全 文 ：果 树 学 报 2007,24(2):129～134
JournalofFruitScience
苹果属种质资源亲缘关系的SSR分析
高 源,刘凤之 *,曹玉芬,王 昆
(中国农业科学院果树研究所,辽宁兴城 125100)
摘 要:应用 SSR技术对 59份苹果属材料进行基因组的多态性分析,从 20对引物中筛选出 12对 SSR引物扩增出
176个等位基因,平均每个位点14.7个等位基因。位点杂合度为 0.4039～0.7412,遗传多样性指数为 0.6156。 用 3
对引物(CH02a04、CH02g04和CH01f03b)即可区分全部供试材料。NTSYS软件进行相似系数计算,UPGMA法聚类分
析将59份苹果属材料分为3大类群,即栽培品种、地方品种和新疆的野生苹果、野生种或其变种。栽培品种中具有
相同亲本起源的品种被紧密地聚到了一起,相似系数较高;地方品种与新疆的野生苹果的聚类相互交错,呈现出新
疆的野生苹果作为东亚基因中心的起源种与中国各地方品种在起源演化上的相关性;各野生种及其变种类型均聚
到了一起,与传统的系谱基本一致。
关键词:苹果属;种质资源;亲缘关系;SSR
中图分类号:S661.1 文献标识码:A 文章编号:1009-9980(2007)02-129-06
AnalysisofgeneticrelationshipforMalusgermplasmresourcesbySSR
markers
GAOYuan,LIUFeng-zhi*,CAOYu-fen,WANGKun
(ResearchInstituteofPomology,CAAS,Xingcheng,Liaoning125100China)
Abstract:Genomicpolymorphismof59MalusmaterialswasanalyzedbyusingSSRmarkers.12pairsofSSRprimersselected
from20pairsamplified176aleles,withanaverageof9.5alelesperlocus.Locusheterozygositywas0.4039to0.7412,
andthegeneticdiversityindexwas0.6156.Threepairsofprimers(CHO2a04,CHO2g04andCH01f03b)coulddistinguish
aloftheMalusmaterials.BasedontheSSRresults,thesimilaritycoeficientwascalculatedbyusingNTSYSsoftware,and
alsoUPGMAclusteranalysisshowedthatalMalusmaterialscouldbeclassifiedintothreegroups.Thosearethecultivars,
regionalspeciesandwildapplespeciesinXinjiangAutonomousRegion,togetherwithwildapplespeciesortheirvarieties.
Thecultivarswiththesameoriginofparentageclusteredtogether,andthesimilaritycoeficientbetweeneachotherwashigh.
TheclusteringofregionalspeciesandwildapplespeciesinXinjiangintersectedeachother.Thisindicatedthatasthegenesis
ofgenecenterinEastAsiawildapplespeciesinXinjiangoriginatedandevolvedcorelativelywithregionalspeciesinChina.
Finalyalthewildapplespeciesandtheirvarietiesclusteredtogether,similarlytothetraditionalclassification.
Keywords:Malus;Germplasmresources;Geneticrelationship;SSR
收稿日期:2006-11-08 接受日期:2007-01-23
作者简介:高源,女,硕士。Tel:0429-5111619,E-mail:anglebaby2004@163.com
>通讯作者。Authorforcorespondence.Tel:0429-5111602,E-mail:apgr@vip.163.com
苹果属(MalusMil.)种质资源丰富,品种类型多
样,包括大量的野生种、半野生种及栽培品种。中国
是世界苹果属植物最大的基因中心,有17种苹果属
植物起源于中国并在中国仍有分布[1]。苹果的各类
种质,如野生、半野生、栽培品种以及抗源材料十分
丰富,在研究苹果的起源及种质资源亲缘演化等方
面居重要地位。SSR具有标记稳定性好,如多态性
高、引物特异性强等特点,已被应用于国内外苹果研
究的许多方面[2-7]。我们用SSR方法分析苹果属种质
资源的遗传背景和亲缘关系,从分子水平研究苹果
属植物的遗传分类,同时对以往从形态学、细胞学、
孢粉学、同工酶等方面研究苹果亲缘演化关系的结
果和已知苹果种质资源的系谱进行验证,为苹果属
植物新的分类系统提供分子水平的证据。
1 材料和方法
供试的59份苹果属材料均取自辽宁兴城中国
农业科学院果树研究所国家苹果种质资源圃,分别
为栽培品种、新疆的野生苹果、地方品种、野生种或
其变种(表1)。
春季以嫩叶为材料,按照Doyle等[8]、邹喻苹等[9]
报道的CTAB法提取和纯化苹果基因组DNA。提取
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2007.02.001
果 树 学 报 24卷
编号
Code
材料名称
Materialname
学名
Bookname
原产地和/或亲本
Parentageandorigin
1
2
3
4
5
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8
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47
48
49
50
51
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53
54
55
56
57
58
59
黄魁YelowTransparent
贝拉VistaBela
津轻Tsugaru
君袖NorthernSpy.Spy
旭McIntosh.
金冠GoldDelicious
元帅Delicious
嘎拉Gala
祥玉WinterBanana
红玉Jonathan
乔纳金Jonagold
倭锦BenDavis
紫香蕉BlackGiliflower
澳洲青苹GrannySmith
东光Toko
大国光Rals
富士Fuji
新疆野苹果Xinjiangyepingguo
新疆红肉苹果Xinjianghongroupingguo
克孜阿尔玛Keziaerma
冬白果Dongbaiguo
阿留斯坦Aliusitan
中熟红果子Zhongshouhongguozi
吉尔吉斯苹果Jierjisipingguo
柠檬海棠Ningmenghaitang
霍城白果子Huochengbaiguozi
白海棠Baihaitang
矮花红Aihuahong
大香果Daxiangguo
牛妈妈海棠Niumamahaitang
楸子Qiuzi
绵苹果Mianpingguo
中国彩苹Zhongguocaiping
黄甜果Huangtianguo
香果Xiangguo
金沙依拉姆Jinshayilamu
崂山柰子Laoshannaizi
花红Huahong
大鲜果Daxianguo
槟子Binzi
扎矮山定子Zhaaishanjingzi
平邑甜茶Pingyitiancha
褐海棠Hehaitang
卢氏三叶海棠Lushisanyehaitang
山定子Shanjingzi
兴山湖北海棠Xingshanhubeihaitang
维西三叶Weixisanye
雅江变叶海棠Yajingbianyehaitang
小金变叶Xiaojinbianye
吉林小黄海棠Jilinxiaohuanghaitang
八楞海棠Balenghaitang
朱眉海棠Zhumeihaitang
陇东海棠Longdonghaitang
林芝海棠Linzhihaitang
德钦海棠Deqinhaitang
西府海棠Xifuhaitang
垂丝海棠Chuisihaitang
毛山定子Maoshanjingzi
丽江山定子Lijiangshanjingzi
M.domesticaBorkh.
M.domesticaBorkh.
M.domesticaBorkh.
M.domesticaBorkh.
M.domesticaBorkh.
M.domesticaBorkh.
M.domesticaBorkh.
M.domesticaBorkh.
M.domesticaBorkh.
M.domesticaBorkh.
M.domesticaBorkh.
M.domesticaBorkh.
M.domesticaBorkh.
M.domesticaBorkh.
M.domesticaBorkh.
M.domesticaBorkh.
M.domesticaBorkh.
M.sieversi(Ledeb.)Roemer.
M.pumilaMil.
M.pumilaMil.
M.sieversi(Ledeb.)Roemer
M.pumilaMil.
M.sieversi(Ledeb.)Roemer
M.sieversi(Ledeb.)Roemer
M.prunifoliaMil.
M.sieversi(Ledeb.)Roemer
M.sieversi(Ledeb.)Roemer
M.prunifolia(Wild.)Borkh.
M.domesticaMil.
M.prunifolia(Wild.)Borkh.
M.prunifolia(Wild.)Borkh.
M.domesticaBorkh.
M.domesticaBorkh.
M.domesticaBorkh.
M.domesticaBorkh.
M.domesticaBorkh.
M.domesticaBorkh.
M.prunifolia(Wild.)Borkh.
M.prunifolia(Wild.)Borkh.
M.domesticassp.chinensis
M.baccata(Linn.)Borkh.
M.hupehensis(Pamp.)Rehd.
M.fusca(Raf.)Schneid.
M.sieboldi(Regel.)Rehd.
M.baccata(L.)Borkh
M.hupehensis(Pamp.)Rehd.
M.sieboldi(Regel.)Rehd.
M.toringoides(Rehd.)Hughes.
M.toringoides(Rehd.)Hughes.
M.prunifolia(Wild.)Borkh.
M.robusta(Car.)Rehd.
M.zumi(Mats.)Rehd.
M.kansuensis(Batal.)Schneid.
M.sikkimensis(Wenzig)Koehne.
M.sikkimensis(Wenzig)Koehne.
M.micromalusMakino
M.halianaKoehne
M.manshurica(Maxim.)Komarov
M.rockiSchneid.
俄罗斯Russia,不详Unknown
美国 America,77349×乔纳红77349×Jonared
日本 Japan, 金冠×不详GoldenDelicious×Unknown
美国 America,偶然实生Occurentseedling
加拿大Canada,偶然实生Occurentseedling
美国 America,偶然实生Occurentseedling
美国 America,偶然实生Occurentseedling
新西兰NewZealand,
(元帅×橘苹)×金冠(Delicious×Kidd’sOrangeRed)×GoldenDeli
美国America,偶然实生Occurentseedling
美国America,可口香(EsopusSpitzenburg)实生Seeding
美国America,金冠×红玉GoldenDelicious×Jonathan
不详Unknown,不详Unknown
不详Unknown
澳大利亚Australia,不详Unknown
日本Japan,金冠×印度GoldenDelicious×Indo
不详Unknown,不详Unknown
日本Japan,国光×元帅Rals×Delicious
中国新疆Xinjiang,China
中国新疆Xinjiang,China
中国新疆Xinjiang,China
中国新疆Xinjiang,China
中国新疆Xinjiang,China
中国新疆Xinjiang,China
中国新疆Xinjiang,China
中国新疆Xinjiang,China
中国新疆Xinjiang,China
中国河北Hebei,China
中国西北NorthwestofChina
中国河北Hebei,China
中国河北Hebei,China
中国China
中国China
中国China
中国China
中国西北NorthwestofChina
中国新疆Xinjiang,China
中国山东Shandong,China
中国西北NorthwestofChina
美国America
中国China
中国内蒙古扎兰屯ZhalantuninInnerMongoliaofChina
中国山东平邑PingyiinShandongofChina
北美NorthAmerica
中国江西Jiangxi,China
中国东北NortheastofChina
中国湖北Hubei,China
中国云南Yunnan,China
中国四川Sichuan,China
中国四川Sichuan,China
中国吉林Jilin,China
中国河北Hebe,China
日本Japan
中国湖北Hubei,China
中国西藏Tibet,China
中国云南Yunnan,China
中国江西Jiangxi,China
中国江苏Jiangsu,China
中国东北NortheastofChina
中国云南Yunnan,China
表1 供试苹果属种质资源材料
Table1MalusgermplasmresourcesforSSRanalysis
注:1～17为栽培品种,18～26为新疆的野苹果,27～38和40为地方品种,41～59为野生种或野生种的变种。
Note:1~17arecultivars,18~26arewildapplespeciesinXinjiangprovince,27~38and40areregionalspecies,41~59arewildapplespeciesortheir
variation.
130
2期
表2 12对SSR引物对59份苹果属材料的扩增结果
Table2Amplifiedresultsof59Malusmaterials
with10SSRprimers
引物
Primer
退火温度
Annealing
temperature(℃)
等位基因数
No.ofaleles
位点杂合度
Locusheterozygosity
CH01f03b
CH02b121
CH03d07
CH02a04
CH05b06
CH05d04
MS06g03
CH04a12
CH04h02
CH05c06
CH05d08
CH02g04
平均值
Average
61
59
60
60
64
60
55
57～52
58～53
60～55
58～53
58～53
13.0
17.0
14.0
18.0
15.0
14.0
16.0
11.0
18.0
17.0
10.0
13.0
14.7
0.5274
0.6754
0.6966
0.7090
0.6369
0.5731
0.6018
0.4039
0.7133
0.6808
0.4272
0.7412
0.6156
图1 引物CH01f03b对59份苹果材料扩增电泳图
编号见表1,下同。M:pBR322DNA/MSP1Markers
Fig.1AmplificationofprimerCH01f03bin59applematerials
ThesamecodeNo.asinTable1.Thesamebelow.M:pBR322DNA/MSP1Markers
DNA质量经0.7%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光
度计检验合格后,将 DNA的质量浓度稀释到 20
ng/μL保存备用。SSR引物按Liebhard等[10]报道的序
列由上海Sangon公司合成。由20对引物筛选出稳
定性强、多态性好、分辨率高的 12对引物进行正式
实验,引物扩增的退火温度经过筛选实验获得。
SSR反应条件经优化确定为:20μL反应体系
含20～40ng基因组DNA,Tris-HCl10mmol/L(25℃,
pH9.0),KCl50mmol/L,MgCL21.5mmol/L,dNTP0.2
mmol/L,引物0.5μmol/L,Tag聚合酶1U。PCR扩增
反应在美国PE公司生产的PTC-100基因扩增仪上
进行。扩增程序为 94℃预变性 4min;94℃变性
30s,60～55℃退火 1min,72℃延伸 1min,35个循
环;72℃延伸10min;4℃保存。而有的引物需要采
用降落 PCR进行扩增,扩增程序为 94℃预变性
4min;94℃变性 1min,60～58℃退火 1min,72℃
1min,10个循环,其中每个循环降 0.5℃;94℃
1min,降落至最后的温度退火 1min,72℃延伸
1min,30个循环;72℃延伸 10min;4℃保存。扩
增产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染检测[11]。
每对SSR引物检测1个位点,电泳图谱的每条
多态性带均为一个分子标记,代表引物结合位点的
1个等位基因。根据条带的有无统计所有二元数据,
有带记为1,无带记为0。根据二元数据计算位点的
杂合度h=1-∑Xi2,其中xi表示第i个等位基因的频
率,遗传多样性指数 H=∑h/n,n为检测位点的总
数。用NYSYS-pc2.10e统计分析软件对数据进行分
析,按 Jaccard公式计算品种间的相似系数,以非加
权类平均法(UPGMA)进行聚类分析并建立树状图。
2 结果与分析
2.1 引物筛选与SSR多态性
利用筛选出的12对引物对59份苹果材料进行
扩增,获得176个等位基因。不同引物扩增的等位基
因数10～18个不等,平均每个位点14.7个等位基因
(图1)。位点杂合度为0.4039～0.7412,遗传多样性
指数为0.6156(表2)。引物对CH02a04和CH04h02
在供试的59份苹果材料中扩增等位基因数均达18
个,分别可以区分其中的44份和40份材料;用3对
SSR引物,即CH02a04、CH02g04和 CH01f03b,可将
供试的59份苹果材料区分开。
2.2 聚类分析
根据 12对引物的扩增数据计算相似系数并进
行聚类 (图 2)。59份材料的相似系数为 0.7226～
0.9935,平均值为0.8070。59份材料均能分开,在相
似系数为0.803处可以分为3个类群,与起源演化
相关。类群Ⅰ包括全部的野生种,这些品种在起源上
都比较原始;类群Ⅱ包括全部供试的新疆的野生苹
果和11个地方品种,这2个类群的品种聚在一起,
说明了新疆的野生苹果与地方品种的亲缘关系较
近,起源相对较早的新疆的野生苹果与地方品种有
一定的演化顺序关系;类群Ⅲ由全部供试的栽培品
高 源等:苹果属种质资源亲缘关系的SSR分析 131
果 树 学 报 24卷
图2 苹果供试材料的聚类分析树状图
1～59材料名称同表1。
Fig.2DendrogramofapplematerialsbasedonSSRdata
Nameof1～59sameasTable1.
种以及 2个地方品种牛妈妈海棠和崂山柰子组成
的,同属欧亚苹果组的全部栽培品种聚在一起说明
它们都具有较近的血缘,与传统的系谱基本一致,而
本属于地方品种的崂山柰子和牛妈妈海棠则可能在
起源上更接近于栽培品种。
聚类的结果与传统系谱也存在差别。例如:富士
0.940.89 0.990.840.79
1
9
4
8
17
10
14
12
7
3
6
11
15
16
2
5
30
13
37
18
24
39
20
21
28
35
40
22
36
27
19
29
31
32
23
25
26
33
34
38
44
47
53
54
42
46
57
41
58
51
59
45
52
43
50
48
55
49
56
和国光、嘎拉和金冠没有紧密地聚到一起。这原因可
能有三:一是由共同亲本所带来的相似性远超过其
他因素的作用;二是苹果的高度杂合导致亲缘关系
较近的品种间产生复杂的遗传多样性;三是检测位
点不足,所检测位点不能够充分反映其间的亲缘关
系,导致系谱的偏离。这与王爱德等[12]的研究结果相
一致。
3 讨 论
本实验中具有亲本血缘的栽培品种被紧密的聚
在一起,并且具有相同亲本起源的品种相似系数也
较高,体现出它们之间的较近亲缘关系。例如:嘎拉
[(元帅×橘苹)×金冠]和富士(国光×元帅)、乔纳金
(金冠×红玉)和东光(金冠×印度)、津轻(金冠×红
玉)和金冠相似系数分别达到 0.8903、0.9161和
0.9226。此外,未紧密聚到一起但是具有相同亲本的
品种也具有较高的相似系数。例如:嘎拉和乔纳金、
嘎拉和东光、嘎拉和津轻、乔纳金和津轻的相似系数
分别达到0.8839、0.8645、0.8710、0.8968。津轻与
母本金冠聚在一起,说明其更多地遗传了来自于母
本的遗传因素。而乔纳金与亲本金冠相似系数
0.9097远高于与亲本红玉的相似系数0.8581,证明
其也是更多遗传了金冠的遗传物质,这与 Harada
等[13]经 RAPD分析得出由金冠提供 2n配子的研究
结果相一致。
作为世界上最大的苹果属植物的起源中心之
一,新疆的野生苹果具有极其重要的地位。在聚类图
中新疆的野生苹果品种与地方品种的聚类相互交
相似系数Coeficient
132
2期
错,体现了新疆的野生苹果在起源上的重要位置,及
其与地方品种之间的密切关系。新疆野苹果与其亚
种吉尔吉斯苹果和其变型新疆红肉苹果的相似系数
分别为0.9613和0.8065,可见新疆野苹果与吉尔
吉斯苹果具有更近的亲缘关系,起源较早。绵苹果与
其变种楸子以相似系数 0.9097紧密地聚在一起,2
者又与新疆野苹果的变型新疆红肉苹果聚在了一
起,与李育农[14]的绵苹果起源于塞威士苹果(新疆野
苹果)结论相一致。中国彩苹与黄甜果相似系数达到
了0.9935,而它们实际分别属于绵苹果品种群和白
沙果品种群,但是据古文献和近代有关核学和酶学
的分析,绵苹果与沙果较为近的观点[15],这种结果又
是正确的。2者的亲缘关系还需进一步的验证。花红
与中国彩苹紧密的聚在了一起,表明由于历史上中
国花红与绵苹果具有相同适应的范围[15]而存在起源
相关的可能性。此外,花红与楸子的相似系数为
0.8194,更证明了其近缘性,这与俞德浚[16]的研究结
果以及李晓林[17]的酯酶同工酶酶谱分析结果相一
致。槟子是绵苹果系的多型性种类之一,它与绵苹果
的相似系数为0.8065;而香果虽与绵苹果的性状较
为相近,2者的相似系数为0.7871,槟子比香果具有
更早的起源。但是香果却与槟子聚在一起,说明香果
与槟子比绵苹果具有更近的亲缘关系,可能香果的
起源过程中掺入了槟子的基因,这与前人[18]的推断
是一致的。
野生苹果的历史久远,要研究其起源演化比较
复杂,并且即使是同一种内也因地理位置的不同而
出现许多变种和变型。三叶海棠的2个地方类型维
西三叶和卢氏三叶海棠、湖北海棠的2个变种兴山
湖北海棠和平邑甜茶、变叶海棠的2个地方类型小
金变叶和雅江变叶海棠被分别聚到了一起,相似系
数分别为0.8387、0.8452和0.8710。而变叶海棠的
2个变种与垂丝海棠和湖北海棠的变种聚在一起,
亲缘较近,证实了垂丝海棠近似湖北海棠的说法[18]。
李育农[19]新的苹果属植物分类体系中山定子组山定
子系的品种,山定子与其亚种毛山定子、地理亚种丽
江山定子和地方类型扎矮山定子被聚到一起,表明
它们较近的亲缘关系和在起源上的相关性。同时,垂
丝海棠、湖北海棠和山定子系同属于山定子组,这也
解释了垂丝海棠、湖北海棠变种和山定子系的品种
均聚到一起的结果。西府海棠与其亲本之一山定子
的相似系数是0.8129,而八楞海棠则与山定子、丽
江山定子、毛山定子和扎矮山定子聚在了一起,表明
了西府海棠与八楞海棠较近的亲缘关系。这与八楞
海棠与西府海棠较为接近[20]的观点相一致。
变叶海棠的归属一直存在争议。Wiliams[21]根据
类黄酮检测的结果,认为变叶海棠更接近于山定
子。而Rehder[22]按照形态特征的相似性,将它列入陇
东海棠系中。成明昊等[23-24]的研究表明,变叶海棠与
陇东海棠和花叶海棠表现为地理亲缘和地理替代,
是介于后2者之间的种群,并且易与陇东海棠渗入
杂交产生与陇东海棠分类界限模糊的杂种群体,例
如:马尔康海棠经研究应归属于陇东海棠系,但同时
指出变叶海棠是否为2者的杂交种有待于进一步研
究。本实验中的变叶海棠的2个变种雅江变叶海棠
和小金变叶与山定子组供试的6个品种的相似系数
平均值分别为0.8268和0.8011,而与陇东海棠的相
似系数分别为0.8194和0.7806。因此,实验结果比
较支持 Wiliams[21]的观点,并且根据实验结果变叶
海棠归属于山定子组比较合适。但是根据李育农[19]
的最新苹果属植物分类新体系,变叶海棠也归属于
陇东海棠系。这可能是供试的陇东海棠系的品种较
少,不足以说明变叶海棠与陇东海棠系之间的亲缘
关系的缘故,其间的亲缘关系有待进一步研究。
4 结 论
本研究用 SSR的方法,通过实验将供试的 59
份苹果属种质资源材料分为3大类群,与起源演化
相关。并且,得出苹果属种质资源按照从野生到半野
生再到栽培品种,以及新疆的野生苹果作为东亚基
因中心的起源种逐步演化到中国各地方品种的基本
的演化顺序,与传统的结论和系谱基本一致。SSR标
记稳定性好、多态性高、引物特异性强,比较适合于
苹果属种质资源亲缘演化关系和遗传多样性的研
究。但是,SSR引物开发比较困难,代价比较高。而且
虽然苹果引物已经开发出来很多,但是目前仍然缺
乏对不同的种质资源类型具有针对性的引物,尤其
是野生种质资源,有待于加强引物开发的力度。同时
需再进一步增加研究品种和扩大研究范围,以期为
苹果种质资源的亲缘演化关系、遗传多样性和分类
地位的研究,以及品种鉴别提供更多的分子依据。
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果 树 学 报 24卷134