全 文 ：西北农业学报　 2004, 13( 1): 84～ 88
Acta Ag riculturae Bo reali-occidentalis Sinica
RAPD-PCR对梨属植物品种鉴定的研究
马兵钢 ,牛建新 ,潘立忠 ,鲁晓燕 ,冯建荣
(石河子大学农学院园艺系 ,新疆石河子　 832003)
摘　要: 用 RAPD-PCR技术分析鉴定了梨属的 18份品种材料 (包括不同品种、杂交种和芽变种材料 )。从 OP
系列 8组共 160个 10碱基随机引物中 ,筛选出 12种能很好地用于梨品种鉴定的引物。
关键词: RAPD-PCR; 梨属 ; 品种鉴定 ; 分子标记
中图分类号: S661. 2　　　　文献标识码: A　　　　　文章编号 : 1004-1389( 2004) 01-0084-05
Study on Identif ication of Main Cultivars inPyrus by RAPD-PCR
M A Bing-gang, N IU Jian-xin, PAN Li-zhong, LU Xiao-yan, FENG Jian-rong
( Department of Horticultu re, College of Agriculture, Shihezi University, Shihezi Xin jiang　 832003, China) )
Abstract: The 18 samples of main pear cultivars in Pyrus which included 5 species, 3 hybrids and 3 sports
ma terials f rom Xinjiang region w ere identified and analysed by RAPD-PCR molecular markers method.
The results indicated tha t 12 primers f rom screening of 160 randon decamer olig onucleotide primers could
be good used in identification of the pea r materials, and the results could be also used further in phy logeny
analysis.
Key words: RAPD-PCR; Pyrus; Cultivars identification; Molecular markers
　　在品种鉴别方面 ,以往主要采用比较植株的
形态 ,并结合细胞学、孢粉学和生理生化特征的方
法 ,这种方法带有局限性 ,很难对果树品种进行准
确的鉴定与分类。 分子标记所揭示的多态性是其
它标记所不能比拟的 ,并可作为新品种登记注册
和产权保护的重要依据。果树无性繁殖 ,新老品种
数量繁多 ,极易造成同物异名及同名异物现象 ,使
用分子标记技术鉴别果树品种 ,涉及越桔 [1 ]、油橄
榄 [2 ]、红树莓 [3 ]、苹果 [4 ]、梨、桃 [5 ]、柑桔 [6 ]、葡萄 [7 ]、
柿 [8 ]、樱桃 [ 9]、草莓 [10 ]、欧洲李、阿月浑子、番荔枝、
番木瓜、枣 [11 ]、核桃 [12 ]、杏 [13 ]、桑 [14 ]等多种果树。
罗正荣等 [8 ]的研究结果表明 ,在柿品种鉴定中 ,
RAPD技术比同工酶更为有效 ,仅用 1个引物就
能区分供试的 15个品种 ,甚至可能鉴别芽变品
种。利用 RAPD, Yang等 [ 9]鉴定了经 X-射线处理
获得的一个樱桃的同质突变体。 我国是世界梨树
主要原产地之一 ,梨属植物种类较多。由于长期的
驯化栽培 ,品种类型尤其丰实 ,梨属植物种间杂交
容易获得可育的后代 ,因此有关梨属的分类阶元
和不同种的地位安排一直存在争议。 本实验用
RAPD分析梨属 5个种及它们的一些杂种、芽变
共 18个品种 ,以期为验证目前新疆栽培广泛的梨
属几个种的分类安排及其进一步利用奠定基础。
1　材料与方法
1. 1　植物材料
用于 RAPD实验提取 DNA的全部植物材料
于 2000年 8月取自库尔勒香梨原产地库尔勒地
区农二师农科所及沙依东园艺场 (表 1)。取叶片
用液 N携回实验室 ,分别提取基因组 DNA。
收稿日期: 2003-07-02　　修回日期: 2003-09-25
基金项目:新疆兵团科研项目 (N KB99SDXNK04NY)
作者简介:马兵钢 ( 1972-) ,男 ,讲师 ,在读博士 ,主要从事果树生物技术研究。 Email: binggang@ hotmail. com
表 1　用于梨属 RAPD鉴定的材料
Table 1　 Samples used in RAPD analysis of Pyrus
OT U
样本
Samples
OTU
样本
Samples
1
大香水
P. ussriensis Maxim. cv. Daxiangshui 10
苹果梨
P . pyri fol ia Nakai cv. Pingguoli
2
红南果
P. ussriensis Maxim. cv. Hongnanguo 11
新梨 1号
P . sinkiangensis Yu cv. XIN-liyih ao
3
京白梨
P. ussriensis Maxim. cv. Jingbai 12
新梨 6号
P . sinkiangensis Yu cv. XIN-li liuh ao
4
石井早生
P. p yr ifolia Nakai cv. Shijw ase
13
砀山梨
P .bretschneid eri Rehd. cv. DANGSHAN-suli
5
苍溪梨
P. p yr ifolia Nakai cv. CANGXI-li
14
鸭梨
P .bretschneid eri Rehd. cv. Yali
6
身不知
P. communis L. cv. Sh enbuzhi
15
鸭梨 4倍体
P .bretschneid eri Rehd. cv. Yali sibeiti
7
巴梨
P. communis L. cv. Bart lete 16
香梨
P . sinkiangensis Yu cv. Kurle f rag rant pear
8
句句梨
P. sinkiangensis Yu cv. Jujuli 17
新梨 2号
P . sinkiangensis Yu cv. XIN-lierhao
9
早酥梨
P. p yr ifolia Nakai cv. Zaosuli 18
沙 01
P . sinkiangensis Yu cv. SHA-lingyi
1. 2　引　物
用于 RAPD分析的引物为 OPERON公司的
10碱基引物 ,均购自北京双旋生物工程有限公
司。供筛选引物包括 OPD1-20、 OPF1-20、 OPG1-
2、 OPJ1-20、 OPQ1-20、 OPT1-20、 OPV 1-20、
O PW1-20共 8组 160个 ,选出用于品种鉴定分析
的引物包括 OPD16、 OPD19、 O PG09、 OPG16、
O PG17、 OPG18、 O PQ18、 OPV10、 OPV12、
O PV16、 OPV 18、OPW03共 12种 ,其序列见表 2。
表 2　 RAPD-PCR引物及其序列
Table 2　RAPD-PCR pr imers and their sequences
引物
Primers
序列 (5 - 3 )
Sequences ( 5 to3 )
引物
Primers
序列 ( 5 - 3 )
Sequences ( 5 to3 )
OPD16 AGGGCGT AAG OPQ18 AGGCTGGGT G
OPD19 CTGGGGACT T OPV 10 GGACCTGCTG
OPG09 CTGACGTCAC OPV 12 ACCCCCGACT
OPG16 AGCGTCCTCC OPV 16 ACACCCCACA
OPG17 ACGACCGACA OPV 18 TGGTGGCGT T
OPG18 GGCTCATGTG OPW03 GTCCGGAGTG
1. 3　总 DNA提取与纯化
参照文献 [15 ]的方法。
1. 4　RAPD-PCR
参 照 文献 [ 16 ]的 方法 , PCR在 SABC
Thinker SeriesII水浴式热循环仪上进行 ,反应条
件为: 94℃预变性 3 min; 然后 94℃ 1 min, 36℃ 1
min, 72℃ 2 min共 43个循环 ,最后 72℃延伸 10
min。 在 25μL反应体系中含 10 mmol /L Tris-
HCl, pH 8. 3; 50 mmol /L KCl; 0. 001% Gelatin;
2. 5 mmol /L MgCl2 ; 200 μmol/L dN TPs; 0. 5
μmol /L 10-mer primer; 1. 25U Taq polymerase(购
自华美生物工程公司 ) ; 20 ng模板 DNA。并添加
BSA6μg+ 甘油 1% + DMSO 5%优化反应体系。
1. 5　 PCR产物鉴定与记录
PCR产物用 1. 5%琼脂糖 ( Promega公司 )凝
胶 (含 0. 5μg /mL EB)在 0. 5× TBE中分离与鉴
定 ,在 WD-9403C紫外透射仪上观察 ,在 GDS-
7600数字图像分析系统中照相分析。 DNA分子
量标准采用 SABC的 PCR M arkers [ M: ( 1) 1543
( 2) 994( 3) 697( 4) 515( 5) 377( 6) 237]。
2　结果与分析
进行筛选引物有 12种引物能较好地对梨属
18份材料进行多态扩增。共扩增 133条带 ,平均
每个引物扩增约 11条带 (图 1～ 7) ,其中 14条带
为所有材料的共有带 ,有 119个多态位点 (占 89.
47% ) ,表现出丰富的遗传变异。 种的专一带虽不
多 ,但可提供该种在梨属内系统位置的信息。大部
分多态位点为几个种的大多数个体共有 ,同一种
的个体具有相似的 RAPD式样 ,属于同一居群的
个体之间相似性更大。
·85·1期　　　　　　　　　　　　　马兵钢等 : RAPD-PCR对梨属植物品种鉴定的研究　　　　　　　　　　　　　　
2. 1　梨属下的种间鉴定
所 选 试 材 中 , 句 句 梨 属 新 疆 梨 ( P.
sinkiangensis Yu. )、砀山梨和鸭梨属白梨 ( P.
bretschneideri Rehd. )、苍溪梨和石井早生属砂梨
( P. pyrifolia Nak. )、身不知和巴梨属西洋梨 ( P.
communis L. )、红南果及京白梨、大香水属秋子梨
(P. ussriensis Max )。 此外鸭梨 4倍体是鸭梨的芽
变 ,新梨 2号、沙 01是库尔勒香梨的已命名芽变
品种 ,新梨 1号由香梨与砀山梨杂交培育而成 ,新
梨 6号由香梨与苹果梨杂交培育而成 ,早酥梨是
苹果梨和身不知的杂交品种 ,库尔勒香梨分别被
认为属于白梨系、新疆梨系。苹果梨分别被认为属
于白梨系统、砂梨系统、新疆梨系统 ,还有认为苹
果梨是秋子梨与砂梨的杂交种。 用所选择的引物
对它们进行扩增 ,均能用于品种鉴定 ,如 O PV18
(图 1)、 OPV 12(图 2)、 OPW03(图 3)、 OPD16(图
4)、 OPD19(图 5)、 OPG16(图 6)、 OPG17(图 7)等
引物对供试材料均能表现较好的多态性。
1～ 18所示样本见正文表 1, M:见正文。 图 2～ 图 7同此
Line 1～ 18. samples see table 1 in tex t; Line M. SABC PCR mark er, Fig. 2 to Fig. 7 are the same as i t.
图 1　OPV18扩增的 RAPD图谱
Fig. 1　Map of RAPD ampl if ied by primer OPV18
图 2　OPV12扩增的 RAPD图谱
Fig. 2　Map of RAPD ampl if ied by primer OPV12
图 3　 OPW03扩增的 RAPD图谱
Fig. 3　Map of RAPD ampl if ied by primer OPW03
·86· 西　北　农　业　学　报 13卷
图 4　OPD16扩增的 RAPD图谱
Fig. 4　Map of RAPD ampl if ied by primer OPD16
图 5　OPD19扩增的 RAPD图谱
Fig. 5　Map of RAPD ampl if ied by primer OPD19
图 6　OPG16扩增的 RAPD图谱
Fig. 6　Map of RAPD ampl if ied by primer OPG16
图 7　OPG17扩增的 RAPD图谱
Fig. 7　Map of RAPD ampl if ied by primer OPG17
·87·1期　　　　　　　　　　　　　马兵钢等 : RAPD-PCR对梨属植物品种鉴定的研究　　　　　　　　　　　　　　
2. 2　种内不同品种间鉴定
具体到种内鉴别上 , O PV18扩增结果表明:
秋子梨系的大香水较红南果和京白梨多一条约
1 100 bp带 ,砂梨系的石井早生较苍溪梨少一条
约 1 500 bp带 ,西洋梨的身不知较巴梨少约 1 500
bp和 994 bp的两条带 ,白梨系的鸭梨较砀山梨多
一条约 1 600 bp带而少一条约 1 000 bp带 ,而新
疆梨系的句句梨较前者均少一条约 2 000 bp带。
引物 OPV18在红南果与京白梨之间、石井早生
与身不知之间扩增谱带差异不明显 ,对香梨扩增
效果不理想。 除此之外 ,对其余 13个品种均能较
好区分。 OPV 12除在鸭梨和鸭梨 4倍体之间、新
梨 2号和沙 01之间扩增谱带无差异外 ,对其余
14个品种能很好区分。 OPW03除对香梨、新梨 2
号和沙 01扩增谱带不理想外 ,对其余 15个品种
可较好区分。 OPD16除在石井早生与苍溪梨之
间、身不知与巴梨之间扩增谱带无差异外 ,对其余
14个品种能很好区分。 OPD19除不能体现新梨 2
号和沙 01的差异外 ,能很好地区分其余 16个品
种。 O PG16在鸭梨和鸭梨 4倍体之间、新梨 2号
和沙 01之间表现一致的谱带 ,而对其余 14个品
种可很好地区分 ,表现出十分丰富、清晰的条带。
O PG17除了在香梨和沙 01之间谱带一致外 ,能
很好地区分其余 16个品种 ,且谱带十分丰富、清
晰。
2. 3　几个芽变的区分
引物 OPD16(图 4)可用于区分供试材料中的
3个芽变。 其中鸭梨 4倍体较鸭梨少一条约
2200bp带而多一条约 800 bp带。香梨较新梨 2号
和沙 01少约 2 200 bp、 2 100 bp和 1100 bp三条
带 ,而沙 01又较新梨 2号少一条约 1 100 bp带。
3　讨　论
RAPD分析因为使用 10碱基引物 ,扩增中存
在结果不一致现象 ,但如果严格控制反应条件 ,用
其做品种鉴定是一种相对有效、方便、成本较低的
方法。本实验中对不同种、品种之间进行鉴定的引
物较易筛选 ,效果明显。而对于香梨的芽变之间鉴
定相对困难。在筛选了大量的引物之后 ,得到了
12个能较好地对梨属 18个品种 (包括 5个种及 3
个杂交品种、 3个芽变品种 )进行多态扩增的引
物。 进一步对梨属下不同种、品种的鉴定可用
RAPD构建指纹图谱 ,以建立系统的品种鉴定库。
如能构建 AFLP指纹图谱库 ,将会得到更准确的
结果。
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