全 文 ：*基金项目!北京市重点实验室果树逆境生理与分子生物学实验室#资助和教育部优秀教师教科奖励基金资助$
曹冬梅!女%1971年12月生% 博士研究生% 副研究员$
**通讯作者$ Authorforcorespondence.E-mail:
收稿日期!2003-01-7接受日期!2003-03-21
农业生物技术学报 JournalofAgriculturalBiotechnology 2004,12 (3):345~346
&研究简报&
苹果属小金海棠Fe(!)转运蛋白基因的克隆和序列分析*
曹冬梅 韩振海** 许雪峰
’ 中国农业大学园艺植物研究所%北京100094(
关键词：苹果属小金海棠;Fe(!)-transporter基因
CloningofFe(!)-transporterGeneinMalusxiaojinensisandItsSequenceAnalysis
CAODong-MeiHANZhen-HaiXUXue-Feng
(InstituteofHorticulturalPlants,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094,China)
Malusxiaojinensis;Fe(!)-transportercDNA
1986年%Romheld和 Marschner首先提出高等植物在长
期适应缺铁胁迫过程中逐渐形成的两种适应性机理[1]$ 在缺
铁胁迫的条件下 % 机理植物通过激活一种特异的
H+-ATPase而使土壤酸化[2]%并通过一种特异的根部还原酶将
Fe’ #( 还原成 Fe($)$ 之后 Fe(%)通过它的转运蛋白
! Transporter( 跨越根部的细胞质膜而被转运[2]$ 高等植物的
#$Fe(&)-transporter基因是从拟南芥中克隆到的[3]%小
金海棠是苹果属植物中的一种铁高效基因型[4]$ 本研究的目
的是分离和克隆小金海棠 Fe(’)transporter基因$
1 材料和方法
1.1 材料
供试材料为苹果属小金海棠 ’ MalusxiaojinensisCheng
etJiang( $
1.2 方法
1.2.1 Southern和Northern杂交 据文献[5]转膜%尼龙膜于
%&’()*[0.25mol/LNa2PO4(pH7.2),7%SDS,1%BSA,
1mmol/LEDTA]中于 65+预杂交 30min后%加入探针%65,
-.20~24h$ 洗膜条件如下!2!!SSC%0.1%SDS%55/洗膜
30min)1!SSC%0.1%SDS,650洗膜 30min$ !701放射自
2348~72h$
1.2.2 缺 铁 小 金 海 棠 cDNA 文 库 的 构 建 按 照
SMARTTMcDNA合成试剂盒’ Clontech公司( 的使用说明 %
456789:
1.2.3 cDNA文库滴度的测定以及 cDNA文库的铺板和转
; 文库滴度的测定按试剂盒的使用说明$ 铺板方法及嗜斑
原位杂交按文献[5]$
1.2.4 探针标记 以玉米中克隆的Fe()-transportercDNA
<=>? @ABCDEFGHI JKLMNOP Prime-Gene
LabelingSystem,Promega,Madison,WI,USA( $ -32P-dCTP
(3000Ci/mmol)购自北京亚辉生物工程公司$
1.2.5 酶切鉴定 按试剂盒的说明将阳性噬斑进行体内切
QRSTUVWXYZ[\]^DNA进行酶切鉴定$
1.2.6 序列分析及同源性比较 DNA序列由人工测序或自
_‘ab c defgh ijk lmnopqrstNCBI
BLAST和Genedoc程序中进行$
2 结果和分析
2.1 Southern杂交分析
提取小金海棠叶基因组 DNA%经完全酶切后转膜%用标
uvwxFe())-transporter为探针进行 Southern杂交%杂交
yz{ |1( 显示!用不同的限制性内切酶酶切的 DNA均有
}~
Fe(*)
-transportercDNA同源的一个基因$
2.2 Northern杂交分析
提取小金海棠根以及缺铁处理后不同天数的根系
RNA%转膜后用玉米 Fe(+)-transporter为探针进行 Northern
杂交分析%结果’ 图 2( 表明在缺铁处理后 3d和 6d的根系
农 业 生 物 技 术 学 报 2004年
RNA有杂交信号,而正常供铁和缺铁 1d的根系 RNA无杂交
!! 由此也可以推测,缺铁处理可以诱导小金海棠 Fe(!)-
transporter基因的表达
图1.玉米Fe()-transporter基
因对小金海棠基因组的
Southern杂交分析
Fig.1.Southernblotinganalysis
ofMalusxiaojinensisusingcorn
Fe(#)-ransporterasaprobe
1,M.xiaojinensisDNAdigestedwithEcoR$# 2,M.xiaojinensisDNAdigested
withHind%;3,M.xiaojinensisDNAdigestedwithXho&.
图2.玉米Fe(’)-
transporter基因对小金
海棠RNA的Northern
杂交分析
Fig.2.Northernbloting
analysisusingcornFe
( )-transporterasaprobe
1,control;2,Fe-deficienttreatedfor1d;3,Fe-deficienttreatedfor3d;4,
Fe-deficienttreatedfor6d.
2.3 筛库结果
缺铁小金海棠根 cDNA文库的滴度经测定为 6.4#108
pfu/mL! 用 !-32P-dCTP标记的玉米 Fe())-transporter为探
$%&120000pfu进行了筛选!经过第一轮筛选共获得了 15
个侯选阳性噬斑 从筛选过程中发现噬菌体铺板密度以中等
$ 10000~15000pfu% 为佳!这样挑斑时不会造成噬斑太杂!
*+,-./0123456789 :;<=>?@ABC
第 2轮和第 3轮筛选!最后获得 4个单一的阳性克隆 cDNA&
’()4个阳性斑经体内切割成含有 cDNA片段的环化噬
*+,-./pTF1’pTF2’pTF3和pTF4 为了鉴定各噬菌粒
0cDNA片段的长度! 用 sfiD对 4个阳性克隆进行酶切!由
酶切结果可知(pTF1’pTF3和 pTF4的 cDNA片段长约 500
bp!pTF2的 cDNA片段长约 800bp!选其中的 pTF1和 pTF2
1234567
2.4 测序结果
对pTF1和pTF2cDNA序列进行了测定&根据测序的结
果! 将所得序列在 GenBank中进行同源性比较!pTF1长为
439bp$ 图 3划线部分% !pTF2长为 763bp$ 图 3% !属于小
EFGFe(H)-transporter基因的两个不同长度的基因片段!
是同一个基因&和豌豆的 Fe(I)-transporter基因的同源性达
82%!和拟南芥的 Fe(J)-transporter基因的同源性达 74%&
图 3.pTF2和 pTF1$ 下划线部分% 核苷酸序列
及推测的氨基酸序列
Fig.3.Thenucleotidesequenceanddeducedaminoacid
sequenceofpTF2andpTF1(underlinedparts)
3 讨论
本研究利用玉米 Fe(K)-transportercDNA为探针!从小
金海棠缺铁根 cDNA文库中经过 3轮筛选! 获得了 2个 Fe
(L)-transportercDNA片段! 序列分析表明它们属于同一个
基因& 目前正用这一筛选到的基因片段为探针!从 cDNA文
库中钓取全长的 Fe(M)-transportercDNA& 苹果属小金海棠
Fe(N)-transportercDNA的克隆将为通过基因工程技术改良
OPQRSTUVWXYZ[\]^_‘abcdefgh
ijklmnopq
参 考 文 献
1RomheldV,MarschnerH.Evidenceforaspecificuptakesystemfor
ironphytosidorphoreinrootsofgrasses. PlantPhysiol,1986,80:
175~180
2GuerinotM L, YiY. Iron:Nutritious, noxiousandnotreadily
available.PlantPhysiol,1994,104:815~820
3EideD,BroderiusM! FetJ,etal.Anoveliron-regulatedmetal
transporterfromplantsidentifiedbyfunctionalexpressioninyeast.
ProcNatlAcaSci(USA),1996,93:5624~5628
4HanZH,ShenT,KorcakRF,etal.ScreeningforIron-eficient
speciesinthegenusMalus.JPlantNutr,1994,17:579~592
5SambrookJ,FritschEF,ManiatisT.MolecularCloning,aLaboratory
Manual.NY:ColdSpringHarborLaboratory,1989.154~156,
366~370,474~490
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