全 文 ：江苏农业学报(Jiangsu J． of Agr． Sci．) ，2012，28(3) :643 ～ 647
杜小丽，陈秀孔，张计育，等． 苹果属植物再生体系优化及长富 6 号遗传转化体系的建立［J］． 江苏农业学报，2012，28(3) :
643-647．
苹果属植物再生体系优化及长富 6 号遗传转化体系的
建立
杜小丽1， 陈秀孔1， 张计育2， 罗昌国1， 都贝贝1， 李春霞1， 章 镇1， 渠慎春1
(1．南京农业大学园艺学院，江苏 南京 210095;2．江苏省中国科学院植物研究所，江苏 南京 210014)
收稿日期:2011-11-19
基金项 目:国 家 高 技 术 研 究 发 展 计 划(“863”计 划)项 目
(2011AA100204) ;江苏省科技支撑项目(BE2011415)
作者简介:杜小丽(1984-) ，女，山西长治人，硕士研究生，主要从事果
树生物技术研究。(E-mail)duxiaoli0527@ 163． com
通讯作者:渠慎春，(E-mail)qsnj@ njau． edu． cn
摘要: 以苹果栽培品种长富 6 号和砧木湖北海棠、八棱海棠 3 种苹果属植物的无菌生根苗和继代苗叶片为
材料，研究不同苹果属植物生根苗与继代苗叶片间的再生差异和暗培养时间对苹果属植物生根苗叶片再生的影
响;以长富 6 号生根苗叶片为受体材料，对影响长富 6 号遗传转化的因素进行优化，对获得的抗性芽进行 PCR 和
RT-PCR检测。结果表明:3 种苹果属植物生根苗叶片的再生能力优于继代苗，暗培养 21 d时，3 种苹果属植物生根
苗叶片的再生状况最佳;在菌液 OD600为 0． 5、浸染时间 9 min、共培养时间 3 d和潮霉素选择压 1. 0 mg /L 体系中抗
性芽诱导率最高。用 PCR和 RT-PCR对所获得的抗性芽检测，结果初步证实外源基因已成功导入长富 6 号并在转
录水平上表达。
关键词: 苹果属;不定芽;植株再生;遗传转化;根癌农杆菌
中图分类号: S661． 104． 3 文献标识码: A 文章编号: 1000-4440(2012)03-0643-05
Optimization of Malus plant regeneration system and establishment of ge-
netic transformation system for apple cultivar Nagafu No． 6
DU Xiao-li1， CHEN Xiu-kong1， ZHANG Ji-yu2， LUO Chang-guo1， DU Bei-bei1， LI Chun-xia1，
ZHANG Zhen1， QU Shen-chun1
(1． College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China;2． Institute of Botany，Jiangsu Province and the Chinese Academy of
Sciences，Nanjing 210014，China)
Abstract: Three Malus plants，Nagafu No． 6，M． hupehensis Rehd．，and M． robusta Rehd． were selected as mate-
rials to study their regeneration using rooted seedlings and secondary seedling leaves as explant，and the effect of different
dark culture time on regeneration was also investigated． The results showed that rooted seedlings of three Malus plant were
better for regeneration than secondary seedings when cultured in dark for 21 d． The factors effecting genetic transformation
for Nagafu No． 6 were discussed using rooted seedlings as explant，and hygromycin-resistant shoots were confirmed by PCR
and RT-PCR． The transformation efficiency was the highest when the explant was dipped in Agrobacterium tumefaciens solu-
tion with OD600 0． 5 for 9 min，and was co-cultured for 3 d in 1 mg /L hyg system． PCR and RT-PCR analysis confirmed
that the exogenous gene was transferred into Nagafu No． 6 and expressed in transcription level．
Key words: Malus;adventitious bud;plant regeneration;genetic transformation;Agrobacterium tumefaciens
苹果属植物是世界上大面积栽培的植物，长富
6 号是苹果属植物中性状优良，广受消费者喜爱的
苹果品种之一，但该品种易感病。因此，培育优质、
多抗性为一体的苹果新品种是栽培者的期望。但苹
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果属植物具有周期长，自交不亲和，高度杂合等特
点，用常规育种技术改良相对困难，通过转基因技术
直接导入抗性基因是提高苹果抗性最有效的途径之
一。农杆菌介导法操作简单，转化成功率较高，技术
较成熟，因此广泛运用在植物品种改良上［1-9］。但
是，该方法应用于苹果上的转化效率仍较低，主要原
因是苹果属植物再生体系和遗传转化体系尚不完
善。本试验在已建立的苹果属植物再生体系基础
上，对影响苹果属植物离体叶片再生的因素进行进
一步研究，旨在优化苹果属植物的再生体系，并对影
响根癌农杆菌转化苹果长富 6 号的各项因素进行研
究，优化各种参数，确定最佳转化条件，试图建立长
富 6 号的遗传转化体系，为进一步应用基因工程改
良长富 6 号提供基础。
1 材料与方法
1． 1 植物材料
供试 3 种苹果属植物材料均由南京农业大学果
树分子生物技术实验室提供。以长富 6 号、湖北海
棠和八棱海棠的无菌继代苗(未伸展的无根幼苗)
和生根苗(具有根、茎、叶的完整小植株)的叶片作
为不定芽诱导的受体材料。以长富 6 号无菌生根苗
的叶片作为长富 6 号遗传转化体系的受体材料。
1． 2 供试菌株
供试根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是
EHA105;植物表达载体是 pCAMBIA 1300，含广谱抗
性目的基因 MhTGA2 的质粒，该质粒携带有潮霉素
抗性的潮霉素磷酸转移酶基因。
1． 3 不定芽诱导方法
分别取供试 3 种苹果属植物继代培养和生根培
养 35 d的试管苗顶部展开的 2 ～ 4 片叶作为供试材
料。每个叶片垂直主脉横切 3 刀，不切断叶缘，以叶
片近轴面接触培养基的方式接种。湖北海棠接种于
MS + 6. 0 mg /L 6-BA +0. 5 mg /L NAA + 0. 2 mg /L
ZT + 6. 0 mg /L SNP培养基上［10］，八棱海棠接种于
MS + 4. 0 mg /L 6-BA + 0. 2 mg /L NAA 培养基
上［11］，长富 6 号接种于 MS + 8. 0 mg /L TDZ + 0. 5
mg /L NAA培养基上［12］。培养基附加 30 g /L蔗糖和
5. 5 g /L 琼脂粉。暗培养 21 d后转入光照培养。3种
苹果属植物生根苗叶片的暗培养时间分别设 7 d、14
d、21 d、28 d 4个处理。暗培养后转入光照培养。接
种培养 50 d后统计叶片的不定芽诱导频率和平均出
芽数。每个培养皿放 7 片叶，为 1 个处理，每个处理
重复 9次。不定芽诱导频率 =不定芽叶片数 /接种外
植体数 ×100%，叶片平均出芽数 =不定芽总数 /接种
外植体数。数据用 SPSS软件进行统计分析。
1． 4 长富 6 号遗传转化体系建立方法
取长富 6 号生根培养 35 d 的试管苗顶部展开
的第 2 ～ 4 片叶作为遗传转化受体材料，每个叶片
垂直主脉横切 3 刀，不切断叶缘，依次进行各因素筛
选试验。(1)菌液浓度和浸染时间筛选试验。将叶
片分别置于 OD600为 0. 1、0. 3、0. 5、0. 7 的根癌农杆
菌菌液中，各浓度分别浸染 5 min、7 min、9 min、11
min、13 min，浸染后用无菌吸水纸吸干外植体表面
的菌液，接种于共培养培养基(MS + 8. 0 mg /L TDZ
+ 0. 5 mg /L NAA) ，共培养 3 d 后接种于筛选培养
基(MS + 8. 0 mg /L TDZ + 0. 5 mg /L NAA + 3. 0
mg /L Hyg + 200. 0 mg /L Cb)。(2)共培养时间筛
选试验。在 OD600为 0. 5、菌液浸染 9 min条件下，分
别共培养 2 d、3 d、4 d、5 d 后，转入筛选培养基。
(3)在 OD600为 0. 5、菌液浸染 9 min、共培养 3 d条件
下，接种于筛选培养基［MS + 8. 0 mg /L TDZ + 0. 5
mg /L NAA +(0. 5 mg /L、1. 0 mg /L、2. 0 mg /L、3. 0
mg /L)Hyg + 200. 0 mg /L Cb］。每个培养皿放 7 ～
8 个叶片为 1 个处理，每个处理 15 个培养皿。暗培
养 21 d后转入光照培养，培养条件为 16 h (光)/8 h
(暗) ，光照度 2 000 ～ 3 000 lx，温度23 ～ 25 ℃。接
种 50 d 后将分化出的不定芽接种在继代培养基
(MS + 0. 6 mg /L 6-BA + 0. 1 mg /L NAA + 1. 0
mg /L Hyg + 200. 0 mg /L Cb)中进行继代培养。
1． 5 MhTGA2 基因的 PCR和 RT-PCR检测
取抗性植株叶片，置于含 50 mg /L卡那霉素
(Km)和 50 mg /L利福平(Rif)的固体 YEB 培养基，
黑暗培养 3 d，观察叶片周围有无农杆菌生长。选择
无农杆菌生长的叶片，使用 CTAB 法提取 DNA进行
PCR检测，提取 PCR 检测结果呈阳性植株的叶片
RNA，反转录成 cDNA 进行 PCR 检测。抗性芽诱导
率 =抗性芽数 /接种外植体数 × 100%。采用 SPSS
软件进行数据统计分析。
2 结 果
2． 1 苹果植株再生体系的优化
2． 1． 1 继代苗和生根苗叶片对诱导不定芽的影响
从表 1 可以看出，3 种苹果属植物以生根苗叶片
446 江 苏 农 业 学 报 2012 年 第 28 卷 第 3 期
为外植体，不定芽诱导频率和平均出芽数均优于以
继代苗为外植体。因此应选择生根苗的叶片作为苹
果属植物再生体系中的外植体。
表 1 不同类型苗的叶片对诱导不定芽的影响
Table 1 Effects of leaf types on adventitious bud induction of apple
苗类型
接种叶片数
(张)
湖北海棠
不定芽诱导频率
(%)
平均出芽数
(个)
八棱海棠
不定芽诱导频率
(%)
平均出芽数
(个)
长富 6 号
不定芽诱导频率
(%)
平均出芽数
(个)
继代苗 63 68． 3 2． 21 90． 4 3． 17 98． 4 5． 13
生根苗 63 82． 5 3． 67 100． 0 6． 36 100． 0 10． 25
2． 1． 2 培养时间对叶片诱导不定芽的影响 从表
2 可以看出，3 种苹果属植物不定芽诱导频率和平
均出芽数均随暗培养时间的延长而不断增加，暗培
养 21 d时，诱导频率和平均出芽数均达到最高，显
著高于其他暗培养时间。因此，苹果属植物离体叶
片诱导不定芽时暗培养时间应选择 21 d。
表 2 暗培养时间对叶片诱导不定芽的影响
Table 2 Effect of dark culture time on adventitious bud induction of apple leave
暗培养时间
(d)
接种叶片数
(张)
湖北海棠
不定芽诱导频率
(%)
平均出芽数
(个)
八棱海棠
不定芽诱导频率
(%)
平均出芽数
(个)
长富 6 号
不定芽诱导频率
(%)
平均出芽数
(个)
7 63 4． 76a 0． 11a 12． 70a 0． 21a 14． 29a 0． 25a
14 63 65． 08c 2． 23c 77． 78b 3． 13b 73． 02b 5． 05b
21 63 82． 54d 3． 67d 100． 00c 6． 36c 100． 00d 10． 25c
28 63 42． 86b 2． 03b 82． 54b 3． 25b 87． 30c 5． 35b
同列数字后小写字母不同表示差异达 0． 05 显著水平。
2． 2 长富 6 号遗传转化体系的优化
2． 2． 1 菌液浓度及浸染时间对转化效率的影响
从表 3 可以看出，长富 6 号叶片在菌液 OD600为
0. 5、浸染时间为 9 min条件下抗性芽诱导率显著高
于其他处理组，即该条件较适宜于长富 6 号的遗传
转化。
表 3 菌液浓度和浸染时间对长富 6 号叶片诱导抗性芽的影响
Table 3 Effect of bacterial concentration and infecttion duration on resistant shoots induction of Nagafu No． 6 leaves
菌液
OD600
浸染时间
(min)
抗性芽数 /接
种外植体数
抗性芽诱导率
(%)
菌液
OD600
浸染时间
(min)
抗性芽数 /接
种外植体数
抗性芽诱导率
(%)
0． 1 5 0 /103 0d 0． 5 5 1 /103 0． 97c
7 0 /103 0d 7 2 /103 1． 94b
9 0 /103 0d 9 5 /105 4． 76a
11 0 /103 0d 11 0 /105 0d
13 0 /103 0d 13 0 /103 0d
0． 3 5 0 /103 0d 0． 7 5 0 /103 0d
7 0 /105 0d 7 0 /103 0d
9 0 /105 0d 9 0 /103 0d
11 1 /105 0． 95c 11 0 /103 0d
13 1 /103 0． 97c 13 0 /103 0d
同列数字后小写字母不同表示差异达 0． 05 显著水平。
546杜小丽等:苹果属植物再生体系优化及长富 6 号遗传转化体系的建立
2． 2． 2 共培养时间对转化效率的影响 从表 4 可
以看出，随着共培养时间的延长，长富 6 号抗性芽
诱导率不断提高，但到第 4 d 时，农杆菌生长旺盛，
抑制了外植体不定芽的诱导发生，共培养 3 d 时抗
性芽诱导率最高。因此，共培养时间应选择为 3 d。
表 4 共培养时间对长富 6 号叶片诱导抗性芽的影响
Table 4 Effect of co-culture period on resistant shoots induction of Nagafu No． 6 leaves
共培养时间(d) 农杆菌状况 叶片褐化情况 抗性芽诱导率(%)
1 肉眼未见农杆菌菌落 无褐化现象 0c
2 肉眼未见农杆菌菌落 无褐化现象 0． 97b
3 有极少量的农杆菌单菌落 无褐化现象 4． 76a
4 30%的叶片被农杆菌覆盖 20%的叶片褐化 －
5 80%的叶片被农杆菌覆盖 50%的叶片褐化 －
同列数字后小写字母不同表示差异达 0． 05 显著水平。
2． 2． 3 潮霉素浓度对转化效率的影响 从表 5 可
以看出，潮霉素对苹果长富 6 号叶片不定芽的形成
有很强的抑制作用。当潮霉素浓度为 3. 0 mg /L时，
外植体不能正常出芽;在潮霉素浓度为 1. 0 mg /L，
抗性芽诱导率最高;0. 5 mg /L潮霉素的处理组外植
体出芽率显著高于 1. 0 mg /L潮霉素处理组，但抗性
芽诱导率显著低于 1. 0 mg /L的处理组。为保证转
化后外植体既能顺利出芽，又能有效筛选抗性芽，潮
霉素浓度应选择 1. 0 mg /L。
表 5 潮霉素浓度对长富 6 号叶片诱导抗性芽的影响
Table 5 Effect of hyg concentration on resistant shoots induction of
Nagafu No． 6 leaves
潮霉素浓度
(mg /L)
接种叶片数
(个)
出芽率
(%)
平均出芽数
(个)
抗性芽诱导率
(%)
0 63 100． 00a 10． 25a 0c
0． 5 105 65． 71b 1． 14b 0． 95b
1． 0 105 27． 62c 0． 58bc 4． 76a
2． 0 103 1． 94d 0． 02c 0． 97b
3． 0 100 0d 0c －
同列数字后小写字母不同表示差异达 0． 05 显著水平。
2． 3 转基因植株的 PCR和 RT-PCR检测
将获得的转化植株用 CTAB 法提取 DNA 进行
PCR扩增检测，结果扩增出 1 000 bp 左右的片段，
与目的片段 1 002 bp 大小一致 (图 1)。阴性对照
植株无目的条带出现，阳性对照和转化植株得到了
1 002 bp 的目的条带，初步证明目的基因已整合到
长富 6 号苹果基因组中。提取转化植株 RNA，反转
录成 cDNA，用 cDNA进行 PCR扩增，结果扩增出与
目的基因大小一致的片段(图 2) ，表明外源基因
MhTGA2 已在长富 6 号转录水平上表达。
M:Marker;WT为阴性对照，P为阳性对照，1、2、3、4 为转化植株。
图 1 转化植株 PCR检测
Fig． 1 PCR analysis of transgenic apple plant
M:Marker;WT为阴性对照，1、2、3、4 为转化植株。
图 2 转化植株 RT-PCR检测
Fig． 2 RT-PCR analysis of transgenic apple plant
3 结 论
目前苹果转基因的再生体系还不太成熟，转化
体系也不尽完善。本试验研究了苹果属植物的再生
体系和长富 6 号的遗传转化体系，结果表明:3 种苹
果属植物生根苗叶片的再生能力优于继代苗叶片;
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暗培养 21 d时，3 种苹果属植物生根苗叶片的再生
状况最佳。长富 6 号叶片在 OD600为 0. 5 的菌液中
浸染 9 min 后接种于共培养基(MS + 8. 0 mg /L
TDZ +0. 6 mg /L NAA)中培养 3 d，再转接种于筛选
培养基 (MS + 8. 0 mg /L TDZ + 0. 6 mg /L NAA +
1. 0 mg /L Hyg + 200. 0 mg /L Cb)中培养所得到的
抗性芽诱导率最高，达 4． 76%，均高于叶霞、刘建
国、刘庆忠等人［13-15］的研究结果。用 PCR 和 RT-
PCR对所获得的抗性芽进行检测，初步证明外源基
因已成功导入长富 6 号并在转录水平上表达，为进
一步研究苹果遗传转化奠定了基础。
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(责任编辑:汪恒英)
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