全 文 ：网络出版时间：2016-09-14 10:31:50
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北京农学院学报 ２０１６,３１ (４):
JournalofBeijingUniversityofAgriculture
http://bnxbcbptcnkinet
收稿日期:２０１６Ｇ０６Ｇ１４
基金项目:北京市农委农业科技项目 (项目编号２０１５０１２１);北京市大学生科研训练计划深化项目;２０１６农业应用新
技术北京市重点实验室开放课题 (项目编号kf２０１６０２４)
第一作者:卢艳芬,女,讲师,博士,研究方向:果树种质资源利用与创新,EＧmail:luyf２０１３＠bua．edu．cn
卜芋芬,女,硕士研究生,研究方向:果树种质资源利用与创新,EＧmail:buyufen＠１６３．com
通信作者:姚允聪,男,教授,博士,研究方向:果树种质资源利用与创新,EＧmail:yaoyc_２０＠１２６．com
５种苹果属植物GAI基因的克隆及生物信息学分析
卢艳芬,卜芋芬,郝素晓,汪天宇,姚允聪∗
(北京农学院植物科学技术学院/农业应用新技术北京市重点实验室/
北京林果业生态环境功能提升协同创新中心,北京１０２２０６)
摘 要:【目的】为研究DELLA家族的成员GAI在调控植物株型形成方面的生物学功能.【方法】从５种苹果
属植物 (‘国光’、‘武乡海棠’、‘SH６’、‘比利时垂枝’、‘比利时直立’)中分离得到GAI基因,应用多种生物
学工具分析其序列特征.【结果】序列分析表明,GAI的CDS序列长度为１８７５bp,编码６２４个氨基酸;GAI的
基因组序列长度与其对应CDS序列长度相同;GAI蛋白具有亲水性,主要定位于细胞质;５种苹果属植物的
GAI序列相似性极高,都具有DELLA家族和GRAS家族特有的典型结构.【结论】试验结果暗示这５种苹果属
GAI基因可能在苹果株型形成方面发挥重要功能.
关键词:苹果属植物;GAI;植物株型;DELLA蛋白;基因克隆;序列分析
中图分类号:S６６１．４ 文章编号:１００２Ｇ３１８６(２０１６)０４Ｇ００００Ｇ００ 文献标志码:A
CloningandbioinformaticanalysisofGAIinthefiveMalusspecies
LUYanfen,BUYufen,HAOSuxiao,WANGTianyu,YAOYuncong∗
(PlantScienceandTechnologyColege,BeijingUniversityofAgriculture/KeyLaboratoryofNewTechnology
inAgriculturalApplicationofBeijing/BeijingColaborativeInnovationCenterforEcoＧEnvironmentalImprovement
withForestryandFruitTrees,Beijing１０２２０６,China)
Abstract:【Objective】OurresearchisaimedtostudythefunctionsofGAIs,membersofDELLAproteinfamily,inregulating
theplantarchitecture．【Method】Inthisstudy,GAIs,wereisolatedfromthefiveMalussp．cultivars(‘RalsJanet’,‘HonanenＧ
sisRehd’,‘SH６’,‘Belgiumweeping’,‘Belgiumupright’),andtheirsequenceanalyseswereperformedbylotsofbioinformatic
tools．【Result】TheresultsindicatedthatthefullengthCDSsofGAIsofthesefiveMaluscultivarswere１８７５bp,encoding６２４
aminoacids．Astoeachgene,genomicsequenceofGAIwasthesameasitsCDSsequence．GAIproteinwashydrophilicand
mainlylocatedinthecytoplasm．MultiplesequencealignmentindicatedthatGAIproteinsofthefiveMalussp．cultivarspresenＧ
tedhighsequencehomology,especialyatDELLAandGRASSuperＧfamilytypicaldomains．【Conclusion】Thestudyshowed
thatGAImightplayimportantregulatoryrolesintheformationofMalustreearchitecture．
Keywords:Malusplant．;GAI;plantarchitecture;DELLA;genecloning;sequenceanalysis
赤霉素 (Gibberelins,GAs)是调控植物株型
的重要激素,赤霉素相关基因的克隆与分子机制研
究对于合理调控作物生长发育和农业生产具有极其
重要的利用价值,如矮秆农作物品种在粮食生产上
得到了广泛应用[２].DELLA(DＧasparticacid,EＧ
glutamicacid,LＧleucine,AＧalanin)蛋白在赤霉素信
号转导过程中扮演抑制因子的角色,因其具有高度
保守的 DELLA 结构域而得名[３].植物中编码
DELLA结构域的基因发生突变、缺失或表达量过
２０１６年第４期 卢艳芬 等:５种苹果属植物GAI基因的克隆及生物信息学分析 ３
多时都会导致植物表现出矮化特征[４Ｇ５].其中,
DELLA蛋白的一类重要组成成员GAI(Gibberelic
AcidInsensitive))在植物的种子萌发、茎的伸长、对
逆境响应等方面起着非常重要的作用[６].
随着果树矮化密植栽培的发展[１]和基因工程手
段的发展,科学家们已经在苹果、梨、枇杷等植物中
分离得到了许多DELLA基因[７Ｇ１０].在果树栽培应
用中,‘SH６’作为‘国光’和‘武乡海棠’的杂交后代,
不仅具有更强的抗性,而且与亲本相比具有明显的
矮化特性[１１];海棠‘比利时垂枝’的树体主干较低,
枝条出现下垂特性,枝条的节间较短,矮化特性较为
明显.目前对于作为砧木的海棠品种中DELLA基
因的研究较少.基于上述分析,本试验以‘国光’、
‘武乡海棠’、‘SH６’、‘比利时垂枝’、‘比利时直立’
这５种苹果属植物叶片为试材,拟通过比较这５种
苹果属植物中GAI基因的序列异同,来探究其对植
物株型调控的功能.
１ 材料与方法
１．１ 植物材料
５种苹果属植物(‘国光’(Malussp．Rals
Janet)、‘武乡海棠’(Malussp．honanensisRehd)、
‘SH６’(Malussp．SH６)、‘比利时垂枝’(Malussp．
Belgiumweeping)、‘比利时直立’(Malussp．BelＧ
giumupright)为试验材料.以上５种苹果属植物
材料种植于北京市顺义区木林镇海棠资源圃,２０１４
年７月,选取６年树龄的植株,从相同光照方向选取
长势一致的一年生枝条,采集叶片,速置于液氮中,
并保存于－８０℃.
１．２ 试验方法
１．２．１ 苹果属植物GAI的克隆 RNA的提取:称
量 ０．１ g 冻 存 于 －８０ ℃ 的 植 物 叶 片,参 考
EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(艾德莱,北
京)进行叶片总RNA提取(图１Ｇa).
第一链cDNA的合成:利用cDNA合成试剂盒
(Takara,日本)将提取的植物叶片总RNA反转录
生成cDNA.
DNA的提取:称量０．１g冻存的植物叶片,参
考CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒(艾德
莱,北京)进行叶片基因组DNA的提取.
引物的设计与合成:根据NCBI公布的苹果同
源基因 MdGAI(GenBank:XP_００８３８１３４６),利用
DNAStar软件设计引物,序列如下:
GAIＧF:５＇ＧATGAAAGGGGAGCATCAGATＧ３＇,
GAIＧR:５＇ＧAGCCGAGGTGGCAATGAＧ３＇.
PCR反应扩增体系(５０μL):水,２２μL;２×
EASYPfuPCRSuperMix(全式金,北京),２５μL;
GAIＧF(１０μM ),１μL;GAIＧR (１０μM ),１μL;
新合成的cDNA或基因组DNA,１μL.
PCR反应扩增步骤与条件:９５℃５min;９５℃
３０s、５８℃３０s、７２℃４min３０s,３５个循环;７２℃
７min;４℃ 保存.
PCR产物纯化回收后,连接pEASYＧBluntCloＧ
ningVector(全式金,北京)并转化大肠杆菌Trans
T１感受态细胞(全式金,北京),进行转化子鉴定后,
选取５个阳性克隆并进行测序.
１．２．２ GAI 的生物信息学分析 利用DNAStar
软件分析基因的开放阅读框;利用ComputePI/Mw
(http://web．expasy．org/compute_pi/)计算其理论
等电点及分子质量信息;利用 ProtScale(http://
web．expasy．org/protscale/)预测其蛋白质疏水性功
能;利用 SWISSＧMODEL(http://swissmodel．exＧ
pasy．org/)预测其蛋白质三级结构;利用 NCBI
Conserved DomainSearchService(http://www．
ncbi．nlm．nih．gov/Structure/cdd/wrpsb．cgi)分析其
蛋白质保守功能域;运用 MEME 工具(http://
memeＧsuite．org/)对其蛋白序列进行保守基序分
析;运用DNAMAN７．０工具对检索到的相关基因的
氨基酸序列进行相似性分析;运用 MEGA７．０工具
构建系统进化树[１２Ｇ１５].
２ 结果与分析
２．１ 苹果属植物叶片GAI基因的克隆结果
利用试剂盒提取植物叶片RNA并进行RNA
质量检测,结果如图１Ｇa所示,采用同源克隆的方
法,克隆得到５种苹果属植物GAI基因的全长CDS
(Codingsequence)序列(图１Ｇb),测序分析结果表
明,该５种苹果属植物的GAI的CDS序列全长均
为１８７５bp,编码６２４个氨基酸;选用提取的叶片基
因组DNA为模板,采用同源克隆的方法,克隆得到
５种苹果属植物GAI基因的基因组DNA序列(图
１Ｇc).
２．２ ５种苹果属植物GAI序列分析结果
根据测序成功的GAI序列信息,扩增得到的５
种苹果属植物GAI基因的基因组DNA片段大小
与其CDS片段大小均为１８７５bp,推断这５种苹果
属植物中GAI基因的基因组DNA序列不含内含
子.进一步将克隆得到的５种苹果属植物的GAI
４ 北 京 农 学 院 学 报 第３１卷
a．５种苹果属植物RNA的提取,M１代表DL２０００Marker,Rj代表‘国光’,HR代表‘武乡海棠’,Bw代表‘比利时垂枝’,Bu代表‘比利时直立’,SH６
代表‘SH６’植物;b．５种苹果属植物GAI基因的CDS序列扩增,M２代表DL２KplusMarker;c．５种苹果属植物GAI基因的基因组DNA序列扩增
a．RNAextractionfromtheleavesofthefiveMalussp．cultivars．M１meansDL２０００Marker,RjmeansMalussp．RalsJanet,HRmeans
Malussp．honanensisRehd,BwmeansMalussp．Belgiumweeping,BumeansMalussp．Belgiumupright,SH６meansMalussp．SH６;b．
TheamplificationofGAICDSsequencesfromleavesofthefiveMalussp．Cultivars,M２meansDL２KplusMarker;c．Theamplificationof
genomesequencesofGAIofthefiveMalussp．cultivars
图１ 苹果属植物GAI基因的扩增
Fig１ TheamplificationofGAIgenes
图２ GAI蛋白的保守功能域预测
Fig２ TheputativeconserveddomainofGAI
基因的CDS序列信息利用DNAMAN软件进行同
源性分析(图３),发现‘国光’(Rj)、‘武乡海棠’
(HR)、‘SH６’(SH６)、‘比利时垂枝’(Bw)、‘比利时
直立’(Bu)的GAI基因除极个别碱基略有不同,同
源性高达９９．２％.
利用DNAStarSeqMan软件对氨基酸序列进
行分析,发现５种苹果属植物的GAI的氨基酸数量
均为６２４aa.进一步利用ComputePI/Mw工具推
测其氨基酸信息发现,‘国光’、‘武乡海棠’、‘比利时
垂枝’的GAI基因等电点均为５．２１,分子质量均为
６８．５３kDa;而‘SH６’的GAI基因等电点为５．１７,分
子质量为６８．５２kDa;‘比利时直立’的GAI基因等
电点为５．１７,分子质量为６８．５０kDa.虽然５种苹
果属植物的GAI蛋白的等电点与分子质量略有差
异,但是区别不大.利用 NCBIConservedDomain
Searchservice工具对GAI编码蛋白的结构域进行
分析表明,在５种苹果属植物中该序列N端氨基酸
区域含有 DELLA 超级家族核心序列 DELLA、
TVHYNP,C端氨基酸区域含有 GRAS超级家族
核心序列 LHR、NLS、VHIID、RVER 等(图２和
图３).
将克隆得到的５种苹果属植物的GAI基因的
氨基酸序列,利用DNAMAN７．０软件进行相似性分
析(图３),发现其氨基酸序列的相似性也比较高,彼
此间氨基酸序列相似性高达９９．８７％甚至１００％.
２．３ GAI蛋白信息分析结果
利用ProtScale工具推测GAI蛋白质疏水性功
能发现,５种苹果属植物的GAI基因均具有亲水性
能,且其各氨基酸亲水性分布于Ｇ２．６５６~２．３００之
间.利用Psort工具推测 GAI蛋白质亚细胞定位
信息发现,GAI蛋白主要分布于细胞质(６５％),线
粒体基质空间(１０％),溶酶体(１０％),微体(５．４％),
而初步判断内质网膜上不存在该蛋白.MEME对
GAI蛋白保守结构域分析表明,５种苹果属植物
GAI蛋白均存在有位于DELLA及 GRAS保守结
构域内的３个高度保守的基序(图４),‘国光’与‘武
乡海棠’的GAI蛋白的保守基序完全一致,‘SH６’
与‘比利时垂枝’的GAI蛋白的保守基序完全一致,
‘比利时直立’的GAI蛋白的保守基序与其他４种
苹果属植物GAI蛋白的都存在一定的差异.进一
步利用SWISSＧMODEL推测GAI蛋白质三级结构
(图５),发现该５种苹果属植物的GAI蛋白三级结
构完全一致,且都存在有GRAS转录因子家族特有
的蛋白结构,这一结果与 NCBIConservedDomain
Searchservice工具分析结果一致.
２．４ 系统进化分析结果
进一步利用 NeighborＧJoining法,将克隆得到
的５种苹果属植物的GAI蛋白与NCBI检索到的
２０１６年第４期 卢艳芬 等:５种苹果属植物GAI基因的克隆及生物信息学分析 ５
１代表DELLA结构域,２代表TVHYNP结构域,３代表LHR结构域,４代表NLS结构域,５代表VHIID结构域,６代表RVER结构域
图３ ５种苹果属植物GAI基因的氨基酸序列同源性分析
１representsDELLAdomain,２representsTVHYNPdomain,３representsLHRdomain,
４representsNLSdomain,５representsVHIIDdomain,６representsRVERdomain
Fig３ ThemultiplealignmentsofGAIs
其他物种的相关 GAI蛋白:苹果中的 GAI蛋白
(GenBank: XP _ ００８３８１３４６, ACL６８３５９,
ACL６８３６０)、拟南芥中的 GAI蛋白 (GenBank:
AT１G１４９２０)、水 稻 中 的 GAI 蛋 白 (GenBank:
AAX０７４６２．１)、番茄中的GAI蛋白(GenBank:XP_
０１５０５８３５９)、葡萄中的 GAI蛋白(GenBank:XP_
００２２６３０４０)、黄瓜中的GAI蛋白(GenBank:Cucsa．
２８０３１０)、桃 中 的 GAI 蛋 白 (GenBank:Prupe．
１G３２９６００)等进行比对,利用 MEGA７．０软件构建
系统进化树,分析该５种苹果属植物GAI蛋白与其
他已知植物的GAI蛋白的同源关系(图６),结果发
现‘国光’(Rj)、‘武乡海棠’(HR)、‘SH６’(SH６)、
‘比利时垂枝’(Bw)、‘比利时直立’(Bu)的GAI蛋
白聚类在同一分支上,且其与富士苹果的 GAI
(ACL６８３６０)、小金海棠的GAI(ACL６８３５９)在进化
上亲缘关系最近,推测这些基因可能具有相似的功
能,参与植物体内DELLA蛋白的相关功能执行.
前人研究结果表明苹果 MdGAI蛋白与拟南芥中的
AtGAI蛋白在调控植物生长方面具有相似作用[１６],
基于进化分析结果,推断在这５种苹果属植物生长
过程中 GAI在苹果株型形成中也可能发挥重要
功能.
６ 北 京 农 学 院 学 报 第３１卷
图４ GAI蛋白保守基序分析
Fig４ MotifcompositionanalysisofGAI
图５ GAI蛋白三级结构预测结果
Fig５ ThepredictionofGAIproteinstructures．
２０１６年第４期 卢艳芬 等:５种苹果属植物GAI基因的克隆及生物信息学分析 ７
图６ ５种苹果属植物GAI与其它已知植物的
GAI蛋白系统进化树
Fig６ PhylogenetictreeofGAIsinthefiveMalussp．
cultivarsandotherreportedGAIproteinsinother
plants
３ 讨 论
从５ 种苹果属植物 ‘国光’、‘武乡海棠’、
‘SH６’、‘比利时垂枝’、‘比利时直立’叶片中分离得
到CDS全长均为１８７５bp的GAI基因,该基因编
码６２４个氨基酸,在这５种苹果属植物GAI基因的
基因组DNA序列长度与其CDS序列长度完全一
致,推断在这５种苹果属植物中GAI基因不含有内
含子,均为外显子结构,通过Phytozome网站(htＧ
tps://phytozome．jgi．doe．gov/pz/portal．html＃)检
索到的苹果中的同源基因(MDP００００６６９４５１)等基
因同样没有内含子.再进一步发现５种植物中
GAI基因的CDS序列同源性极高,其氨基酸序列均
含有DELLA、THVNP、LHR、NLS、RVER等结构
域,蛋白质三级结构、亲水性、亚细胞定位等都高度
一致.系统进化树分析表明,该５种苹果属植物的
GAI蛋白与其他苹果、葡萄、猕猴桃、水稻、玉米、拟
南芥等植物中的GAI蛋白的亲缘关系都比较近,且
与拟南芥AtGAI在进化上有相同起源,推测其可能
具有AtGAI与调控植物株高相关的功能.除此之
外,也发现５种苹果属植物分离得到的GAI在以下
方面存在差异:因为序列存在差异的几个碱基,造成
‘国光’、‘武乡海棠’、‘比利时垂枝’的理论等电点高
于‘SH６’和‘比利时直立’,分子质量也是如此;‘国
光’与‘武乡海棠’的 GAI蛋白的保守基序完全一
致,‘SH６’与‘比利时垂枝’的GAI蛋白的保守基序
完全一致,‘比利时直立’的GAI蛋白的保守基序与
其他４种苹果属植物GAI蛋白的都存在一定的差
异.基于这些差异,我们推测,可能就是这些细微的
碱基差异、基序差异,虽然没有在蛋白质高级结构上
造成５种植物GAI蛋白的差异,但可能引起其GAI
基因不同植物品种内不同组织器官表达量的不同,
也因此可能造成植物株高的差异.
本研究对GAI基因的克隆和序列分析,有助于
深入研究 DELLA蛋白在调控苹果矮化的分子机
理,也为‘SH６’作为苹果矮化栽培生产中的矮化砧
木或是矮化中间砧的应用奠定理论基础.
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