全 文 ：果 树 学 报 2 0 0 4 , 2 1 ( 4 ) : 3 8 5一 3 8 7
J o u r n a l o f Fm i
t S
e i e n e e
苹果属 R N A 高效快速提取新方法
王壮伟 渠慎春 章 镇 ’ 张君毅
(南京农业大学 园艺学院 , 江苏南京 21 0 095 )
摘 要 : 研究开发了一种新的适用于苹果属组培苗总 R N A 快速 、 高效地提取方法 。采用此方法可 以在 3一 4 h 内得到
质量高 、 产量大 、 完整性好 、 无 D N A 污染 的苹果组培苗 的总 R N A 。
关键词 : 苹果属 ; 组培苗 ; 总 R N A ; 提取方法
中图分类号 : 56 61 . 1 文献标识码 : A 文章编号 : 10 09 一99 80 (2 0 04 )04一 385 一 03
A F 8 s t M e t h o d of r T 0 t 8 l R N A E x t r a e t i 0 l F r 0 m t h e T i s S u e C u l t u r e M a t e
-
r i a l o f M d lu s s P
·
W a n g Z h u a n缈 e i , Q u S h e n e h u n , Zh a n g Zh e n ` , a n d Z h a n g J u n y i
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o l l e邵 of oH rt i e u l t u er , 八初夕i咭 A邵 e u l t u r以 nU i v e rs i仃 , 刀心公i鳍 , iJ al 诬召s u 2 10 0夕万hC ￡n a)
A加tr a e t : A fa s t e if e ie n t m e th o d fo r t o t a l RN A e x t r a e t io n fro m th e m a t e ir a l o f 乃l d l us in t i s s u e e u l t u re w a s d e v e lo P e d in a e -
e o rd a n e e w it h th e P ir n e i p l e o f R N A e x t r a e t i o n a n d p u ir if e at i o n
.
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e t o t al R N A w it h th e h ihg q
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,
i n t e邵 a l iyt a n d d e e o n -
t a m i n at e d o f DN A w a s o b t a i n e d in 3一 4 h
.
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ld b e u s e d t o th e R T 一P C R , N o rt h e nr b lo t a n d t h e e o n s tur e t io n o f e D N A 11-
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K e y W o r d s
: 月f口 Zu s M il l . ; iT s s u e e u lut er ; T o t a l RN A ; E x t r a e t i o n m e th o d
分离和提纯苹果组培苗中的总 R N A 是进行苹
果属转基因植物分子鉴定的基础 。 由于苹果属植物
含有大量的多糖及酚类物质 ,常规植物组织总 RN A
的提取方法 , 在质和量上常常不能满足要求 ,这 主
要归咎于很多因素 (如材料 的不 同 ,器具不洁净 ,操
作不严等 )造成 R N A 的降解 ,而且提取不同材料 中
R N A 的最适宜条件及相应的方法也不尽相同 。 近年
来 ,关于富含多糖 、多酚植物组织 R N A 的提取有不
少报道 1[ 周 ,但这些方法都在一定程度上存在费时 、
费力等缺点 。 本研究针对这一问题 , 综合 国内外发
表的有关木本植物组织 的 R N A 提取方法 , 试验建
立 了一 种快速 有效 的适 宜苹果 属植 物组 培苗 的
R N A 提取方法 。
1 材料和方法
L l 材料
以富士 、嘎拉 、 红星 3 个品种的苹果 口五汉us d o -
m e 、 ti。 a B o ht )
、八棱海棠 (肥司u 、 m i e : o m滋 u 、 M a k i n o ) 、
珠美海棠 (肥成us o m i) 等苹果属植物组培苗为实验
材料 。
L Z 实验试剂
R N A 提取缓冲液 14 0 rn m o l / L N a C I , 1 0 m m o l / L
E D T A
,
5 0 m m o l / L T
r i s H C I
,
p H 8
.
0
,
1% ( w / v ) S D S :
3 m o l / L K A C ( p H 4
.
8 ) : 3 m o l / L N a A e (p H S
.
2 ) ; 水饱
和 酚 ( p H 4 . 5 ) ; 氯仿 ; 无水 乙 醇 ; 异戊 醇 ; D E P C 处
理水 ;水不溶性 P V P ; T r i z o l ;异丙醇 。
L 3 总 R N A 的提取
方法 I : 分别取 10 0 ~ 2 0 0 m g 的苹果属植物组培
苗的叶和茎放人研钵 中 ,加人少量的 P V P ,液氮研
磨后放人 2 m L 的离心管中 , 迅速加人 60 林 L 提取
液 ,然后依次加人等体积 的水饱和酚 ( p H .4 5) , 1/ 4
体 积 的氯 仿 , 3% 的 p 一琉基 乙 醇 , 巧 % 的无 水 乙
醇 。 充分混匀 , 旋涡振荡 3 m in , 4 ℃静置 20 m i n ; 4
℃ , 12 0 0 0 r/ m i n 离心 7 m i n ; 取上清加人另一个 2
m L 的离心管 中 , 再加人等体积的水饱和酚 , 15/ 体
积 的 3 m o l / L K A c ,旋 涡振荡 4 m i n 后 ,加人 1 / 3 体
积的氯仿 , 充分混匀 , 4 ℃ , 12 0 0 0 r/ m i n 离心 5 m i n :
取上清 , 加人等体积的氯仿 :异戊醇 ( 24 : 1 ) ,混匀 , 4
℃ , 12 0 0 0 r/ m i n 离心 1 0 m i n ;取上清 , 重复 2一 3 次 ,
以蛋 白不 出现为止 ; 加人 2 .5 倍体积 的无水乙醇和
收稿 日期 : 2 0 03 一 12一 2 9 接受 日期 : 2 0 04 一05 一 10
基金项 目 : 国家 自然科学基金项 目 ( 30 37 0 9 8 7 ) , 江苏省应用基础项 目 (BJ Z OO01 8 ) 。
作者简介 : 王壮伟 , 女 , 硕士 。
* 通讯作者 。 A u th o r fo r e o re s p o n d e n e e .
DOI : 10. 13925 /j . cnki . gsxb. 2004. 04. 026
2 1卷
1 /10 体积的 3m l o /LNa Ac ,充分混匀 , 一20 ℃或一70 ℃
放置 l h ; 4 ℃ , 12 00 r/ rn i n 离心 15 m i n ;弃上清 ,用
70 % 的无水乙醇洗沉淀 2 次 ,室温干燥 10 血 n , 溶于
30 林L D E P c 处理的 d H ZO 中 , 一70 ℃保存备用 。
方法 11 : 系用加拿大 B i o B a s i e In e .生产 的 T r i z o l
提取液 ,提取方法参照其说明书进行 。
1
.
4 R T 一P C R
参 照 A e e e s s R T 一 P C R In t or d u e t o卿 s y s t e m k i t
( rP o m ge a )试剂盒说明书进行 。
1
.
5 R N A 转膜
参照 《分子克隆实验指南 》第 3 版 (萨姆布鲁克
等编著 )的方法 问 ,总 R N A 在 甲醛变性 的 1 . 2%琼脂
糖凝胶中 s v/ c m 电泳 3一 4 h ,然后进行转膜 。
2 结果与分析
.2 1 R N A 质量分析
分别取不 同苹果属组织培养植株茎 、 叶等组织
2 0 0 m g
,用方法 I 提取 的 RN A , 可产出总 R N A 2 0 -
30 协g ,能进行 1一 2 次 N o rt he m 杂交分析 。 而且所有
样 品的 O D 么引/ O D 280 值均在 1 . 8一 2 . 1 之间 , O D Z扩O D 23。
的值均大于 .2 0 。 表明此方法提取苹果属组织培养
植株的总 R N A ,不但能得到高质量的 RN A ,而且提
取的效率较高 。 图 1是八棱海棠组培苗不同继代时
间的总 R N A 提取的电泳结果 , 用此方法从不同继
代时间的组培苗中都得到 了高质量的 RN A 。 图 2
是从 5 种不 同苹果属植物组培苗的茎 和叶片中提
取 的总 R N A 在 1 . 2%琼脂糖凝胶 中的电泳检测结
果 , 可以观测到 2 8 5 r R N A 、 1 8 5 r RN A 、 5 . 8 5 r R N A 3
条清晰的条带 , 而且没有 DN A 的污染 ,表 明所提取
的 R N A 样品较为完整 ,基本无降解 。 图 3 是我们用
rT iz ol 方法从 5 种不同苹果属植物的茎和叶片中提
取 的总 RN A 在 1 . 2% 琼脂糖凝胶 中的 电泳检 测结
果 , 可以看出此方法难 以得 到高质量完整的 R N A 。
因此在后续试验 中系用方法 I 提取的总 RN A 。
图 2 不同苹果种类的组培 苗 R N A 提取电泳结果
1
. 八棱海棠的叶片 ; 2 . 八棱海棠的茎 ; 3 .富士叶片 ; 4 .富士茎 ;
5
.嘎拉叶片 ; 6 . 嘎拉茎 ; 7 . 红星叶片 ; 8 . 红 星茎 ; 9 . 珠美海棠植株
F ig
.
2 T h e a g a
r o s e g e l e l e c tr o Ph o r e s i s o f t o t a l R N A
e x t r a e et d fr o m it s s u e o f v a r i o u s a PP le c u lt iv a r s
1
.
L e af o f」入 12哪 m i e or m 心哪 ; 2 . S r e m 叮尘】尹口22乙s m i e or m以 u s ; 3 . l e a { Of
F t lj i : 4
.
S t e m o f F uj i : 5
.
L e a f o f G a la ; 6
.
S t e m o f G a la : 7 L e af o f Re d
s t a r ; 8
.
S t e m of R e d s t ar ; 9
.
T i s s u e o f 粗“ l哪 艺 u n z i
图 3 T ir z ol 法提取 不同苹果品种组培苗 R入A
提取电泳图谱
1
. 八棱海棠叶片 ; 2 . 八棱海棠茎 ; 3 .富士叶片 ; 4 富士茎 ; 5 . 嘎拉 叶
片 ; 6 . 嘎拉茎 ; 7 .红星叶片 ; 8 . 红 星茎 ; 9 . 珠美海棠叶片 ;
1住珠 美海棠茎
F i g
.
3 T h e a g a or s e g e l e le e t r 0 P l
l o r e s is o f ot at l R N A
e xt ar c et d fl
, o m t is s u e c t l lot l , e o f v a r i o su a P le ist su se w it ll 城 2 01
1
.
L e af of
J门五汉哪 m i e or m滋 u s ; 2 . St e m o f i树口 l哪 m i e or m以琳 3 . L e af o f
Fuj i ; 4
.
St e m o f F uj i : 5
.
L e af o f G a l a ; 6
.
S t e m o f G a l a : 7
.
L e a f o f R e d
st ar ; 8
.
St e m fO eR d st ar
: 9
.玩 af 试 限2己su z um i ; 10 . St e m of M dl zis 么u m i .
图 1 八棱海棠组培苗不 同继代时间的总 R N A
提取 电泳结果
1
. 继代 3 O d 苗木的 计卜片 ; 2 . 继代 3 0 d 苗木 的茎 ; 3 . 继代 4 0 d 苗木的
汁卜片 ; 4 . 继代 4 O d 苗木的茎 ; 5 . 继代 6 O d 苗木的叶片
F i g
.
1 T h e a g a
r o s e g e l e l e e tr o P h o r e s i s o f t o t a I R N A
e x t r a e t e d fr o m it s s u e c u l t u r e s e e id in g o f 几翻 lu s m ic or m a lu s
i n th e v a r i o u s s u b e u l ut r e d a y s
1
.
L e af o f s u b e u l一u er 3 O d ; 2
.
s t e m o f s u b e u i r u
r e 30 d : 3 L e af of
s u b e u l t u er 4 0 d : 4
.
s t e m o f s u b e u l t u r e 4 0 d : 5
.
L e af o f s u b e u l t u er 6 O d
2
.
2 R T 一 P C R 分析
R T一 PC R 是转基 因植物分子鉴定的重要方法之
一 ,它对 R NA 的纯度和质量都有较高的要求 , 特别
是 DN A 的污染问题要求更高 。 图 4 系我们用一对特
异引物对转 基因八棱海棠进行 R T 一 P C R 分析 的结
果 ,可看出电泳条带清晰一致 ,而且同样 的 R N A 模
板量表达量不同的株系能明显分开 ,说明方法 I 提取
的 R N A 样品适宜 l不r- P C R 的定性和定量分析 。
.2 3 R N A 的转膜
4期 王壮伟等 :苹果属 R N A高效快速提取新方法
图 4不同转基 因八棱海棠株系 R T一 P C R分析
1
.分子量标记 ; 2一 6 .转基 因株系
F ig
.
4 R T一 p C R am p l ifi c a ti o n o f t he d ie fe r n t t r a ns ge ni c
l ie n s in再匆 u l sm ci rom au l s
IM
o
l
e e u
l
a r we ig h tm
a rke r ; 2一 6
.
D ie f
re n t t ra n s ge n ie l ine s
以八棱 海棠 、 富士 、 嘎拉等品种组培苗的叶和
茎的总 R N A为材料进行 R N A转膜 ,转膜结果如图
5
, 可以看 出转在尼龙膜上 的 RN A 条带 比较清晰 ,
可 以用来进行 N o rt he m 杂交分析及其它分子生物
学操作 。
育 ,体内的生长代谢不同于一般 田间生长的植株 。在
本试验的最初阶段 , 我们曾尝试用 S D S一 rT i S 饱和酚
法 4[] 和 irT oz l 法来 提取苹果组培苗 中的 R N A ,但结
果前者提取的 R N A 虽然条带较清晰 ,但 DN A 的污
染总是难以去除干净 ; 而用 rT ioz l 法提取 R N A ,难
以得到完整 的 R N A 。 方法 I 是我们在借鉴有关报
道 2[ 叫 ,使用水不溶性 PV P 和琉基 乙醇 ,来防止酚类
化合物的氧化变色 ; 加人 14 0 m m o F L N a C I , 去除
DN A 对 R N A 提取污染基础上 , 采用酸性酚使 D N A
变性幽 ,并结合进行了 2 次长时间旋涡强烈振荡 ,
不但加速了蛋白质的变性 , 而且使氯仿对一些次生
物质的萃取更加彻底 , 同时还可以使 D N A 断裂成小
片段 ,达到了完全去除 D N A 污染的 目的 ,实践证明
旋涡振荡的时间长短对 D N A 的去除有较大的影响 。
在多糖的去除上 , 采用无水乙 醇和 K A c ,不但有效
地去除了多糖 , 而且 K 离子还能促进 SD S一蛋白质
复合物的沉淀 , 减少了 S D S 的污染 。 此方法提取
RN A 不但方法简便易于操作 , 而且提取成本较低 ,
更重要的是节省时间 ,一般提取一个样品只需 3 h 左
右 ,也减少 了 R N A 降解 的机会 。
图 5 R N A 转膜
1
. 八棱海棠叶片 ; 2 . 八棱海棠茎 ; 3 .富士 叶片 ; 4 . 富士茎 ;
5
. 嘎拉 叶片 ; 6 . 嘎拉茎
F ig
.
5 R N A tr a n s fe r er d ot ny l
o n m e
n l
b
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1
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St e m 成 ujF i : 5
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3 讨 论
苹果组培苗 由于长期处于离体条件下生长发
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