全 文 ：中国农业科学 2013,46(13):2717-2729
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.13.010

收稿日期：2013-01-07；接受日期：2013-05-06
基金项目：国家自然科学基金项目（31071769）、重庆市自然科学基金项目（cstc2012jjA0725）、西南大学科研基金项目（XDJK2012C072）
联系方式：唐亮，Tel：023-68251047；E-mail：ecologytang@yahoo.com.cn。通信作者周志钦，Tel：023-68250229；E-mail：zzqswu@yahoo.com


苹果属 S-RNase 基因的进化研究
唐 亮 1,2，马 香 1,2，李明霞 2，周志钦 1,2
（1西南大学南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆 400715；2西南大学园艺园林学院，重庆 400716）

摘要：【目的】通过分析苹果属植物自交不亲合性位点 S-RNase 基因的序列，研究 S-RNase 基因在苹果属的
进化历史，序列分歧特点和遗传多态性。【方法】利用栽培苹果的 S-RNase 基因序列在 GenBank 数据库中检索和鉴
定所有已知的苹果属植物的 S-RNase 基因，同时利用 S-RNase 基因的保守引物获得陇东海棠和变叶海棠的 S-RNase
基因序列。通过系统发育分析研究 S-RNase 基因的进化历史，进而计算 dN/dS 比值揭示 S-RNase 基因序列分歧的
特点，最后估计并比较苹果属不同类群 S-RNase 基因的遗传多态性及其遗传分化。【结果】苹果属植物的 S-RNase
基因可以分为16个亚类，同一亚类S-RNase基因的序列分歧较小，亚类之间的分歧很大。S-RNase基因的成对dN/dS
比值中有 50%的大于 1，并且滑动窗分析显示 S-RNase 基因具有多个 dN/dS 比值显著大于 1的区域。栽培苹果和野
生苹果在 S-RNase 基因的遗传多态性上没有明显差异。在所涉及的苹果属野生类群中，栽培苹果与塞威士苹果在
S-RNase 基因上的遗传分化最小。【结论】适应性氨基酸替换在苹果属植物 S-RNase 基因的序列分歧上发挥了重要
作用。现有的 S-RNase 基因数据显示栽培驯化没有导致栽培苹果 S-RNase 基因遗传多态性的降低，基于 S-RNase
基因的遗传分化支持栽培苹果是由塞威士苹果驯化而来的观点。
关键词：苹果属；S-RNase 基因；进化历史；序列分歧；遗传多态性

Evolutionary Studies of S-RNase Genes in Genus Malus
TANG Liang1,2, MA Xiang1,2, LI Ming-xia2, ZHOU Zhi-qin1,2
(1Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions，Ministry of Education, Southwest University,
Chongqing 400715; 2College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400716)

Abstract: 【Objective】By analyzing the sequences of S-RNase gene at the self-incompatibility loci, its evolutionary history,
sequence divergence and genetic polymorphism were studied for species belonged to genus Malus. 【Method】All of the Malus
S-RNase genes were retrieved from GenBank by NCBI BLAST using the known S-RNase genes of Malus domestica, except four
S-RNase genes of M. kansuensis and M. toringoides which were obtained by PCR amplification and clone sequencing. The
evolutionary history of the Malus S-RNase genes was studied by phylogenetic analysis, and the characteristics of sequence
divergence were analyzed. The genetic polymorphisms and divergence were estimated for different taxa of Malus.【Result】The
S-RNase genes of Malus can be divided into 16 clearly delimitated subgroups, the divergence of S-RNase genes within subgroups
was low, while it was high among subgroups. There were 50% dN/dS estimations that were greater than 1 among S-RNase gene pairs,
and S-RNase genes possessed multiple codons of which dN/dS ratio was greater than 1. There was no difference in the genetic
polymorphism between M. domestica and wild Malus species, and the closet taxa with M. domestica was M. sieversii based on
divergence of S-RNase gene.【Conclusion】Adaptive amino acid substitutions play an important role in the sequence divergence of
S-RNase in Malus. According to the analysis of S-RNase genes belonging to Malus, it was found that the genetic polymorphism of M.
domestica has not been affected by cultivation, and M. domestica was derived from M. sieversii through human domestication.
Key words: Malus; S-RNAse gene; evolutionary history; sequence divergence; genetic polymorphism
2718 中 国 农 业 科 学 46卷
0 引言
【研究意义】蔷薇科植物配子体自交不亲和性
（gametophytic self-incompatibility，GSI）的雌蕊特异
性由 S-RNase 基因决定，它编码的 S-RNase 属于 T2
类型核糖核酸酶，在花柱中表达。当花粉 S基因（决
定花粉特异性）与花柱 S-RNase基因中的任意一个具
有相同特异性时，花粉在花柱中的生长将被抑制，从
而避免了自交或者相同 S基因型（S genotype）之间
的交配，促进植物异交和种内遗传多样性的产生及维
持[1-3]。由于 S-RNase基因控制植物的受精繁殖，因此
在种间杂交和生殖隔离上发挥着重要作用，是研究物
种分化的重要基因位点[4-6]。【前人研究进展】苹果属
植物 S-RNase 基因的研究多集中在栽培苹果 S-RNase
基因的测定和 S 基因型的鉴定上[7-15]。这些研究不仅
克隆了常见栽培苹果品种的 S-RNase基因，并且发展
了一套基于 S-RNase基因特异性 PCR的 S基因型快
速鉴定方法[16]。少数研究工作分析了野生苹果的 S
基因型，并且测定了苹果属野生物种的 S-RNase 基
因，构建了部分野生苹果 S-RNase基因的系统发育关
系[17]。针对 S-RNase基因的序列和 S基因型的研究不
但丰富了对配子体自交不亲合性的理解，而且在苹果
的生产栽培和品种选育上也有重要指导意义。栽培苹
果的基因组序列清楚地显示 S-RNase 基因由 17 号染
色体正链上的单个位点编码（MDP0000345854）。【本
研究切入点】目前，关于苹果属植物 S-RNase基因的
进化研究还很少，对 S-RNase基因在苹果属植物中的
进化历史、序列分化的水平和特点，以及遗传多态性
尚缺乏细致深入的分析和了解。【拟解决的关键问题】
本研究通过查询 GenBank 数据库和 PCR 扩增及克隆
测序的方法共获得 90条独特的苹果属植物的S-RNase
基因序列。采用分子系统发育分析，dN/dS比值计算，
以及遗传分化和遗传多态性估计，分析 S-RNase基因
的进化历史，研究其进化特性，并且比较栽培苹果与
野生苹果在 S-RNase位点上遗传多态性水平的高低和
遗传分化的大小。
1 材料与方法
1.1 检索和鉴定 GenBank 数据库中的苹果属植物
S-RNase 基因
将栽培苹果的 S-RNase基因作为查询序列，利用
NCBI 的 BLAST 工具[18]，在 GenBank 数据库中查找
并鉴定所有已知的苹果属植物 S-RNase基因。BLAST
程序使用默认参数设置，对 BLAST 的查询结果，进
一步检查GenBank的注释文件以确保挑选的结果准确
无误。
1.2 陇东海棠和变叶海棠 S-RNase 基因的获取
2011年 6月在四川省阿坝自治州采集陇东海棠和
变叶海棠的叶片，经硅胶干燥后带回西南大学，采用
CTAB 法提取样品的基因组 DNA[19]。基于 S-RNase
保守序列设计的 PCR引物[20]，扩增陇东海棠和变叶海
棠的 S-RNase基因。PCR反应体系为 25 µL，包括 2.5
µL 10× Ex Taq缓冲液，10—50 ng的基因组 DNA，
2.0 mmol·L-1的MgCl2，0.2 mmol·L-1的每种 dNTP，0.1
µmol·L-1的上下游引物，1.0 U 的 Ex Taq酶。扩增程
序：94℃预变性 1 min，然后 94℃变性 30 s，48℃退
火 30 s，72℃延伸 1 min，30个循环，最后 72℃延伸
7 min。扩增产物克隆至质粒载体，每个个体分别挑选
5—7个克隆进行测序，共获得 4条新的 S-RNase基因
序列。通过与已知 S-RNase基因的 CDS序列比较，确
定新获得的 S-RNase基因的 CDS序列。
1.3 数据分析
1.3.1 构建S-RNase基因CDS序列的密码子比对 采
用MEGA5.10程序中的密码子比对选项构建 S-RNase
基因 CDS序列的密码子比对[21]。然后仔细检查自动比
对的结果，手工调整同源性排列不恰当的部分。
1.3.2 S-RNase 基因的系统发育分析 采用距离法
和最大似然法构建苹果属植物 S-RNase基因的系统发
育树。遗传距离由 MEGA5.10 程序的 Kimura 两参数
模型估算[22]，然后使用 Neighbor-joining（NJ）算法构
建反映 S-RNase 基因进化历史的 NJ 树[23]。S-RNase
基因的最大似然树通过 PHYML程序推断[24]，最优核
苷酸替换模型根据Modeltest 3.7程序选出[25]。NJ树和
最大似然树的可靠性由 100次自展分析进行评价。
1.3.3 分析 S-RNase 基因之间的序列分歧 采用
Kimura两参数（K2P）模型和 Nei-Gojobori方法计算
苹果属植物 S-RNase基因的成对序列分化[26]。Kimura
两参数模型计算的是两条序列之间总的遗传分化，
Nei-Gojobori 方法能够对同义替换和非同义替换分别
加以计算。所有序列分歧均采用MEGA5.10程序计算。
为了探究影响 S-RNase基因序列分歧的进化因子，根
据 Nei-Gojobori 方法得出的同义和非同义替换计算苹
果属植物 S-RNase基因的成对 dN/dS比值。同时使用
JCoDA程序的滑动窗（sliding window）方法分析dN/dS
比值在 S-RNase基因序列上的变化情况[27]。选择窗口
的长度为 10个密码子，每次移动 5个密码子，依次计
13期 唐亮等：苹果属 S-RNase基因的进化研究 2719
算每个窗口中 10个密码子的 dN/dS比值，并将 dN/dS
比值对整条序列作图。
1.3.4 计算苹果属不同类群 S-RNase 基因的遗传多
态性和遗传分化 采用DNASP V5程序计算遗传多态
性水平和遗传分化[28]。使用 π 和 θ 两个指标度量
S-RNase 基因的遗传多态性。不同类群之间的遗传分
化采用 3种度量指标，即：考虑所有的碱基替换、只
考虑密码子同义替换和只考虑密码子非同义替换。
2 结果
2.1 苹果属植物 S-RNase 基因序列的收集和比对
BLAST 程序在 GenBank 检索到了 119 条苹果属
植物的 S-RNase基因序列，其中部分具有完全或者几
乎完全相同的基因序列，为重复的 S-RNase基因，去
掉这些冗余序列后，共得到 86 条惟一的苹果属植物
S-RNase 基因序列。加上本研究测序得到的 4 条
S-RNase基因，共获得 90条 S-RNase基因序列。这些
S-RNase 基因来自 10 个类群，它们的相关信息和
GenBank登录号见表 1。
S-RNase 基因以密码子为单位进行多序列比对，
再经手工调整后长 744 bp，共 248个密码子。其中变
异位点 457个，占比对位点数的 62%。发生了非同义
替换的密码子 173个，占所有密码子的 70%。
2.2 苹果属植物 S-RNase 基因的进化历史
S-RNase 基因的 NJ 树和最大似然树在树型和自
展支持值上完全一致（图 1）。根据系统发育树的拓
扑结构，结合遗传距离和自展支持值，将苹果属植物
的 90条 S-RNase基因划分为 16个亚类（subgroup）
（图 1和表 1）。同一亚类 S-RNase基因的遗传分化
通常较小，不同亚类 S-RNase基因之间的遗传分化远
大于同一亚类 S-RNase 基因之间的遗传分化。并且
每个亚类作为进化上的单系均得到了很好的自展支
持，支持值几乎全为 100%。而不同亚类之间的进化
关系不能确定，表现为决定亚类之间进化关系的内
部分支不仅枝长很短，而且自展支持值很低。这一
系统发育模式揭示苹果属植物的 S-RNase 基因在分
歧早期发生了快速的多样化，由一种祖先 S-RNase
基因快速分化产生了 16 种具有明显序列分化的
S-RNase基因。
2.3 苹果属植物 S-RNase 基因的序列分化
90条苹果属植物S-RNase基因的成对遗传距离计
算结果见图 2。使用 3 种距离测度：考虑所有碱基替
换，仅非同义替换和仅同义替换。遗传距离的分布大
体呈正态分布，其中前两种距离的分布模式相对一致，
而同义替换距离的分布更加平滑一些。就所有碱基替
换和非同义替换距离测度而言，40%左右的序列对的
遗传分化在 0.20—0.25，约 40%的序列对的遗传分化
在 0.15—0.20和 0.25—0.30之间，具有较小（＜0.15）
和较大遗传分化（＞0.30）的序列对分别占 10%左右。
但是根据同义替换计算的遗传距离，其中具有较小和
较大分化的序列对比例相比于前两种距离测度更多一
些，这与同义替换中性进化的理论预期相符。
系统发育分析将苹果属植物的 S-RNase基因分为
16个亚类，进一步计算亚类内部和亚类之间的遗传分
化发现，亚类内部的遗传分化较小，上述 3种距离测
度计算的遗传分化分别为 0.004—0.111、0.001—0.098
和 0.009—0.169之间。亚类之间的遗传分化明显大于
亚类内部的遗传分化。与 90 条 S-RNase 序列的成对
遗传距离相比（图 2），亚类之间的遗传分化相对集
中，根据 3种距离测度计算的遗传分化分别为：0.132
—0.334、0.137—0.338和 0.111—0.424之间。
为了分析影响苹果属植物 S-RNase基因序列分歧
的进化因子，以 S-RNase基因的 90条序列和 16个亚
类为单位，估计 S-RNase基因不同基因对和亚类间的
dN/dS 比值，结果见图 3。超过 40%的 S-RNase 基因
对的 dN/dS比值在 0.5—1.0之间，这些 S-RNase基因
之间的分歧是近中性氨基酸替换的结果，氨基酸的改
变没有引起 S-RNase 功能的变化。而余下 50%的
S-RNase 基因对的 dN/dS 比值大于 1，显示这些
S-RNase 基因之间的序列分化受到了正选择的作用，
是适应性氨基酸替换的结果，氨基酸的改变很可能导
致了 S-RNase功能的变化。在 dN/dS比值大于 1的基
因中，dN/dS 比值大于 1.5 的基因所占比例较少，这
是因为获得的 dN/dS比值是所有密码子 dN/dS比值的
均值。S-RNase 基因亚类之间 dN/dS 估计值的分布与
S-RNase基因对之间 dN/dS 估计值的分布模式大致相
同，说明亚类之间的序列分歧有相当比例是适应性氨
基酸替换的产物。
Nei-Gojobori 方法计算的 dN/dS 比值是整条序列
所有密码子 dN/dS 比值的平均值，为了进一步分析
dN/dS 比值在苹果属 S-RNase 基因不同部分的变化情
况，从16个S-RNase基因亚类中随机挑选5条S-RNase
基因的全长序列，进行任意两条序列 dN/dS比值的滑
动窗分析，结果见图 4。图中是 5条 S-RNase基因成
对组合的 10 种方式，以及每个成对组合的 dN/dS 平
均值，图中折线表示 dN/dS比值在整个 S-RNase基因上
2720 中 国 农 业 科 学 46卷
表 1 苹果属植物的 S-RNase 基因
Table 1 The S-RNase genes of Malus species
类群
Taxa
S-RNase基因名
Name of S-RNase gene
所属亚类
Subgroups
序列状态
Sequence status
品种
Cultivar
GenBank登录号
GenBank accession No.
Malus angustifolia S48 Subgroup 16 Partial NA FJ535239
Malus domestica S1 Subgroup 14 Partial Fuji EU427454
Malus domestica* S1 Subgroup 14 Partial Citromalma HQ689386
Malus domestica S2 Subgroup 5 Complete Golden Delicious U12199
Malus domestica* S2 Subgroup 5 Partial Tordai alma HQ693077
Malus domestica S3 Subgroup 10 Complete Golden Delicious U12200
Malus domestica* S3 Subgroup 10 Partial Elstar EU427455
Malus domestica* S3 Subgroup 10 Partial Mutsu AB428425
Malus domestica* S3 Subgroup 10 Partial Pink Pearl AB618094
Malus domestica S4 Subgroup 15 Complete NA AF327223
Malus domestica* S4 Subgroup 15 Partial Gloster EU427456
Malus domestica* S4 Subgroup 15 Partial Marosszeki piros HQ689390
Malus domestica* S4 Subgroup 15 Partial Gravenstein AB428426
Malus domestica* S5 Subgroup 11 Partial Elstar EU427460
Malus domestica* S5 Subgroup 11 Partial Sansa AB428427
Malus domestica S5 Subgroup 11 Partial NA U19791
Malus domestica S6 Subgroup 6 Partial Citron dHiver EU427461
Malus domestica* S6 Subgroup 6 Partial Oetwiler Reinette AB094495
Malus domestica* S7 Subgroup 4 Partial Fekete tanyeralma HQ689391
Malus domestica* S7 Subgroup 4 Partial Indo EU427457
Malus domestica S7 Subgroup 4 Partial NA U19792
Malus domestica S8 Subgroup 9 Partial Ontario AY744080
Malus domestica S9 Subgroup 7 Complete NA U19793
Malus domestica* S9 Subgroup 7 Partial NA AY187627
Malus domestica S10 Subgroup 10 Complete NA AF327221
Malus domestica* S10 Subgroup 10 Partial Maypole AB428428
Malus domestica S10 Subgroup 8 Partial Granny Smith AF239809
Malus domestica S11 Subgroup 16 Partial NA FJ008669
Malus domestica S12 Subgroup 6 Partial Citron dHiver AB105061
Malus domestica S14 Subgroup 16 Partial Jacques Lebel AB094492
Malus domestica S16a Subgroup 15 Partial Maypole AB428429
Malus domestica* S16b Subgroup 15 Partial Alkmene AB428430
Malus domestica* S16c Subgroup 15 Partial Bohnapfel AB126322
Malus domestica S17 Subgroup 6 Partial Blenheim Orange AB105062
Malus domestica S19 Subgroup 6 Partial Bohnapfel AB094493
Malus domestica S20 Subgroup 14 Partial Indo EU427458
Malus domestica* S20 Subgroup 14 Partial Sikulai HQ689395
Malus domestica S21 Subgroup 16 Partial NA FJ008670
Malus domestica* S21 Subgroup 16 Partial Ribston Pippin AB094494
Malus domestica S24 Subgroup 14 Complete NA AF016920
Malus domestica* S24 Subgroup 14 Partial Harangalma HQ693065

13期 唐亮等：苹果属 S-RNase基因的进化研究 2721
续表 1 Continued table 1
类群
Taxa
S-RNase基因名
Name of S-RNase gene
所属亚类
Subgroups
序列状态
Sequence status
品种
Cultivar
GenBank登录号
GenBank accession No.
Malus domestica* S24 Subgroup 14 Partial Vilmos renet HQ693064
Malus domestica S25 Subgroup 9 Partial McIntosh AB428431
Malus domestica S26 Subgroup 3 Complete NA AF016918
Malus domestica* S26 Subgroup 3 Partial David EU427459
Malus domestica* S26 Subgroup 3 Partial Baskatong AB428432
Malus domestica* S26 Subgroup 3 Partial Szabadkai szercsika HQ693070
Malus domestica* S27b Subgroup 15 Complete NA AF327222
Malus domestica S27 Subgroup 15 Complete NA AF016919
Malus domestica S28 Subgroup 6 Partial red delicious AF201748
Malus domestica S29 Subgroup 13 Partial NA AY039702
Malus domestica S31 Subgroup 14 Complete York Imperial DQ135990
Malus domestica S32 Subgroup 9 Complete Burgundy DQ135991
Malus domestica S33 Subgroup 5 Partial NA DQ219464
Malus domestica S34 Subgroup 11 Complete Adersleber Calville AB540122
Malus domestica S35 Subgroup 4 Partial NA EU391605
Malus domestica S36 Subgroup 6 Partial NA EU391606
Malus domestica S37 Subgroup 5 Partial NA EU391607
Malus domestica S38 Subgroup 5 Partial NA EU391609
Malus domestica S39 Subgroup 5 Partial NA EU391610
Malus domestica S40 Subgroup 5 Partial NA EU391611
Malus domestica S41 Subgroup 5 Partial NA EU391612
Malus domestica S42 Subgroup 11 Partial Murray EU427453
Malus domestica S42 Subgroup 14 Partial NA EU391613
Malus domestica S43 Subgroup 11 Partial Ingrid Marie EU427452
Malus domestica S44 Subgroup 16 Partial NA FJ008673
Malus domestica S45 Subgroup 13 Partial NA FJ008671
Malus domestica S46 Subgroup 7 Partial NA FJ008672
Malus domestica S53 Subgroup 12 Partial NA FJ602074
Malus domestica S54 Subgroup 13 Partial NA FJ602075
Malus domestica Sc Subgroup 15 Complete Fuji D50836
Malus domestica Sd Subgroup 4 Complete Akane AB032246
Malus domestica* Sd Subgroup 4 Partial Akane AB050634
Malus domestica Se Subgroup 6 Complete Delicious AB035273
Malus domestica* Se Subgroup 6 Partial Delicious AB050636
Malus domestica Sf Subgroup 14 Complete Fuji D50837
Malus domestica Sg Subgroup 14 Complete Indo AB019184
Malus domestica Sh Subgroup 14 Partial Akane AB050635
Malus domestica Si Subgroup 10 Complete McIntosh AB052683
Malus domestica SI Subgroup 6 Partial Starking Delicious AB017636
Malus domestica S-kb Subgroup 16 Partial Odra EU178108
Malus domestica S-kb Subgroup 16 Partial Odra EU443101
Malus domestica Sz Subgroup 9 Complete McIntosh AB062100

2722 中 国 农 业 科 学 46卷
续表 1 Continued table 1
类群
Taxa
S-RNase基因名
Name of S-RNase gene
所属亚类
Subgroups
序列状态
Sequence status
品种
Cultivar
GenBank登录号
GenBank accession No.
Malus kansuensis S51 Subgroup 6 Partial NA FJ535242
Malus mandshurica S52 Subgroup 2 Partial NA FJ535243
Malus prunifolia mpS1 Subgroup 15 Partial NA AB618796
Malus prunifolia mpS2 Subgroup 3 Partial NA AB618797
Malus sieversii S9 Subgroup 7 Partial NA GU727866
Malus sieversii S33 Subgroup 11 Complete NA AB540121
Malus sieversii S34 Subgroup 11 Partial NA DQ649477
Malus sieversii S35 Subgroup 3 Partial NA DQ868315
Malus sieversii S48 Subgroup 1 Partial NA GU727867
Malus sieversii S49 Subgroup 14 Partial NA FJ535240
Malus spectabilis S1 Subgroup 1 Complete NA FJ943264
Malus spectabilis* S1 Subgroup 1 Partial NA FJ943265
Malus spectabilis S2 Subgroup 13 Complete NA FJ943266
Malus spectabilis* S2 Subgroup 13 Partial NA FJ943267
Malus spectabilis S3 Subgroup 12 Complete NA FJ943268
Malus spectabilis* S3 Subgroup 12 Partial NA FJ943269
Malus spectabilis S4 Subgroup 2 Complete NA FJ943270
Malus spectabilis* S4 Subgroup 2 Partial NA FJ943271
Malus spectabilis S5 Subgroup 15 Complete NA FJ943272
Malus spectabilis* S5 Subgroup 15 Partial NA FJ943273
Malus sylvestris S1 Subgroup 14 Partial NA EU419866
Malus sylvestris S5 Subgroup 11 Partial NA EU419870
Malus sylvestris S9 Subgroup 7 Partial NA EU419868
Malus sylvestris S23 Subgroup 8 Partial NA EU419867
Malus sylvestris S36 Subgroup 16 Partial NA EU419865
Malus sylvestris S37 Subgroup 1 Partial NA EU419864
Malus sylvestris S38 Subgroup 1 Partial NA EU419863
Malus sylvestris S39 Subgroup 11 Partial NA EU419871
Malus sylvestris S40 Subgroup 15 Partial NA EU419869
Malus sylvestris S41 Subgroup 11 Partial NA EU419872
Malus sylvestris S46 Subgroup 13 Partial NA EU419860
Malus sylvestris S47 Subgroup 10 Partial NA EU419859
Malus sylvestris S50 Subgroup 1 Partial NA FJ535241
Malus transitoria Sg Subgroup 14 Complete NA AB096138
Malus transitoria St Subgroup 16 Complete NA AB035928
Malus transitoria* St Subgroup 16 Partial NA AB052268
Malus toringoides Subgroup1a Subgroup 1 Partial NA NA
Malus toringoides St likea Subgroup 16 Partial NA NA
Malus kansuensis St likea Subgroup 16 Partial NA NA
Malus kansuensis S9 likea Subgroup 7 Partial NA NA
*表示该 S-RNase 基因的序列与同一物种且名称也相同的 S-RNase 基因在序列上完全相同或者仅相差 1—2 个碱基，在本研究中视为冗余序列。NA
表示 Not available，即 GenBank记录中没有对应项的信息。a标记的 S-RNase基因的名称是根据与其最相似的 S-RNase基因的名称或者所属的亚类进
行的命名
13期 唐亮等：苹果属 S-RNase基因的进化研究 2723


Malus spectabilis_S1_FJ943264
Malus sylvestris_S38_EU419863
Malus sieversii_S48_GU727867
Malus sylvestris_S37_EU419864
Malus sylvestris_S50_FJ535241
Malus toringoides_Subgroup1
Malus mandshurica_S52_FJ535243
Malus spectabilis_S4_FJ943270
Malus domestica_S26_AF016918
Malus prunifolia_mpS2_AB618797
Malus sieversii_S35_DQ868315
Malus domestica_S7_U19792
Malus domestica_Sd_AB032246
Malus domestica_S35_EU391605
Malus domestica_S2_U12199
Malus domestica_S40_EU391611
Malus domestica_S41_EU391612
Malus domestica_S28_AF201748
Malus domestica_SI_AB017636
Malus domestica_S19_AB094493
Malus domestica_S10_AF239809
Malus domestica_S46_FJ008672
Malus sylvestris_S23_EU419867
Malus domestica_S32_DQ135991
Malus domestica_S8_AY744080
Malus domestica_S25_AB428431
Malus domestica_Sz_AB062100
Malus domestica_S53_FJ602074
Malus domestica_S45_FJ008671
Malus sylvestris_S46_EU419860
Malus spectabilis_S2_FJ943266
Malus domestica_Sf_D50837
Malus domestica_S24_AF016920
Malus domestica_S31_DQ135990
Malus sieversii_S49_FJ535240
Malus transitoria_Sg_AB096138
Malus domestica_S20_EU427458
Malus transitoria_St_AB035928
Malus sylvestris_S36_EU419865
Malus domestica_S21_FJ008670
Malus domestica_S-kb_EU178108
Malus domestica_S14_AB094492
Malus domestica_S37_EU391607
Malus domestica_S38_EU391609
Malus domestica_S33_DQ219464
Malus domestica_S39_EU391610
Malus kansuensis_S51_FJ535242
Malus domestica_S6_EU427461
Malus domestica_Se_AB035273
Malus domestica_S36_EU391606
Malus domestica_S12_AB105061
Malus domestica_S17_AB105062
Malus sieversii_S9_GU727866
Malus sylvestris_S9’_EU419868
Malus domestica_S9_U19793
Malus kansuensis_S9_like
Malus domestica_S3_U12200
Malus domestica_S10_AF327221
Malus domestica_S43_EU427452
Malus sylvestris_S41_EU419872
Malus sylvestris_S5_EU419870
Malus sylvestris_S47_EU419859
Malus domestica_S34_Sad5_AB540122
Malus domestica_S42_EU427453
Malus domestica_S5_U19791
Malus domestica_S29_AY039702
Malus domestica_Si_AB052683
Malus sieversii_S33_Ssi5_AB540121
Malus sieversii_S34_DQ649477
Malus sylvestris_S39_EU419871
Malus spectabilis_S3_FJ943268
Malus domestica_S54_FJ602075
Malus domestica_S1_EU427454
Malus sylvestris_S1_EU419866
Malus domestica_S42_EU391613
Malus domestica_Sh_AB050635
Malus domestica_Sg_AB019184
Malus domestica_S4_AF327223
Malus prunifolia_mpS1_AB618796
Malus domestica_S16a_AB428429
Malus spectabilis_S5_FJ943272
Malus domestica_S27_AF016919
Malus sylvestris_S40_EU419869
Malus kansuensis_St_like
Malus domestica_Sc_D50836
Malus toringoides_St_like
Malus angustifolia_S48_FJ535239
Malus domestica_S44_FJ008673
Malus domestica_S-kb_EU443101
Malus domestica_S11_FJ008669
亚类 1 Subgroup 1
亚类 2 Subgroup 2
亚类 3 Subgroup 3
亚类 4 Subgroup 4
亚类 5 Subgroup 5
亚类 9 Subgroup 9
亚类 6 Subgroup 6
亚类 7 Subgroup 7
亚类 10 Subgroup 10
亚类 11 Subgroup 11
亚类 12 Subgroup 12
亚类 13 Subgroup 13
亚类 14 Subgroup 14
亚类 15 Subgroup 15
亚类 8 Subgroup 8
亚类 16 Subgroup 16
99
100
100
99
100
100
100
100
80
96
100
93
100
100
98
97
100
(a)
2724 中 国 农 业 科 学 46卷
Malus domestica_S11_FJ008669
Malus domestica_S21_FJ008670
Malus angustifolia_S48_FJ535239
Malus toringoides_St_like
Malus transitoria_St_AB035928
Malus kansuensis_St_like
Malus domestica_S44_FJ008673
Malus sylvestris _S36_EU419865
Malus domestica_S-kb_EU443101
Malus domestica_S-kb_EU178108
亚类16 Subgroup 16
100
Malus spectabilis_S4_FJ943270
Malus mandshurica_S52_FJ535243 亚类2 Subgroup 2
(b)
Malus domestica _S14_AB094492
Malus domestica_S26_AF016918
Malus prunifolia_mpS2_AB618797
Malus sieversii_S35_DQ868315 亚类3 Subgroup 3
Malus sylvestris_S38_EU419863
Malus sieversii_S48_GU727867
Malus sylvestris_S37_EU419864
Malus sylvestris_S50_FJ535241
Malus toringoides_Subgroup1
Malus spectabilis_S1_FJ943264
亚类1 Subgroup 1
Malus kansuensis_S51_FJ535242
Malus domestica_S6_EU427461
Malus domestica_S12_AB105061
Malus domestica_S19_AB094493
Malus domestica_S17_AB105062
Malus domestica_Se_AB035273
Malus domestica_SI_AB017636
Malus domestica _S28_AF201748
Malus domestica_S36_EU391606
亚类6 Subgroup 6
Malus spectabilis_S3_FJ943268
Malus domestica_S53_FJ602074 亚类12 Subgroup 12
Malus sylvestris_S23_EU419867
Malus domestica_S10_AF239809 亚类8 Subgroup 8
Malus domestica_Sz_AB062100
Malus domestica_S25_AB428431
Malus domestica_S8_AY744080
Malus domestica_S32_DQ135991
亚类9 Subgroup 9
Malus sylvestris_S47_EU419859
Malus domestica_Si_AB052683
Malus domestica_S10_AF327221
Malus domestica_S3_U12200
亚类10 Subgroup 10
Malus sylvestris_S9’_EU419868
Malus sieversii_S9_GU727866
Malus domestica_S46_FJ008672
Malus kansuensis_S9_like
Malus domestica_S9_U19793
亚类7 Subgroup 7
Malus domestica_S41_EU391612
Malus domestica_S40_EU391611
Malus domestica_S38_EU391609
Malus domestica_S37_EU391607
Malus domestica_S39_EU391610
Malus domestica_S33_DQ219464
Malus domestica_S2_U12199
亚类5 Subgroup 5
Malus domestica_Sd_AB032246
Malus domestica_S7_U19792
Malus domestica_S35_EU391605
亚类4 Subgroup 4
Malus transitoria_Sg’_AB096138
Malus domestica_Sg_AB019184
Malus domestica_S20_EU427458
Malus sieversii _S49_FJ535240
Malus domestica_S31_DQ135990
Malus sylvestris_S1’_EU419866
Malus domestica_Sf_D50837
Malus domestica_S1_EU427454
Malus domestica_Sh_AB050635
Malus domestica _S42_EU391613
Malus domestica_S24_AF016920
亚类14 Subgroup 14
Malus sylvestris_S46_EU419860
Malus domestica_S54_FJ602075
Malus domestica_S45_FJ008671
Malus spectabilis_S2_FJ943266
Malus domestica_S29_AY039702
亚类13 Subgroup 13
Malus sieversii _S33_Ssi5_AB540121
Malus sieversii_S34_DQ649477
Malus sylvestris _S5’_EU419870
Malus domestica _S5_U19791
Malus sylvestris_S39_EU419871
Malus domestica_S43_EU427452
Malus domestica _S34_Sad5_AB540122
Malus domestica _S42_EU427453
Malus sylvestris_S41_EU419872
亚类11 Subgroup 11
Malus spectabilis _S5_FJ943272
Malus prunifolia _mpS1_AB618796
Malus sylvestris _S40_EU419869
Malus d omestica _S4_AF327223
Malus domestica _S16a_AB428429
Malus domestica _S27_AF016919
Malus domestica_Sc_D50836
亚类15 Subgroup 15
100
100
100
100
100
100
92
100
100
100
100
100
100
93
92
98

分支上显示的是大于 50的自展支持值 Number on branch is bootstrap support larger than 50 for that branch

图 1 苹果属植物 S-RNase 基因的 NJ 树（a）和最大似然树（b）以及由此所划分的 16 个 S-RNase 基因亚类
Fig. 1 Phylogenetic trees of Malus S-RNase genes reconstructed using Neighbor-joining (a) and maximum likelihood (b), as well
as the 16 subgroups delimited based on phylogenetic trees
13期 唐亮等：苹果属 S-RNase基因的进化研究 2725
0
10
20
30
40
50
0
10
20
30
40
50
0
10
20
30
40
50
距离区间 Distance intervals
a b c
所有碱基
Whole nucleotide substitutions
非同义替换
Nonsynonymous substitutions
同义替换
Synonymous substitutions


图 2 苹果属植物 S-RNase 基因成对遗传距离的分布图
Fig. 2 The distribution patterns of pairwise genetic distances among Malus S-RNase genes

0.
0,
0
.5
0.
5,
1
.0
1.
0,
1
.5
1.
5,
2
.0
2.
0,
2
.5
2.
5,
3
.0
3.
0,
3
.5
3.
5,
4
.0
4.
0,
4
.5
4.
5,
5
.0
5.
0,
5
.5
0.
0,
0
.5
0.
5,
1
.0
1.
0,
1
.5
1.
5,
2
.0
2.
0,
2
.5
2.
5,
3
.0
3.
0,
3
.5
3.
5,
4
.0
4.
0,
4
.5
4.
5,
5
.0
5.
0,
5
.5
百
分
比
P
er
ce
nt
ag
es


图 3 S-RNase 基因对（a）和 S-RNase 基因亚类（b）之间 dN/dS 比值的分布
Fig. 3 Distribution patterns of dN/dS estimations for pairwise S-RNase genes (a) and subgroups (b)

的变化情况。值得注意的是，虽然一些 S-RNase基因
对的 dN/dS平均值小于 1，但是它们某些区域的 dN/dS
比值显著大于 1，表明这些特定区域的 S-RNase 基因
密码子的分歧是适应性氨基酸替换的结果，受选择作
用而固定。并且常有多个 S-RNase基因对在相同区域
具有大于 1的 dN/dS比值，这些区域的密码子再三发
生适应性氨基酸替换暗示它们可能参与 S-RNase特异
性的多样化。
2.4 苹果属不同类群在 S-RNase 基因位点上的遗传
多态性和遗传分化
对本研究获得的所有苹果属植物、栽培苹果、野
生物种以及序列数目较多的 3 种野生苹果的 S-RNase
基因位点的遗传多态性进行估计，计算结果见表 2。
和 θ两种多态性度量指标显示，野生苹果 S-RNase基
因的遗传多态性未高于栽培苹果，并且就而言，栽
培苹果 S-RNase 基因的值反而略高于野生苹果。虽
然塞威士苹果和海棠花 S-RNase基因的 θ值略高于栽
培苹果，但是差别不大。
栽培苹果与野生苹果在 S-RNase基因位点上的遗
传分化水平见表 3。基于同义替换、非同义替换和总
的替换估计的遗传分化一致支持塞威士苹果与栽培苹
果具有最小的遗传距离，为 0.21（单位是替换/位点），
而其它野生苹果与栽培苹果的遗传距离均在0.3以上，
显示它们与栽培苹果的亲缘关系较远。
3 讨论
目前就栽培苹果的 S基因和 S基因型已经进行了
大量研究 [16]，但是针对苹果属 S-RNase基因的进化历
史和遗传多态性的研究还比较薄弱。本研究通过查询
GenBank数据库取得了苹果属植物已知的 S-RNase基
因序列，同时采用 S-RNase基因保守引物扩增及克隆
测序的方法获得了陇东海棠和变叶海棠的 S-RNase基
因序列，在此基础上进行了较为全面的 S-RNase基因
进化遗传学分析。通过 S-RNase基因的系统发育分析，
2726 中 国 农 业 科 学 46卷
dN
/d
S
比
值
d
N
/d
S
ra
tio


图 4 苹果属植物代表性 S-RNase 基因 dN/dS 比值的滑动窗分析
Fig. 4 Sliding window analyses of dN/dS ratio for representatives of Malus S-RNase genes

表 2 苹果属不同类群 S-RNase 基因的遗传多态性
Table 2 Genetic polymorphisms of S-RNase genes for different taxa of Malus
类群 Taxa 多样性指标
Diversity index 所有苹果属物种
All Mauls species
栽培苹果
Malus domestica
苹果属野生物种
All wild Malus species
森林苹果
Malus sylvestris
塞威士苹果
Malus sieversii
海棠花
Malus spectabilis
 0.18741 0.19569 0.17188 0.17606 0.17754 0.17164
θ 0.13949 0.14376 0.14609 0.14675 0.19331 0.16216

表 3 基于 S-RNase 基因的栽培苹果与野生苹果不同类群之间的遗传分化
Table 3 Genetic divergence between Malus domestica and various wild Malus species based on S-RNase gene sequences
类群 Taxa 遗传分化测度
Measures of genetic
divergence
塞威士苹果
Malus
sieversii
陇东海棠
Malus
kansuensis
海棠花
Malus
spectabilis
毛山荆子
Malus
mandshurica
变叶海棠
Malus
toringoides
楸子
Malus
prunifolia
森林苹果
Malus
sylvestris
花叶海棠
Malus
transitoria
窄叶海棠
Malus
angustifolia
同义位点遗传分化
Syn. distance
0.19191 0.19474 0.22580 0.24656 0.22571 0.25451 0.30404 0.26631 0.24873
非同义位点遗传分化
NonSyn. distance
0.22080 0.34530 0.33759 0.34247 0.37334 0.35455 0.34498 0.38238 0.42509
所有位点遗传分化
All sites distance
0.21463 0.31036 0.31203 0.32076 0.32361 0.33183 0.33592 0.35584 0.38353
13期 唐亮等：苹果属 S-RNase基因的进化研究 2727
将苹果属植物的 S-RNase 基因分为 16 个亚类（图 1
和表 1），这 16个 S-RNase基因亚类很可能与 S-RNase
基因亲和特异性的类型存在一定的关联。在没有通过
人工授粉试验确定亲和特异性的类型之前，序列的进
化关系和分化水平可以用来对特异性进行初步的预测
和划分[5]。亚类内部有一些来自同一物种的 S-RNase
基因几乎没有序列差异，但是名称却不同，很容易被
错误地认为是特异性不同的 S-RNase基因，但实质上
它们很可能只是同物异名。与此相似的是，同一亚类
不同物种的 S-RNase基因虽然遗传分化很小，但是通
常也被命名为不同的 S-RNase 基因（图 1）。这种情
况一方面可能是 S-RNase 基因的功能的确发生了分
化，另一方面很可能是 S-RNase基因的命名没有准确
反映其特异性。李天忠等[16]在整理栽培苹果 S-RNase
基因时也发现了同样的情形。通过 S-RNase基因的系
统发育分析可以清楚地显示这些情况，为 S-RNase基
因特异性的确定和正确归类及命名提供进化和序列分
化方面的信息。
S-RNase 基因的 dN/dS 分析表明，不同亚类
S-RNase 基因的序列分歧有很大部分是适应性氨基酸
替换的产物，受到选择的驱动（图 3 和图 4）。这一
进化特性源于 S-RNase基因编码蛋白的功能。S-RNase
基因编码的 S-RNase是配子体自交不亲合性的花柱决
定因子，与花粉的 S 基因相互识别，阻止与花柱
S-RNase 基因特异性相同的花粉对胚珠的受精[1]。当
一种新特异性的 S-RNase基因出现时，由于它具有最
大的交配潜力，因此必然受到自然选择的青睐，其基
因频率会逐渐上升直至与原有 S-RNase基因的适合度
相同为止[29]。S-RNase 基因在受精过程中的这种功能
决定了它的序列是适应性氨基酸替换的热点区域[30]。
本研究不但证实了 S-RNase基因的序列分歧有很大部
分是适应性氨基酸替换的产物，并且通过 dN/dS的滑
动窗分析确定了 S-RNase基因发生适应性氨基酸替换
的密码子区域，为 S-RNase识别位点的分子生物学研
究提供了重要的候选氨基酸位点。
在 S-RNase 基因位点上，栽培苹果和野生苹果
的遗传多态性不存在明显差别，然而很多研究报道
栽培驯化过程通常会导致驯化物种遗传多态性的丧
失[31-32]。这一矛盾可能源于 S-RNase基因的取样偏差。
由于现有数据中栽培苹果的 S-RNase基因比野生苹果
的多，因此可能没有获得足够的野生苹果 S-RNase基
因数据以揭示栽培驯化导致的 S-RNase基因遗传多样
性的丢失。另一种可能的解释是 S-RNase基因位点的
基因流高于基因组的平均水平，因此 S-RNase基因位
点的遗传多态性不能反映整个基因组水平的多态性在
驯化过程中的实际变化情况。由于 S-RNase基因参与
控制花粉对胚珠的受精，受到负的频率依赖的选择，
所以不同类型的 S-RNase 基因很容易在群体之间扩
散，导致 S-RNase基因位点的基因流高于基因组平均
水平，从而使该位点的遗传变异水平没有因为人工驯
化而发生明显的降低[30, 33]。对芸苔属植物 S位点 SRK
基因的研究同样也发现，栽培与野生物种在 S位点上
不存在遗传多态性明显差别[6]。因此，S 位点遗传多
态性不受驯化瓶颈影响，很可能是 S位点独特的生物
学功能的结果。根据 S-RNase基因计算的遗传分化支
持塞威士苹果是栽培苹果的最近野生类群，这与现有
文献报道的塞威士苹果是栽培苹果野生祖先的观点一
致[34]，表明 S-RNase基因可以用于分析苹果属植物之
间的遗传分化。栽培苹果的部分 S-RNase基因与森林
苹果的聚在一起，并且序列很相似，表明栽培苹果的
这些 S-RNase基因很可能源自森林苹果，因此森林苹
果也可能参与了栽培苹果的驯化起源。
4 结论
本研究通过苹果属植物 S-RNase基因的分子系统
发育分析，划分了 16 个苹果属植物 S-RNase 基因的
亚类，可能与 16 种亲和特异性对应，同时还揭示
S-RNase 基因的亚类在分化早期经历了快速的多样
化。S-RNase 基因之间和亚类之间的序列分歧有很大
部分是适应性氨基酸替换的结果，受到自然选择的作
用。人工驯化没有导致栽培苹果 S-RNase基因的遗传
多态性降低，基于 S-RNase 基因的遗传分化表明
S-RNase 基因可以用于苹果属植物遗传分化的分子研
究。

致谢：本研究工作得到了中国农业大学农学与生物技术
学院李天忠教授的指导，特致谢忱。

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（责任编辑 曲来娥）