全 文 ：收稿日期:2009-06-11
基金项目:国家 “十一五 ”科技支撑计划(2006BAD02B06);贵州省教
育厅培育项目(黔教科 2006103);国家基金项目(30270852,
30471116);贵州省动植物育种专项(黔农育专字 [ 2007] 026
号)。
作者简介:任翠娟(1979-),女 ,硕士 ,讲师 ,主要从事《遗传学 》等课程
的教学和研究。
通讯作者:陈庆富 , E-mail:cqf1966@163.com。
荞麦属(FagopyrumMil)植物资源的 RAPD研究
任翠娟 1 , 陈庆富 2
(1.贵州师范学院化学与生命科学学院 , 贵阳 550018;
2.贵州师范大学生命科学学院植物遗传育种研究所 , 贵阳 550001)
摘要:以 10个随机引物对荞麦属(Fagopyrum)11个种(含大粒组 7个种 ,小粒组 4个种)共 50份栽培及野生荞麦资源进
行 RAPD研究。初步建立了荞麦属不同物种的 RAPD指纹图谱。系统聚类分析表明 ,荞麦属大粒组和小粒组组间以及
不同荞麦种间在 DNA水平上差异极大。在大粒组中苦荞 DNA与其他种之间有较大的差异。大野荞和毛野荞分别与甜
荞和苦荞在 RAPD水平上较近缘 ,支持它们分别是甜荞和苦荞祖先种的假说。
关键词: 荞麦属植物;随机扩增多态性 DNA;系统关系;起源和进化;多态性
中图分类号: S517 文献标志码: A 文章编号: 1001-4705(2009)11-0037-09
StudyonRAPDofGenusFagopyrumResources
RENCui-juan, CHENQing-fu
1.ChemistryandLifeScienceColege, GuizhouNormalUniversity, Guiyang, 550001, China;
2.InstituteofPlantGeneticsandBreeding, ColegeofLifeScience,
GuizhouNormalUniversity, Guiyang550001, China)
Abstract:50accessionsbelongingto11Fagopyrumspecies(including7speciesinthebig-achene-groupbuck-
wheatand4speciesinthesmal-achene-groupbuckwheat)werestudiedbymeansof10 randomprimersand
RandomAmplifiedPolymorphicDNA(RAPD)technique.TheRAPDfingerprintandthephylogenymapof
FagopyrumspecieswereestablishedonthebasisofRAPD.Resultshowedthatthereweremuchgreatdifer-
encesbetweenthebigachenegroupandthesmalachenegrouponDNAlevelandamongdiferentbuckwheat
species.ThediferentiationofF.tataricumDNAwasthebiggestinbigachenegroup, andthediferentiationof
buckwheatandotherspeciesinthebig-achene-groupwasmuch.F.megaspartaniumandF.piluswereverysimi-
lartocommon buckwheatandtartarybuckwheat, respectively, thisphenomenon supportedthatF.
megaspartaniumandF.piluswereancestralspeciesofcommonbuckwheatandtartarybuckwheat, respectively.
Keywords: Fagopyrum;RAPD;phylogeny;originandevolution;polymorphism
荞麦(Buckwheat)属于蓼科(Polygonaceae)、荞麦
属(FagopyrumMil)植物 ,具有很高的营养价值及药用
价值 ,是一种值得开发的粮食作物 、药用植物和蜜源作
物 [ 1, 10] 。 20世纪 80年代初期 ,国内外掀起了研究开
发荞麦的热潮。我国在 70年代末就成立了全国荞麦
科研开发协作组和全国荞麦资源研究协作组 ,并正式
列入国家攻关课题 [ 2] 。我国是栽培荞麦的起源地 ,有
着丰富的栽培荞麦和野生荞麦资源 ,对这些植物资源
进行深入而系统的研究对荞麦的种质资源研究与利
用 、遗传育种等领域有重要意义 。
国际上关于不同荞麦种间的亲缘关系研究较多 ,
主要涉及形态学研究 、同工酶分析 、种子蛋白免疫分
析 、种间杂交研究 、染色体研究 、DNA多态性研究等方
面 。从形态学上看 ,甜荞 、苦荞 、金荞(F.cymosumcom-
plex)是近缘的 , 而且金荞在形态学上极类似于甜
荞 [ 5, 9, 11 ～ 13, 21] 。 Ohnishi＆ Matsuoka对荞麦属种间系统
关系的分析结果 [ 18] , 认为金荞(F.cymosumcomplex)
与苦荞的亲缘关系很密切 , F.homotropicumOhnishi与
甜荞亲缘关系极近缘 ,而 F.capilatumOhnishi、F.cali-
anthumOhnishi、F.pleioramosumOhnishi与细野荞的亲
缘关系密切。在以 RAPD(随机扩增多态性 DNA)为
基础的系统关系研究上 , Suvorova认为金荞最接近于
甜荞[ 22] 。 Chen[ 7, 8]在大粒组和小粒组之间进行种间杂
交发现 ,种间杂交亲和性非常低 ,只有 0 ～ 3%,但大粒
组内可杂交性高达 30%以上 ,认为组间差异很大 ,组
内差异较小 。
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研究报告 任翠娟 等:荞麦属(FagopyrumMill)植物资源的 RAPD研究
DOI :10.16590/j.cnki.1001-4705.2009.11.042
而 Ohnishi[ 17]的同工酶分析认为 ,甜荞 、苦荞 、金
荞之间的亲缘关系较远。 Adachietal[ 4] 通过叶绿体
DNA变异性研究 、YasuiandOhinishi[ 25]的 rbcL基因
DNA序列分析以及 SharmaandJana[ 19]的 RAPD研究
也发现 ,尽管金荞与甜荞在形态学上很类似 ,但在分子
水平上金荞与苦荞的亲缘关系更近 。这与 Shevchuket
al[ 20]的种子蛋白免疫化学分析研究结果一致。
上述研究所用材料都局限于部分种类 ,尤其是没
有对所有大粒组种类进行系统研究。本研究拟对 11
个荞麦种不同收集系进行 RAPD研究 ,以便为荞麦属
植物系统关系研究提供新线索和新资料。
1 材料和方法
1.1 材 料
本研究供试材料涉及荞麦属 11个种 50个收集
系 。所有材料全部由贵州师范大学生物技术与工程学
院植物遗传育种研究所提供。所有实验均在该研究所
完成。实验材料的种类 、名称 、编号 、倍性及原产地情
况见表 1和表 2。
表 1 实验所用栽培荞麦材料目录
名称 种名 编号 倍性 原产地 代号
遵义甜荞 F.esculentum ES2004010102 2x 贵州遵义 es1
毕节甜荞 ES2004010101 2x 贵州毕节 es2
威宁甜荞 ES2004010201 2x 贵州威宁 es3
兴义甜荞 ES2004090101 2x 贵州兴义 es4
大理甜荞 ES2005100801 2x 云南大理 es5
理县甜荞 ES2004100401 2x 贵州道真 es6
武冈甜荞 ES2004102901 2x 湖南武冈 es7
Sibano ES2004062003 2x 德国 es8
T05六荞 1号 ES2005061601 2x 贵州 es9
T03 8802-1 ES2005061601 2x 中国 es10
山西苦荞 F.tataricum TA2003120103 2x 山西 ta1
毕节苦荞 TA2003120101 2x 贵州毕节 ta2
水城细苦荞 TA2005100802 2x 贵州水城 ta3
威宁苦荞 TA2003100101 2x 贵州威宁 ta4
武冈苦荞 TA2004102902 2x 湖南武冈 ta5
苦刺荞 TA2001100503 2x 贵州威宁 ta6
沿河苦荞 TA2001100501 2x 贵州沿河 ta7
沿河苦荞 TA1998100101 4x 贵州沿河 ta8
1.2 方 法
1.2.1 材料的培养
将供试材料的种子在室温下浸泡 12h,在 25℃光
照培养箱中催芽 ,发芽后种植在花盆中培养至 3 ～ 4片
叶龄时 ,按居群取幼嫩叶片提取 DNA。
1.2.2 DNA的提取
采用 2×CTAB法提取 ,即取 0.2g新鲜 、健康的荞
麦幼叶 ,在液氮中充分研磨成粉末 ,转入 1.5ml的离
心管中 , 加入 700 μlCTAB提取缓冲液 (10 mmol/L
Tris-HCl, 1mmol/LEDTA, 2% CTAB, 1%PVP), 65 ℃
预热 20min,充分混匀 ,置于 65℃水浴 40 ～ 50min后 ,
加入等体积的氯仿 -异戊醇混合液(24∶1, V/V),充分
混匀 , 8 000r/min离心 10min。取上清液转到干净的
离心管中 ,加入等体积的氯仿 -异戊醇混合液(24∶1,
V/V),充分混匀 , 8 000r/min离心 10min。取上清液 ,
加入 2倍体积的预先冰冻的无水乙醇 ,轻轻摇动离心
管直至出现絮状沉淀 ,将离心管放在 -20℃中沉淀 10
min,弃去上清液 ,沉淀用预先冰冻的 70%乙醇漂洗 1 ～
2次 ,室温风干 ,最后加入 TE缓冲液(10mmol/LTris-
HCl, 1mmol/LEDTA),置于 -20℃冰箱保存备用。
1.2.3 RAPD扩增反应
(1)反应体系:总体积 20.0μl,即 2.0μl10×PCR
bufer, 1.5μl25mMMgCl2 , 0.4μl10mMdNTP, 1.0μl
4μM10碱基 RAPD引物 , 0.2μl2.5U/μlTaqDNA聚
合酶 , 4.0μl模板 DNA(25ng/μl), 10.9μlddH2O。
(2)PCR扩增程序:94℃预变性 5min, 94℃变性 1
min, 37℃退火 1min, 72℃延伸 2min, 37个循环 ,最后
72℃延伸 5min。
扩增产物用 1%琼脂糖凝胶(含 0.5μg/ml溴化乙
锭)电泳 ,以 λDNA/ EcoRⅠ+HindⅢ作为分子量标准 ,
电泳结束后 ,紫外光下观察并照相。
1.2.4 数据统计分析
每个样品的扩增带按有或无记录 , “有 ”赋值为
“ 1”, “无 ”赋值为 “0”,得到 “0、1”矩阵。统计过程中
只记录重复性好 、显带清晰的带 。
将 “0、1”矩阵在 NTSYS-pc2.10e软件中进行处
理 。遗传相似系数(Geneticsimilarity, Gs)按公式 Gs=
2Nij/(Ni+Nj)计算 [ 16] 。式中:Nij为材料 i和 j公共的
条带数;Ni为材料 i的总带数;Nj为材料 j的总带数。
根据相似系数 ,按照算术平均的不加权的成对分组方
法 (Unweighted Pair-GroupMethod with Arithmetic
mean, UPGMA)对 RAPD扩增结果进行聚类分析 ,建立
样品间的亲缘关系树 。
本研究以标记能在种的水平上稳定扩增的特异性
谱带构建其 RAPD指纹图谱。用引物名称加扩增谱带
分子量来标记谱带 ,如 S1083-500表示 ,该谱带为随机
引物 S1083扩增产生的分子量为 500bp的谱带 。
对于供试材料 3个居群以上的荞麦物种即甜荞
(es)、苦荞(ta)、大野荞(me)、毛野荞(pi)、细野荞
(gr),统计种内和种间多态性谱带数 ,计算种间多态性
比率 、平均种内多态性比率。种间多态性比率(%)=
种间多态谱带数 /总的谱带数 ×100%;种内多态性比
率(%)=种内多态谱带数 /该物种总的谱带数 ×
100%;平均种内多态性比率(%)是 3个以上居群的
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第 28卷 第 11期 2009年 11月 种 子 (Seed) Vol.28 No.11 Nov. 2009
物种种内多态性比率的平均数 。以这些参数反映该属
植物遗传多态性的特点。
2 结果与分析
2.1 RAPD扩增结果
从上海生工生物技术服务公司 200个不同随机引
物中 ,筛选出扩增性好 、带型清晰 、重复性好的 10个引
物进行全部样本的 PCR正式扩增 。 11个荞麦种共 50
份荞麦资源 89个样本经 10个引物扩增出 419条带 ,
平均每个引物产生 41.9条带。筛选出的引物及其序
列 、扩增条带数见表 3。
表 2 实验所用野生荞麦材料目录
编 号 名 称 种 名 倍性 原产地 代号
WE2005112001 野甜荞 F.esculentumssp.ancestralis 2x 西藏 we
HO2004092501 F.esculentumvar.homotropicm 2x 云南 ho
ZU2001112201 佐贡野荞 F.zuogongense 4x 西藏 zu
WT2004100402 野苦荞 F.tataricumssp.potanini 2x 四川理县 wt
ME2005032501 大野荞 F.megaspartanium 2x 贵州修文县 me1
ME2005020801 2x 贵州盘县 me2
ME2005050601 2x 云南里县 me4
ME2005050401 2x 贵州荔波 me5
ME2005060501 2x 贵州雷公山 me6
ME2005101001 2x 贵州贵阳 me8
ME2005050602 2x 贵州罗甸 me9
ME2005050501 2x 贵州平塘 me10
ME2005100701 2x 四川泸州 me11
ME2005100301 2x 四川都江堰 me12
ME2005101002 2x 云南昆明西山 me14
ME2004042801 2x 贵州云台山 me15
ME2005101003 2x 贵州娄山关 me16
ME2005050301 2x 贵州茂兰 me17
ME2004050101 2x 贵州威宁 me18
PI2005050102 毛野荞 F.pilus 2x 西藏 pi1
PI2005101001 2x 西藏 pi2
PI2005101002 2x 西藏 pi3
CY2002062501 金荞 F.cymosum 4x 云南 cy
GI2003032001 巨野荞 F.giganteum 4x 人工合成 gi
UR2005101001 硬枝万年荞 F.urophylum 2x 云南大理 ur1
UR2005101002 2x 云南昆明西山 ur2
PL2006010301 F.pleioramosum 2x 四川叙永 pl
CA2006012201 F.calianthum 2x 四川汶川龙口 ca
GR2004100601 细野荞 F.gracilipes 4x 四川汶川福堂 gr1
GR2000101101 4x 贵州威宁 gr2
GR2004112802 4x 云南昆明西山 gr3
GR2004102903 4x 四川马尔康 gr4
表 3 RAPD随机引物序列及其在不同物种中的扩增谱带数
引物 序列 es ho zu ta me pi cy gi ur pl ca gr ∑
S57 TTTCCCACGG 3 1 8 3 22 4 3 4 4 5 3 5 35
S74 TGCGTGCTTG 12 10 13 14 19 13 10 10 7 4 10 5 41
S132 ACGGTACCAG 10 8 10 19 21 14 10 10 10 4 8 7 39
S388 AGCAGGTGGA 11 9 10 7 12 9 4 9 14 8 11 11 33
S446 CCACGGGAAG 8 8 16 24 23 14 15 14 8 12 13 13 47
S487 CCCCGATGGT 11 7 7 7 21 10 6 5 7 8 9 9 37
S1083 CCCACCCTTG 17 7 10 14 26 16 12 9 15 11 14 15 58
S1326 AGGCATCGTG 9 7 8 9 15 6 6 5 3 4 2 5 39
S1364 CCAGCCTCAG 9 6 6 9 14 9 8 6 9 10 7 10 40
S1519 AGCCTCGGTT 17 11 15 15 22 22 15 10 13 7 4 9 50
合计 419
平均 41.9
注:es包含栽培和野生甜荞 , ta包含栽培及野生苦荞。
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研究报告 任翠娟 等:荞麦属(FagopyrumMill)植物资源的 RAPD研究
图 1 引物 S1083扩增结果
注:M=Marker;NC=隐性对照;1, 2=me1;3, 4=me2;5, 6=me4;7, 8, 9=me5;10, 11=me6;12, 13, 14=me8;15, 16=me9;17, 18=me10;19,
20, 21=me11;22, 23, 24=me12;25, 26=me14;27, 28, 29=me15;30, 31, 32=me16;33, 34=me17;101, 102, 103=pi1;104, 105, 106=pi2;
107, 108=pi3;109, 110=pi4;111, 112, 113=cy;121, 122, 123=ho;132=zu;131, 141, 142, 143=gi;201=es1;202=es2;203=es3;204=es4;
205=es5;206=es6;207=es7;208=es8;209=es9;210=es10;211=we;301=ta1;302=ta2;303=ta3;304=ta4;305=ta5;306=ta6;307
=ta7;308=ta8;311=wt;401, 402=ur1;403=ur2;411, 412, 413=pl;431, 432=ca;441, 442, 443=gr1;451=gr2;461=gr3;471=gr4。
每个选定的引物均进行了 3次重复实验 ,结果较
为一致 ,表明这些引物在相同反应条件下 ,扩增是可以
重复的 。图 1为引物 S1083的 RAPD扩增图谱。
从表 3可看出 ,不同荞麦种类所产生的谱带数目
不同 ,其中以引物 S1083扩增大野荞的谱带数较多 ,
共记录 26条 ,引物 S57扩增 F.esculentumvar.homo-
tropicum的谱带数最少 ,记录 1条 。
根据全部引物扩增的数据统计结果 ,将种水平上
恒定的谱带作为该种的特征谱带 ,在种的水平上标记
大野荞 、毛野荞 、甜荞 、苦荞和 F.gracilipes的特征谱带
共 170条 ,建立其 RAPD指纹图谱 ,见图 2。
根据指纹图谱 ,可以统计出不同荞麦种指纹图谱
中的种内稳定谱带数 、不同于其他种类的特有谱带及
其数目见表 4。
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第 28卷 第 11期 2009年 11月 种 子 (Seed) Vol.28 No.11 Nov. 2009
图 2 大野荞(me)、毛野荞(pi)、甜荞(es)、苦荞(ta)和 F.gracilipes(gr)的 RAPD指纹图谱
表 4 5个荞麦种的稳定谱带数 、特有谱带及其数目
种 名 稳定谱带数 特有谱带数 特有谱带
F.esculentum 47 1 S1519-2290
F.tataricum 60 14 S57-1890;S57-1140;S57-610;S74-1700;S74-1440;S446-2280;S446-860;S446-500;S
1083-480;S1326-2100;S1326-1930;S1364-1820;S1519-1440;S1519-690
F.megaspartanium 17 1 S1364-670
F.pilus 50 1 S388-1425
F.gracilipes 52 0
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研究报告 任翠娟 等:荞麦属(FagopyrumMill)植物资源的 RAPD研究
表 5 5个荞麦种的种内种间多态性比较
物种
谱带
总数
(n)
种间多态
谱带数
(y)
种间多态
谱带比率
(RP2 =y/n)
种内多态谱带数(xi)及种内谱带总数(ni)
es
(x1 /n1)
ta
(x2 /n2)
me
(x3 /n3)
pi
(x4 /n4)
gr
(x5 /n5)
平均种内
多态谱带
比率(RP1)
S57 35 35 1.00 2 /3 4 /9 22/22 0 5/5 0.72
S74 36 36 1.00 6/12 9 /15 15/19 8/13 3/6 0.63
S132 37 36 0.97 5 /10 16 /19 19/21 5/14 5 /7 0.93
S388 30 29 0.97 3 /8 2 /5 9 /12 0 2 /4 0.50
S446 42 42 1.00 5 /9 13 /24 22/23 6/14 6/13 0.68
S487 32 32 1.00 7 /11 2 /8 20/21 4/10 2 /9 0.61
S1083 50 50 1.00 11 /17 6 /12 26/26 10/16 2 /14 0.60
S1326 30 30 1.00 4 /8 4 /8 15/15 4/6 1 / 6 0.44
S1364 34 34 1.00 8 /10 5 /9 9 /14 0 4 /10 0.60
S1519 43 43 1.00 9 /14 7 /15 22/22 9/22 8 /9 0.74
从表 4可看出:苦荞的稳定谱带最多 ,为 60条 ,其
次是 F.gracilips,为 52条 ,然后是毛野荞 、甜荞 、大野
荞 ,分别为 50条 、47条 、17条 。每个种类都有不同于
其他种类的特有谱带 ,其中以苦荞的独特谱带数最多 ,
大大超过其他荞麦种 ,暗示 DNA歧异最大 ,这些谱带
及其特征是鉴别荞麦属不同种类的依据。
2.2 荞麦属植物的种内种间多态性比较
供试材料 3个居群以上的荞麦物种有 5个 ,即甜
荞(es)、苦荞(ta)、大野荞(me)、毛野荞(pi)、细野荞
(gr),其居群数分别为 11、9、15、3、4 ,统计种内和种间
多态性谱带数 ,计算种间多态性比率 、平均种内多态性
比率 ,所得结果见表 5。
从表 5可看出 ,几乎所有谱带均表现种间多态性 ,
而且种间多态谱带比率明显大于种内多态谱带比率 ,
暗示荞麦属植物不同种间 DNA变异很大 ,利用 RAPD
可以非常容易地区分荞麦属种类。
2.3 荞麦属植物不同居群的遗传相似系数
10个 RAPD引物所扩增出的 491条带均用于计
算荞麦属 11种 50居群间的遗传相似系数(Gs)。结
果表明:所有居群的 Gs值变化范围为 0.58 ～ 0.99,平
均值为 0.73,绝大多数分布在 0.63 ～ 0.80的狭小范
围内 ,呈正态分布 ,暗示彼此间相似性程度较高 。其
中 , es3居群和 es4居群之间的 Gs最高 ,达 0.99,遗传
变异最小;pi1居群和 ur1居群之间的 Gs最低 , 为
0.58,暗示亲缘关系最远。
2.4 荞麦属植物居群的聚类分析
有带为 “1”,无带为 “0”,对所有 RAPD谱带进行
数字化 ,经 NTSYS-pc2.10软件分析 ,采用 UPGMA法 ,
进行系统聚类分析 ,所得聚类图见图 3。从聚类图上
可以看出:
(1)50份荞麦植物资源最后被聚为了两个大类
群:第一类群包含本实验所有小粒组种类 ,即 F.cali-
anthum、F.urophylum、F.gracilipes、F.pleioramosum;第
二大类群称包含本实验所有大粒组种类 ,即甜荞 、苦
荞 、野甜荞 、野苦荞 、大野荞 、毛野荞 、F.cymosum、F.es-
culentumvar.homotropicm、F.zuogongense、F.giganteum。
暗示这两个组间在 DNA水平上存在极大的遗传差异 。
(2)在甜荞种中栽培甜荞居群之间差异较小 ,它
们与野甜荞有较大的差异 ,与 F.esculentumvar.homo-
tropicum的差异相对最大。但是 ,它们都能与栽培甜
荞居群聚为 1类 ,说明彼此有相当的亲缘关系 。
(3)在苦荞种中 ,野苦荞与栽培苦荞居群之间亲
缘关系较近 ,均与野生苦荞有一定的差异 。
(4)在大野荞种类中 ,可以明显分为三类 ,即:黔
西南居群类 、威宁居群和其他地区居群类。威宁居群
与其它居群有相对大的差异。其它两类间也有一定差
异 ,表明种内居群间亲缘关系的远近和遗传分化与地
理分布 、地域扩散方向有一定的相关性。
(5)在小粒组中 , F.pleioramosum与 F.gracilipes
被首先聚为一类 ,暗示它们之间的亲缘关系很近 ,并与
其它小粒组种类 F.calianthum、F.urophylum、F.gra-
cilipes有一定差异 。
(6)当 T=0.75时 ,所有大野荞居群 、所有甜荞居
群(含栽培和野生甜荞和 Homo变种)、所有苦荞居群
(含栽培和野生苦荞)、所有 F.cymosum和毛野荞居
群 、所有小粒组种类均各自成为 1类群 ,较好地反映了
种内亲缘关系较近 、类群间亲缘关系较远 。
(7)当 T=0.70时 ,所有供试种类可以分为三类 ,
类 Ⅰ包括大野荞和甜荞等种类 ,类 Ⅱ包含毛野荞 、苦
荞 、金荞 、巨荞等种类 ,暗示它们之间有一定亲缘关系。
类 Ⅲ为所有小粒组种类 ,暗示小粒组与大粒组之间存
在很大的差异。
·42·
第 28卷 第 11期 2009年 11月 种 子 (Seed) Vol.28 No.11 Nov. 2009
图 3 荞麦属 RAPD系统聚类树型图
3 讨 论
3.1 引物选择和 RAPD指纹图谱
基于 PCR技术的分子标记中的关键环节是引物
选择。选择不同引物可能会导致完全相反的结果。大
多数的研究在引物选择上都是先进行预备实验 ,根据
是否能生产良好谱带和是否具有较多变异谱带(多态
性谱带)来判断。在实践中 ,常常是经验在主导 。没
有一个具体的判断标准。考虑到变异可分为种内变异
和种间变异 ,有的引物可能生产较多的种内变异谱带 ,
而另一些引物可能生产较多的种间变异谱带。它们各
自对于研究系统与进化的意义是很不同的 。我们认为
种间变异大的引物是较好的引物。因此本研究首次利
用统计各引物的种间变异谱带比率 (种间多态比率 ,
therateofinterspecificpolymorphismbands, PR2)和平
均种内变异比率(平均种内多态比率 , theaveragerate
ofintraspecificpolymorphismbands, PR1)来判断引物
的好坏 。种间多态比率比平均种内多态比率(PR2/
PR1)越大的引物是较好的引物 。以此为依据 ,本研究
从 200个随机引物中筛选出了 10个引物 ,获得了良好
的预期结果 。
目前 , RAPD技术在荞麦研究方面主要集中在栽
培荞麦的遗传多样性和种间系统关系上 [ 3, 19, 24] 。由于
荞麦属很多种类如多年生 F.cymosum复合物包含三
个种类 ,即大野荞 、毛野荞和四倍体 F.cymosum。它们
是非常相近的种类 ,在形态上不容易识别 ,在种类鉴别
上经常出现混乱和错误 [ 6 ～ 8] 。本研究首次建立了其
RAPD指纹图谱 ,同时发现每个种类都有很多恒定谱
带和独特谱带 ,可以有效地快速地用于荞麦种类鉴别 ,
这些结果对荞麦分类学研究有重要的指导意义 。
3.2 荞麦属植物种间系统关系
一直以来 ,荞麦属植物资源的系统关系研究争议
·43·
研究报告 任翠娟 等:荞麦属(FagopyrumMill)植物资源的 RAPD研究
很大[ 3, 5, 6, 8, 18, 19] 。归纳起来主要有三点:一是甜荞和苦
荞哪一个与 F.cymosum更近缘;二是苦荞与其他荞麦
野生种之间的亲缘关系;三是 F.gracilipes与其他野生
荞麦种之间的亲缘关系。本研究首次对所有大粒组荞
麦种类和一些小粒组荞麦种类利用 RAPD技术建立了
荞麦属植物资源系统关系聚类树 ,为荞麦种间系统关
系研究提供了新证据和新资料 。
大粒组和小粒组在 DNA水平上存在极大的遗传
差异 ,这与形态学 、花粉管长度研究[ 12, 13, 15] 、种间杂交
结果[ 6 ～ 8] 、RAPD研究结果 [ 3, 19, 23]一致。
Chen、Chenetal、Lietal、GuoandChen在细胞学 、
同功酶 、种子蛋白亚基 、种子蛋白含量变异水平等上发
现大野荞 、毛野荞分别与甜荞 、苦荞亲缘关系较
近 [ 6, 7, 8, 10, 14] 。本研究的结果支持这些结论 。
本研究中小粒组种类 F.pleioramosum和 F.gracil-
ipes表现出了很近的亲缘关系 ,这与 Hiroseetal的种
间杂交结果 [ 12, 13] 、Sharma＆ Jana的 RAPD结果[ 19]较
为一致 ,也符合形态分类学的观点[ 1, 5] 。
3.3 栽培荞麦的起源
国内外在栽培荞麦的起源问题上争议较大 ,焦点
主要集中在金荞和栽培荞麦的亲缘关系上 。形态学上
支持金荞(F.cymosumcomplex)和栽培甜荞近缘 ,是栽
培甜荞的祖先 [ 5, 9, 11, 21] 。而 Shevchuketal[ 20]的种子蛋
白免疫化学分析 、Ohnishi[ 17]的同工酶分析 、Adachiet
al[ 4]的叶绿体 DNA变异性研究 、Yasui＆Ohnishi[ 25]的
rbcL基因 DNA序列分析以及 Sharma＆ Jana[ 19] 的
RAPD研究则表明金荞(F.cymosumcomplex)和栽培
苦荞亲缘关系更近。 Chen[ 6 ～ 8]根据种间杂交 、细胞学 、
同功酶等研究结果将金荞(F.cymosumcomplex)划分
为三个物种 ,即二倍体大野荞(F.megaspatanium)、二
倍体毛野荞(F.pilus)、异源四倍体金荞(F.cymosum),
并提出大野荞和毛野荞分别是甜荞和苦荞的祖先种。
该假说已得到形态学 、繁殖生物学 、同功酶 、种子蛋白
亚基 、种子蛋白含量 、细胞学等研究的证实 [ 6 ～ 8, 10, 14] 。
本研究结果从 DNA遗传变异水平显示大野荞与甜荞
较近缘 ,毛野荞与苦荞较近缘 ,支持 Chen(1999a)的栽
培荞麦起源假说 。
参考文献:
[ 1]林汝法.中国荞麦 [ M] .北京:中国农业出版社 , 1994, 19 -
28.
[ 2]钟兴莲 , 姚自强 ,杨永宏 , 等.荞麦资源调查研究 [ J] .作物研
究 , 1994, 8(4):31-32.
[ 3]王莉花.利用 RAPD分析云南野生荞麦资源的多样性和亲
缘关系 [ J] .分子植物育种 , 2004, 2(6):807-815.
[ 4] AdachiT., MizushimaK., OguraK., KishimaY..Chloroplast
genomesofgenusFagopyrum.Ⅱ.Phylogeneticrelationshipa-
mongthemainthreespecies[ J] .Jpn.J.Breed.1992, 42(sup-
pl.1):272-273.
[ 5] CampbellCG.Buckwheat.In:SimmondsNW, ed[ M] .Evolu-
tionofcropplants.London:Longman.1976, 235-237.
[ 6] ChenQing-Fu.AstudyofresourceofFagopyrum(Polygonace-
ae)nativetoChina[ J] .BotanicalJournaloftheLinneanSocie-
ty, 1999, 130:53-64.
[ 7] ChenQing-Fu.HybridizationbetweenFagopyrum(Polygonace-
ae)speciesnativetoChina[ J] .BotanicalJournaloftheLinne-
anSociety, 1999, 131:177-185.
[ 8] ChenQing-Fu.AStudyofIsozyme, andInterspecificHybridiza-
tiononBig-AcheneGroupofBuckwheatSpecis(Fagopyrum,
Polygonaceae)[ J] .CropSciences, 2004, 44:1 511-1 518.
[ 9] Gross, H.RemarquessurlesPolygonéesdelAsieOrientale
[ J] .BuletindeGéographieBotanique, 1913, 23:7-32.
[ 10] GuoYu-Zhen, Qing-FuChen, Lan-YingYang, Yun-Hua
Huang.Analysesoftheseedproteincontentsonthecultivat-
edandwildbuckwheatresources[ J] .GeneticResourcesand
CropEvolution, 2007, 54(7):465-1 472.
[ 11] HedbergO.PolenmorphologyinthegenusPolygonumL.(s.
lat.)anditstaxonomicalsignificance[ J] .SvenskBotanisk
Tidskrift, 1946, 40:371-404.
[ 12] HiroseT., UjiharaA., KitayashiH., MinamiM..Interspecif-
iccross-compatibilityinFagopyrumaccordingtopolentube
growth[ J] .BreedingScience.1994, 44:307-314.
[ 13] HiroseT., UjiharaA., KitayashiH., MinamiM..Polentube
behavorrelatedtoselfincompatibilityininterspecificcrossesof
Fagopyrum[ J] .BreedingScience, 1995, 45:65-70.
[ 14] LiJH, QFChen, FJZeller, Variationinseedproteinsubunits
amongspeciesofthegenusFagopyrumMill[ J] .PlantSystem-
aticsandEvolution, 2008, 273:1-10.
[ 15] MinamiM., GomiM., UjiharaA..Polentubegrowthinin-
terspecificcrossesinFagopyrum[ J] .JournalofFacultyofAg-
ricultureinShinshuUniversity, 1992, 29:129-135.
[ 16] Nei, M.andW.H.Li.Mathematicsmodelforstudyinggenetic
variationintermsofrestrictionendonucleases[ J] .Processesc
NatlAcademyScience.1979, 76:5 269-5 273.
[ 17] OhnishiO.Isozymevariationincommonbuckwheat, F.escu-
lentumMoench, anditsrelatedspecies[ A] .Proc.2nd.Intl.
Symp.Buckwheat, 1983, 39-50.
[ 18] OhnishiO, MatsuokaY.Searchforthewildprogenitorof
buckwheatⅡ.TaxonoamyofFagopyrum (Polygonaceae)
speciesbasedonmorphology, isozymesandcpDNAvariability
[ J] .GenesandGeneticSystems, 1996, 71:383-380.
(下转第 48页)
·44·
第 28卷 第 11期 2009年 11月 种 子 (Seed) Vol.28 No.11 Nov. 2009
物材料 , cDNA-AFLP体系相对应的主要影响因素可能
有一定的差异。实验结果表明 ,甜瓜 cDNA-AFLP分析
体系相对比较容易建立。本实验中 , 只要提取的总
RNA完整性好 、纯度高 ,就能满足模板需要 ,而不必要
进行 mRNA纯化 ,这就大大降低了实验成本和操作难
度 。置换法合成双链 cDNA亦能满足实验要求 。在限
制性内切酶的选择中 ,比较了两对酶切组合 ,结果表
明 ,两种组合都可以适用于甜瓜的 cDNA-AFLP分析 ,
其中 EcoRⅠ 、 MseⅠ双酶组合操作简单 ,可以用一步
法进行双酶切及接头连接 , VspⅠ 、 TaqⅠ双酶组合操
作虽然较为复杂 , 但得到的 mRNA指纹图谱非常理
想 ,条带多 、分布均匀 、多态性较好 ,是用于甜瓜差异分
析的理想的酶切组合 。检测使用的是 8%的非变性聚
丙烯酰胺凝胶电泳和银染 ,效果良好 ,较多数文献中使
用变性胶而言更为方便 、简单 ,而且避免了剥离硅烷等
有毒试剂的使用 。
参考文献:
[ 1] BACHEMCW B, HEVENRSVD, BRUIJNZM, VREU
GDENHILLD, ZABEAUM, VISSERRGF, DEBSM.Visu-
alizationofdifferentialgeneexpressionusinganovelmethodof
RNAfingerprintingbasedonAFLP:analysisofgeneexpression
duringpotatotuberdevelopment[ J] .PlantJournal, 1996, 9
(6):745-753.
[ 2] BACHEMCWB, OOMENRJFJ, VISSERRGF.Transcript
imagingwithcDNA2 AFLP:astep-by-stepprotocol[ J] .
PlantMolecularBiologyReporter, 1998, 16(2):157-173.
[ 3] DONSONJ, FANGY, ESPIRITU2SANTOG.Comprehensive
geneexpressionanalysisbytranscriptprofiling[ J] .PlantMo-
lecularBiology, 2002, 48(2):75-97.
[ 4] KUHNE.Fromlibraryscreeningtomicroarraytechnology:
strategiestodeterminegeneexpressionprofilesandtoidentify
differentiallyregulatedgenesinplants[ J] .AnnalsofBotany,
2001, 87:139-155.
[ 5] COOKR, RAGNALM, LAUDIEM.Furtherprogresstowardsa
catalogueofArabidopsisgenes:analysisofasetof5000 non-
redundantEST[ J] .PlantJournal, 1996, 9(1):101-124.
[ 6] GILSONC, SOMERVILLEC.Isolatingplantgenes[ J] .T
rendsBiotechnology, 1993, 11(7):306-312.
[ 7]汤华 , 帅爱华 ,向福英.植物基因差异表达的研究方法及进
展 [ J] .海南大学学报 , 2006, 24(3)309-315.
[ 8]赵惠新 , 李冠 , 葛娟 , 等.甜瓜总 RNA快速提取 [ J] .种子 ,
2005, 24(5)43-45.
[ 9]赵惠新 , 李冠 ,李金玉 , 等.甜瓜抗病基因的研究进展及其应
用前景 [ J] .分子植物育种 , 2005, 3(2):249-254.
[ 10] GublerU., Aonetubereactionforthesynthesisofblunt-en-
deddouble-strandedcDNA[ J] .NucleicAcidRes., 1988,
(16):26-27.
[ 11] GublerU.andHoffmanB.J., Asimpleandveryeficient
methodforgeneratingcDNAlibraries[ J] .Gene, 1983, 25:
263-269.
[ 12] OkayamaH., andBergP., High-eficiencycloningoffull-
lengthcDNA[ J] .Mol.CellBiol., 1982, 2, 161-170.
[ 13] BejaiR., Sarosh·JohanMeijer.Transcriptionalprofilingby
cDNA-AFLPrevealsnovelinsightsduringmethyljasmonate,
woundingandinsectatackinBrassicanapus, PlantMolBiol,
2007, 64:425-438.
(上接第 44页)
[ 19] Sharma, T.R., andJanaS..SpeciesrelationshipsinFagopy-
rumrevealedbyPCR-basedDNAfingerprinting[ J] .Theoreti-
calandAppliedGenetics, 2002, 105(2-3):306-312.
[ 20] ShevchukT.E., GavrilyukI.P., KonarevV.G..Immuno-
chemicalanalysisoftheafinitiesofthegenusFagopyrumand
thespeciesofsomeothergeneraofthefamilyPolygonaceae
[ J] .БОТАНИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 1981, 66(2):259 -
267.
[ 21] StewardA.N..ThepolygonaceaeofEsternAsia.Contr[ J] .
Gray.Herd, .1930, 88:1-129.
[ 22] Suvorova, G.N., FunatsukiH., andTerami.F..Phylogenetic
relationshipsamongcultivars, species, andhybridsinthegenus
FagopyrumMill.assessedbyRAPDanalysis[ J] .Russian
JournalofGenetics, 1999, 35(12):1428-1432.
[ 23] Tsuji, K.andO.Ohnishi.OriginofcultivatedTartarybuck-
wheat(FagopyrumtataricumGaert.)revealedbyRAPDana-
lyses[ J] .GeneticResourcesandCropEvolution, 2000, 47:
431-438.
[ 24] Tsuji, K.andO.Ohnishi.PhylogeneticpositionofeastTibetan
naturalpopulationsinTartarybuckwheat(Fagopyrumtatari-
cumGaert.)revealedbyRAPDanalyses[ J] .GeneticRe-
sourcesandCropEvolution2001, 48(1):63-67.
[ 25] YasuiY., OhnishiO..ComparativestudyofrbcLgenese-
quencesinFagopyrumandrelatedtaxa[ J] .Genes＆Genetic
Systems, 1996, 71(4):219-224.
·48·
第 28卷 第 11期 2009年 11月 种 子 (Seed) Vol.28 No.11 Nov. 2009