level without tetraploid． Ploidy studies combining blade research show
that the leaves size is the only morphological difference in different species in Section Tacamahaca，but it may be ploidy
difference in species P． davidiana．
Keywords Flow cytometry;Natural triploid;Poplar;Ploidy
杨树是杨柳科杨属(Populus L．)植物的统称，由
于其具有速生丰产和分布范围广的特点，一直被广
泛应用于防护林建设、用材林培育和城市绿化中，对
解决我国木材短缺问题起到了至关重要的作用［1］。
杨属的倍性研究开展较早，BLACKBUＲN K B et
al．［2］首先报道了欧洲黑杨为二倍体，康向阳［3］报道
毛白杨、新疆杨、河北杨和胡杨等都为二倍体，随后
银白杨、小叶杨、大叶杨和欧洲山杨陆续被报道都为
二倍体，齐力旺［4］和张守攻［5］报道辽杨、大青杨、青
杨、香杨、毛果杨、欧洲黑杨等都为二倍体。因而，杨
树天然野生物种多为二倍体。
在多倍体生物中，由于染色体数的增加导致基
因数量增多和细胞容积变大［6］，进而多倍体植物在
叶型、生长量和适应性方面具有显著的优势［7－8］。
三倍体营养器官的巨大性和不育性使得其在以获取
材积为目标和无性系繁殖体为途径的杨树育种中具
有极高的利用价值［9］。自 1935年 NILSSON E H［10］
于瑞典首次发现天然的欧洲山杨三倍体后，各国研
究人员陆续发现美洲山杨、银白杨、香脂杨等的天
然三倍体植株，朱之梯等［11］于 1992 年发现易县天
然毛白杨三倍体雌株，这些天然三倍体往往在材
积、叶片大小、抗性、干型通直度和纤维特性等方
面都优于自然二倍体［12－13］。天然三倍体的发现不
仅为杨树育种提供优良的种质资源，更是研究三
倍体形成机制的重要材料，为人工诱导三倍体提
供理论支撑。
以往的研究发现三倍体杨树植株都具有叶片明
显增大和树形明显增高的特征［14－15］。在西藏芒康
采集到的叶型明显偏大的山杨植株，较其他山杨树
形高大，经形态学研究推测其为三倍体山杨。传统
的倍性鉴定方法主要是染色体压片法，但是由于山
杨扦插难以生根的特性，使得本研究中难以利用这
一方法。流式细胞术是一种对生物颗粒进行定量分
析分选的技术［16－17］，由于其对材料的分裂时期没有
要求使得其比传统染色体压片法的取材更加广泛，
同时易于实验操作，使得其在植物倍性研究中应用
DOI:10.13759/j.cnki.dlxb.20160510.015
广泛，在杨树育种和三倍体鉴定中也较为常
用［18－20］。本研究即通过使用流式细胞术对大叶型
山杨、普通山杨和青杨组丰富遗传资源的代表种冬
瓜杨、梧桐杨、康定杨、滇杨、川杨等 11 个种进行倍
性研究，以期补充我国丰富乡土杨树资源倍性数据
的空白，促进对我国特有乡土杨树资源进行开发与
保护。同时探讨青杨组物种分类与叶片大小的关
系，以及不同叶片大小的山杨个体间的关系。
1 材料与方法
2011年起，在云南、四川、西藏等地采集杨树标
本并记录地理位置信息，2014—2015 年 3—4 月到
挂牌记录地采集具冬芽的枝条，带回北京林业大学
树木学实验室，插于清水中，待其幼叶刚生出时，选
取生长中的新鲜叶片作为试验材料。对照样品二倍
体垂柳采自北京林业大学，二倍体银白杨采自中国
科学院植物研究所，待测大叶型山杨共两个样本，其
他物种每个采集地点各 3个样本。凭证标本存放于
北京林业大学标本馆(BJFC)，具体材料的采集信息
详见表 1。
测量芒康采集的叶型较大的山杨植株标本，与
同一地点的普通的山杨植株的标本中各 50 片成熟
叶子的长度和宽度;同时测量在雾灵山采集的辽杨
和梧桐杨标本中各 20片成熟叶片的长度和宽度;最
后测量在太白县采集的冬瓜杨和青杨标本中各 20
片成熟叶片的长度和宽度。对上述 3组数据分别进
行方差分析。
试验的具体操作步骤参照田新民等［21］的方法:
取幼嫩叶片(约 1 g)于培养皿里，加入预冷的解离
液 WPB(约 3 mL)，用锋利的刀片一次性快速切碎
(每次试验以垂柳材料为外参，三倍体山杨检测时
以二倍体的银白杨为内参;以垂柳和待测杨树以及
银白杨和待测杨树的混合材料为试验材料)，吸取
培养皿内的解离液，用 400 目的滤膜过滤到 1．5 mL
离心管中，离心(转速 1 000 r /min，4 ℃，5 min)弃上
清后，再加入 100 μL 解离液，同时加入 150 μL PI
(碘化丙啶)染液。然后 4 ℃避光染色 10 min，移至
上样管，上机检测。
表 1 杨属材料来源
种 类 采集地点 海拔 /m 凭证标本
青杨(P． cathayana Ｒehd．) 北京小龙门 140 Zfb20140708－5
陕西太白县 2 800 I”－235
德钦杨(P． haoana Cheng et C． Wang．) 云南维西县 2 900 I”－66
辽杨(P． maximowiczii Henry．) 河北雾灵山 1 700 I”－304
梧桐杨(P． pseudomaximowiczii C． Wang et Tung．) 河北雾灵山 1 700 I”－305
冬瓜杨(P． purdomii Ｒehd) 陕西太白县 2 800 I”－247
四川宝兴县 2 500 I”－410
滇杨(P． yunnanensis Dode．) 云南大理 2 200 11－0036
山杨(P． davidiana Dode．) 西藏芒康 3 700 I”－13
云南香格里拉 3 600 11－0100
三倍体山杨 西藏芒康 3 700 I”－9
圆叶杨(P． rotundifolia Griff．) 云南维西县 3 000 PH20120728－04
川杨(P． szechuanica Schneid．) 四川宝兴县 2 600 PH20120708－08
康定杨(P． kangdingensis C． Wang et Tung．) 四川康定 3 200 PH20120714－03
大叶杨(P． lasiocarpa Oliv．) 湖南壶瓶山 1 700 Lilian－09
试验分析设备采用清华大学生物医学测试中心
美国 BD公司的 BD Calibur 流式细胞分析仪，数据
获取通过 CellQuest 软件，所得数据用美国 Yerity
Software House 公司的 ModFit 软件进行分析。已知
PI染料可以和核 DNA 结合放出荧光，流式细胞仪
可检测单个细胞的荧光强度，即可根据荧光强度与
核 DNA含量成正比推算出核 DNA 的相对含量［22］。
ModFit软件分析出的待测杨树的 DNA 相对含量分
布图中，黄色的峰代表垂柳的 DNA 相对含量，红色
的峰代表杨树的 DNA相对含量，根据 Bennett 等［23］
测定的垂柳与银白杨的 2C 值分别为 1．54 和 1．04，
可算出待测杨树样品的 2C(C代表生物体中单倍体
基因组的 DNA含量)，其中 DI 为对照样本垂柳与待
测样荧光强度的比值，公式如下:
2C(待测样)= 2C(垂柳)/DI。
2 结果与分析
2．1 三倍体山杨的发现与验证
叶片测量结果表明两种山杨之间、梧桐杨和辽
杨之间及冬瓜杨和青杨之间在叶子长度和宽度上均
差异显著(p＜0．01)(表 2)。由图 1 可得出:在叶形
上，待测山杨与普通二倍体山杨相似;而在叶片大小
上，待测山杨叶片明显巨大化。故推测大叶型样本
为三倍体山杨。
42 东 北 林 业 大 学 学 报 第 44卷
表 2 不同杨属物种叶片性状描述统计与方差分析
物种 长度 / cm 宽度 / cm
普通山杨 3．77±0．06 3．64±0．06
大叶型山杨 8．39±0．14 8．21±0．15
F值 874．17＊＊ 736．58＊＊
青杨 10．14±0．27 5．33±0．30
冬瓜杨 13．98±0．27 10．11±0．33
F值 103．43＊＊ 116．56＊＊
梧桐杨 12．91±0．19 9．38±0．18
辽杨 9．62±0．09 3．72±0．05
F值 237．79＊＊ 904．69＊＊
注:表中数据为平均值±标准差;＊＊表示差异显著(P＜0．01)。
在用流式细胞仪检测待测山杨样本的过程中，
首先以垂柳为对照，得到图 2 中 M 的分布图，由于
组织细胞中以分裂间期和分裂前期的细胞占多数，
其核 DNA含量代表样本的 2C，在荧光强度 50 处的
主峰代表相对核 DNA 含量为 2C，荧光强度 100 处
为 4C，以此类推，图中待测样品的 2C与垂柳相差不
大，接着以银白杨为内参测定结果如 N、O 所示，黄
色的峰代表待测山杨的 DNA相对含量，红色的峰代
表银白杨的 DNA相对含量，检测出图 N、O 的 DI 值
分别为 1．61 和 1．56，可知待测山杨的核 DNA 相对
含量大约是二倍体银白杨的 1．5 倍，即可初步鉴定
待测山杨为三倍体。
图 1 三倍体山杨与二倍体山杨叶形对比
2．2 11种杨树染色体倍性的检测
在图 3中的 DNA相对含量分布图中，根据与已
知二倍体银白杨的 2C 值比较，可初步鉴定待测杨
树物种的倍性。由图 3、表 3 可知，所有样本的 2C
值都在 1．00 上下浮动，表明表中所有物种 DNA 含
量与二倍体银白杨相近，故推测都为二倍体，不存在
多倍体现象。大叶杨、辽杨和青杨经流式细胞仪的
检测结果与前人研究一致。
M．垂柳+三倍体山杨 N．银白杨+三倍体山杨 O．银白杨+三倍体山杨
图 2 三倍体山杨不同对照的流式细胞仪检测图
表 3 11种杨树的 2C均值
种 类 2C值
青杨(P． cathayana Ｒehd．) 0．94±0．034
德钦杨(P． haoana Cheng et C． Wang．) 0．95±0．010
辽杨(P． maximowiczii Henry．) 0．96±0．025
梧桐杨(P． pseudomaximowiczii C． Wang et Tung．) 0．95±0．035
冬瓜杨(P． purdomii Ｒehd．) 0．95±0．024
滇杨(P． yunnanensis Dode．) 0．96±0．006
山杨(P． davidiana Dode．) 0．94±0．029
圆叶杨(P． rotundifolia Griff．) 0．94±0．030
川杨(P． szechuanica Schneid．) 0．98±0．059
康定杨(P． kangdingensis C． Wang et Tung．) 0．98±0．059
大叶杨(P． lasiocarpa Oliv．) 0．97±0．026
注:表中数据为平均值±标准差。
3 结论与讨论
3．1 野生杨属物种的倍性
使用流式细胞仪鉴定杨属物种的倍性，其结果准
确可靠，并且可在 1 天的时间内分析大量材料，而且
对材料不需要做复杂的处理，大幅度节省时间、提高
效率。通过对我国杨属白杨组 2 种，青杨组 8 种，大
叶杨组 1种倍性的研究，发现除山杨有天然三倍体居
群外，其余全部为二倍体，3 个种青杨、大叶杨和辽杨
与前人报道结果一致，其余 8个种为首次报道。结合
前人研究，可知已报道的杨属 20余种都为二倍体，天
然三倍体植株普遍存在，但仅限于白杨组和少部分黑
杨组物种，没有发现混倍体、非整倍体或者四倍体。
我国具有丰富的杨树资源，特有的青杨组物种 32 种，
占我国杨属的大部分，我国是世界青杨组的分布中心
和变异中心，其中西南地区更是我国青杨组物种的分
布中心［24－25］。本研究选取了西南地区有代表性的青
杨组物种，包括已广泛用于育种研究的滇杨，分布广
52第 6期 赵奉彬，等:11种杨属植物的倍性鉴定及山杨天然三倍体的发现
泛的冬瓜杨、青杨、川杨和具有特殊地理分布的德钦
杨、康定杨，为西南青杨组的倍性研究提供参考，同时
又选取位于我国东北部的辽杨和梧桐杨，结果表明地
理隔离下不同青杨组物种的倍性没有差异。在植物
中，营养体的大小往往和倍性有关，多倍体往往伴随
着营养体的巨大化如叶大株高［13］，而在杨属物种中，
青杨组包括大叶型的冬瓜杨等和小叶型的青杨等，本
次取样包括有大叶型的冬瓜杨、梧桐杨等和小叶型的
辽杨和青杨等，实验结果表明，待测青杨组物种都为
二倍体，不论是大叶型还是小叶型，叶形大小仅为不
同种之间存在的形态上的差异。而在白杨组山杨物
种中，叶形大小可能表明植株之间的倍性差异，而不
是物种之间的差异。同时本研究依据这一形态学性
状结合野外观察首次发现了山杨的天然三倍体植株，
经流式细胞仪检测也验证了其倍性。
图 3 杨属 11个种和垂柳的流式细胞仪的检测图
62 东 北 林 业 大 学 学 报 第 44卷
3．2 天然三倍体山杨的价值及成因
山杨是我国广泛分布的乡土树种，从东北大小
兴安岭、完达山至华北、西北、华中乃至西南的众多
省区，包括黑龙江、河北、甘肃、青海、江苏、云南、西
藏等 23个省［26］，山杨为高海拔强阳性树种，根孽力
强，常在撂荒地、采伐迹地和火烧迹地成片或散生。
本次发现三倍体山杨在叶型大小上与此前发现的欧
洲山杨和美洲山杨类似［13－15］，同时枝条也更加粗
壮，因此在干形、生长速率等方面可能也具有三倍体
普遍的优势，故此优质的山杨遗传资源对山杨育种
的发展有重要的意义。
Montzing［15］认为欧洲山杨三倍体的起源是受环
境影响诸如森林火灾、异常低温或者高温的刺激，二
倍体杨树的花粉母细胞不正常的减数分裂产生 2n
花粉，2n花粉较正常的花粉体积明显偏大，此 2n 雄
配子与正常减数分裂的雌配子受精进而长成天然三
倍体。朱之悌等［11］在大量观察毛白杨不同种源地
无性系的花粉后证实存在有大花粉粒，经研究是 2n
花粉。天然三倍体除以单株存在外，也有以林分形
式存在的，特别是北美西部发现的美洲山杨三倍
体［19］。白杨组三倍体植株的发现与报道比较普遍，
这跟白杨组物种的根萌繁殖特性有极大关系:在美
国西部发现的由 47 000 棵根萌无性系组成的美洲
山杨是世界最大的生物体［27］。白杨组三倍体植株
通过无性繁殖，在母树根部萌发出幼树，因而白杨组
三倍体植株可呈群落分布。杨树天然三倍体在欧洲
和北美西部的广泛分布表明三倍体杨树更能适应当
地的气候。以北美西部为例，由科迪勒拉山系形成
的高原山地气候寒冷干燥，在此地区发现根萌的克
隆植株与三倍体植株的分布区重叠，可推测寒冷的
气候可能有利于产生未减数孢子，同时在低温、干旱
条件下，根萌的无性繁殖方式比有性繁殖消耗的营
养更少，是更有效的种群适应机制。由于三倍体植
株在细胞大小、细胞含水量、气孔大小和密度、生长
速率等方面与普通二倍体有明显差别，这也使得其
更适应严酷的生境［19］。本次发现的天然三倍体山
杨地处横断山脉最北端，海拔 3 700 m，该处寒冷干
燥，山杨往往成群落分布，可能根萌无性系占多数。
三倍体山杨的生境与前人发现欧洲山杨和美洲山杨
的三倍体高海拔生境类似，说明三倍体的形成及白
杨组物种特有的根萌现象与生境有极大的关系。
此次的三倍体山杨为我国首次发现的天然三倍
体山杨植株，性状优良，是良好的育种资源。因为山
杨的广布性和我国生态环境的多样性，山杨的天然三
倍体在我国一定还有大量的分布，特别是在西藏芒
康、云南迪庆等高海拔高寒地区。由于白杨组的根萌
特性使得三倍体植株能够很好的保留下来并且实现
快速繁殖，因而成居群形式的三倍体植株更容易被发
现和利用。相信在不久的将来会有更多的山杨天然
三倍体被发现，为杨树育种提供更多优良资源。
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