全 文 ：生 物 技 术 2011 年 21(2)
序列，有助于基因表达产物通过细胞膜从细胞内向细胞外转
运，因而在哺乳动物细胞获得了分泌型的重组人 Leptin。
Leptin具有分泌蛋白的特征，氨基端带有由 21 个氨基酸
残基组成的信号肽序列，其生物学作用是通过靶细胞膜上的
高亲和力受体和相应的信号转导系统实现的。在本研究中，
PSORT Ⅱ Protein Sorting Prediction预测结果显示，Leptin 定位
于细胞外及细胞膜上，与 Leptin属于分泌型蛋白的结论一致。
重组质粒 pEGFP － C1 － ob 转染 NIH － 3T3 细胞后，荧光倒置
显微镜下观察到重组人 ob基因在真核细胞内很好地表达，融
合蛋白定位于细胞质和细胞膜。这虽然与软件预测结果存在
一定的差异，但由于细胞质是蛋白质合成的场所，任何蛋白都
不可避免地会存在其中，所以细胞转染定位与软件预测结果
不存在冲突，两者的结果是一致的，均符合 Leptin 属于分泌性
蛋白所应有的特征。
本研究提取人脂肪组织总 RNA，RT － PCR扩增获得 ob基
因 cDNA序列，成功构建含有荧光报告基因的真核载体，并实
现了重组融合基因的体外表达，探索了 ob 基因在 NIH － 3T3
细胞中的表达定位，为进一步研究其细胞内作用机制，研究
Leptin活体内的运转情况及其定位提供了基础性依据和一个
便捷的方法。
参考文献:
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悬钩子属植物肌动蛋白基因片段的克隆与表达
张春红，王小敏，王鲁北，吴文龙，李维林*
(江苏省中国科学院植物研究所，经济植物中心，江苏 南京 210014)
摘要:目的:克隆悬钩子属植物肌动蛋白基因(actin) ，为研究该物种中其他基因的表达和调控提供内标基因。方法:利用一
对特异性引物从黑莓、悬钩子杂种和树莓品种中克隆 actin cDNA片段，对其进行序列分析和半定量 RT － PCR 表达分析。结果:
从 3 个品种中均获得一条 783 bp actin cDNA片段，编码 260 个氨基酸，3 条 actin片段与其他植物核苷酸序列的同源性都在 82%
以上，与其他植物氨基酸序列同源性也均在 95%以上;树莓和悬钩子杂种品种的 actin核苷酸和氨基酸序列同源性均达 99%，系
统进化分析也发现两者亲缘关系较近些;表达分析发现 actin基因在各品种不同组织中均有一定的表达量。结论:首次克隆了悬
钩子属植物肌动蛋白基因 actin，将来自黑莓和树莓品种的序列登录在 GenBank，登录号分别为 HQ439556 和 HQ439557。
关键词:悬钩子;肌动蛋白;克隆;序列分析;半定量 RT － PCR
中图分类号:Q785 文献标识码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2011． 02． 036
cDNA Fragment Cloning and Expression Analysis of Actin Gene in Rubus spp．
ZHANG Chun － hong，WANG Xiao － min，WANG Lu － bei，WU Wen － long，LI Wei － lin*
(Institute of Botany，Jiangsu Province and the Chinese Academy of Sciences，Nanjing 210014，China)
Abstract:Objective:To clone the actin gene from three Rubus spp． cultivars including blackberry (Navaho) ，raspberry (Kivigold)and
rubus hybrid berry (Youngberry)cultivars and so provide housekeeping gene for expression and regulation analysis of other functional
genes in this species． Method:By using a pair of gene － specific primers of actin genes from other plants，three actin cDNA fragments
were isolated from Navaho，Youngberry and Kivigold respectively，and sequence analysis and semi － quantitative RT － PCR analysis in
different tissues were also performed． Result:Three cDNA fragments of 783 bp encoding 260 amino acid residues were obtained． Homolo-
01
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gy comparison with actin gene sequences in other plants showed that they shared over 82% nucleotide sequence homology and 95% amino
acid sequence homology with other plants． Furthermore，actin amino acid sequences from Kivigold and Youngberry showed extreme simi-
larity of 99% and phylogenic analysis also showed that the actin protein from Kivigold and Youngberry had close genetic relationship． Semi
－ quantitative RT － PCR analysis showed that actin genes in three Rubus spp． cultivars all exhibited certain level． Conclusion:It was the
first report on actin genes from the genus Rubus，and the two from Navaho and Kivigold were registered into GenBank (accession numbers:
HQ439556 and HQ439557)．
Key words:Rubus spp．;actin;cloning;sequence analysis;semi － quantitative RT － PCR
收稿日期:2010 － 11 － 16;修回日期:2011 － 01 － 16
基金项目:国家自然科学基金项目(31000753) ;江苏省农业科技自主
创新基金项目(CX［10］109) ;江苏省科技基础设施建设计划项目
(BM2009041;BM2010458)资助
作者简介:张春红(1979 －) ，女，博士，助研，从事黑莓等小果类生物技
术研究，发表论文 10 余篇，Email:chzhang0714@ yahoo． com． cn;* 通汛
作者:李维林(1966 －) ，男，研究员，博士生导师，研究方向:悬钩子属
植物(黑莓和树莓)的研究和利用，发表论文 50 余篇，Email:lwlcnbg@
mail． cnbg． net。
0 引言
肌动蛋白(actin)是真核细胞中普遍存在的一种蛋白质，
它构成细胞骨架中的微丝系统，参与高等植物体内细胞质流
动、细胞器运动、顶端生长、细胞形状控制、细胞有丝分裂等重
要生命活动［1］。研究也表明，肌动蛋白基因的表达水平受环
境影响较小，且在个体各生长阶段均持续表达，因而被看作真
核细胞生理过程中的看家基因，在基因表达调控研究时具有
重要的作用［2］。目前多种植物肌动蛋白基因已被阐述，模式
植物水稻、拟南芥、杨树的肌动蛋白编码基因序列均已在基因
组水平上进行了解析［3］。有研究者搜索外文数据库发现，水
稻研究中关于研究基因表达的报道均是使用 actin 基因作为
内标控制基因，且发现 8 个 actin 种内同源基因的表达稳定性
也有差异［4］。
悬钩子属(Rubus)植物资源作为果树种质资源和药用植
物，在果实色素和香味成分方面具有重要利用潜力和价值［5］。
黑莓和树莓属于悬钩子属的主要类型，果实营养丰富［6］，尤其
是黑莓富含的花青素 － 3 －葡萄糖苷的抗氧化性居所检测的
14 种花青素之首［7］。我国自 20 世纪 80 年代初期，开始进行
黑莓和树莓的引种、调查及栽培工作［8］，由于黑莓、树莓具有
耐贫瘠、耐寒性好、结果期早、风味优良、营养丰富等诸多优
点，在国内的栽培生产和加工也得到持续发展［9］。
要深入研究悬钩子属植物优异性状的形成机制和进一步
品种遗传改良，必须深入分析其分子基础和相关功能基因。
目前在 GenBank中尚未发现关于悬钩子属植物看家基因肌动
蛋白基因(actin)的研究。本研究利用同源克隆技术设计了一
对特异引物，用 RT － PCR 方法进行黑莓、悬钩子杂种和黄树
莓三种悬钩子属植物类型 actin 基因的克隆，通过检验该基因
在不同组织中的表达水平，试图确证该基因作为内标基因的
可能性，从而为研究悬钩子属植物其它基因的表达与调控奠
定基础，也为从该物种中挖掘其他优异基因资源提供借鉴。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 实验材料
实验所用研究材料为黑莓(Rubus fruticosus)品种 Navaho、
树莓(Rubus idaeus)品种 Kivigold，以及露莓和树莓的杂交(Ru-
bus ursinus)品种 Youngberry，3 个品种均引自美国北卡罗来纳
州立大学园艺科学系，于 2009 年定植于江苏省中国科学院植
物研究所(南京中山植物园)苗圃内，常规田间管理。取样过
程中，3 个品种的幼叶均取自扦插苗一年树龄、一年生枝条的梢
部，于盛花期取各品种的完整花，于开花后 7d和完全成熟时期
取各品种的幼果和成熟果。取样后速冻于 －80℃保存备用。
1． 1． 2 试剂
大肠杆菌 E． coli DH5α菌种购自北京百泰克生物技术公
司。Pfu Taq酶和 DNA marker购自 TaKaRa公司。常规化学药
品及试剂除特别说明外，均购自 Sigma公司或为国产分析纯级
试剂。PCR引物由由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。测
序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。质粒抽提试剂盒
(DP1001)、胶回收试剂盒(DP1601)、PCR 产物克隆试剂盒
(pUM － T载体)、RNA提取试剂盒(RP3301)和反转录试剂盒
(PR6601)均购自北京百泰克生物技术公司。
1． 1． 3 仪器
MultiGene Thermal Cycler(TC9600 － G － 230V)PCR 扩增
仪(Labnet，美国) ;Tanon － 2500 全自动数码凝胶图象分析系
统(天能，上海) ;HZ － 2011KA微电脑恒温振荡器(华利达，江
苏太仓) ;TGL － 16LM 型高速冷冻离心机(星科，湖南长沙) ;
DYCP － 31DN型水平电泳槽(六一，北京) ;TU － 1810 紫外分
光光度计(普析通用，北京)。
1． 1． 4 培养基
常规蛋白胨 LB培养基。
1． 2 方法
1． 2． 1 RNA提取和 cDNA第一链的合成
参照试剂盒说明提取各品种不同组织总 RNA，其中 DNA
在提取过程中已经去除。取少量用于 RNA 质量和浓度的检
测，其余贮存于 － 70℃备用。cDNA 的制备利用 2μg RNA 和
Oligo18(T)引物进行 cDNA第一链合成，步骤参照试剂盒说明
进行。
1． 2． 2 PCR扩增
参照 GenBank中登录的植物肌动蛋白基因同源核苷酸保
守序列设计和合成引物［10］，Act － F:5’－ GGA GAA GAT CTG
GCA TCA CA － 3’;Act － R:5’－ CCT CCA ATC CAG ACA CTG
TA － 3’。PCR扩增采用 20μl 反应体系，包括 2μl 10 × buffer，
0． 2μl 10mmol /L dNTPs，2μl 10 pmol /μl 引物，0． 2μl 5 U /μl
Taq酶，1μl cDNA 模板，ddH2O 14． 6μl。PCR 反应程序为:
94℃预变性 5min，94℃变性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸 60s，
35 个循环后 72℃延伸 10min。扩增产物均用 1． 0%琼脂糖凝
胶电泳分离。
11
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1． 2． 3 阳性克隆筛选和鉴定
将回收的 PCR产物连接到 T载体，转化感受态大肠杆菌，
置于 LB固体平板(含 100mg /L Amp)上筛选重组子。阳性克
隆经质粒 PCR鉴定后送交测序。
1． 2． 4 序列分析
利用 NCBI (http:/ /www． ncbi． nlm． nih． gov /BLAST /)
BLASTn和 BLASTp工具进行相似性搜索，对推导的蛋白利用
ClustalX(ver1． 8)进行多重序列比对，蛋白结构域预测用 PRO-
SITE工具完成。以 3 个品种中克隆的肌动蛋白序列为查询序
列搜索数据库，利用不同物种中的蛋白序列用 Phylip(ver 3．
69)软件绘制系统树。
1． 2． 5 半定量 RT － PCR分析
将不同品种不同取样组织按上述方法提取总 RNA，用吸
光值法测定不同品种各组织的 RNA 量，使同一品种不同组织
间取等量 RNA进行反转录。测定 cDNA的浓度，取等量 cDNA
模板进行 PCR。利用上述 1． 2． 2 PCR 扩增中的特异引物检测
各品种中肌动蛋白基因的表达。RT － PCR反应体系和反应参
数同上，但其反应循环数减少为 26 个。
2 结果与分析
2． 1 actin cDNA片段的克隆
以 Navaho、Youngberry 和 Kivigold 三个品种幼叶总 RNA
反转录所得到的第一条 cDNA 链为模板，利用设计引物进行
PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳后，与 Marker相比 3 个品种中
在 750 bp左右均有 1 条特异性条带。对三条条带分别回收后
进行连接、转化和阳性克隆测序。
2． 2 序列分析
测序结果显示，三条片段长度均为 783 bp，均编码 260 个
氨基酸。将 3 条序列在 GenBank 中进行搜索，发现三者均相
似地具有 actin 家族典型的结构域(图 2) ，即均含有多处氨基
酸残基的 5 个 ATP结合位点、7 个 profilin 结合位点和 4 个氨
基酸残基 gelsolin结合位点，均为未登录的序列。对三个 cD-
NA序列进行分析，发现 Navaho 和 Youngberry 间的相似性为
80%，Navaho和 Kivigold 间的相似性为 81%，而 Youngberry 和
Kivigold仅有 3 个核苷酸差异，相似性达 99%。对 3 条序列推
导的氨基酸序列进行分析发现，Navaho 和 Youngberry 有 11 处
差异(相似性 96%) ，Navaho 和 Kivigold 有 9 处差异(相似性
97%) ，而 Youngberry 和 Kivigold 仅有 2 处差异(相似性
99%) ，因此推断来自 Youngberry和 Kivigold 的 actin 可能高度
同源或为同一基因。将从黑莓和树莓中分离的该基因片段分
别命名为 Blackberry Act1 和 Raspberry Act1 并在 GenBank中登
记注册，登录号分别为 HQ439556 和 HQ439557。
图 1 不同品种中肌动蛋白基因 cDNA片段的 PCR扩增图谱
M:核酸分子量标准 DL 2 000;1、2、3 泳道分别代表黑莓、悬钩子杂种
和树莓品种中 actin的 RT － PCR扩增结果。
Fig． 1 PCR amplification of actin cDNA fragments from different Rubus
cultivars
M:DNA Marker DL 2 000;Lane 1，2 and 3 meant production of PCR am-
plification of blackberry，hybrid berry and raspberry cultivars．
图 2 肌动蛋白基因推导的氨基酸序列的保守结构域
Fig． 2 Conservative domain of actin amino acid sequence
在 NCBI中将三条序列进行 BLASTn 分析时发现，从黑莓
品种 Navaho中获得的 actin 基因片段与其他植物核苷酸序列
同源性都在 82%以上，与西洋梨 actin(AF386514)同源性最
高，为 92%，从树莓品种 Kivigold和悬钩子杂种品种中获得的
actin基因片段均与其他植物核苷酸序列同源性在 85%以上，
且与蔷薇科月季 actin(AB239789)的同源性最高，达 96%。而
cDNA序列推导的蛋白质序列进行 BLASTp 分析发现，从 3 个
品种中获得的 actin与其他植物 actin 氨基酸序列同源性均在
95%以上，表明所克隆的片段为 actin 基因片段。图 3 是三条
cDNA序列推导的氨基酸序列与其他植物的比对结果，发现其
高度保守，得到的三个 actin蛋白仅有从黑莓中分离得到的序
列有两个特异氨基酸残基(T37和 S148) ，且发现克隆的序列均
具有肌动蛋白相关蛋白的典型特征序列之一“LLTEAPLN-
PKANR”(L22 ～ R34)［11］。
2． 3 肌动蛋白的分子系统发育分析
基于植物 Actin氨基酸序列构建系统进化树(图 4) ，从树
的聚类看，从黑莓中获得的 Aactin 和从黄树莓与悬钩子杂种
中获得的 Actin明显距离较远。具体表现为黄树莓和悬钩子
杂种距离较近些，黄树莓和月季、亚麻最近，而悬钩子杂种和
亮叶桦距离最近。此外，黄树莓和悬钩子杂种与拟南芥营养
亚类型的 Actin7 亲缘关系距离较近。
将 GenBank中与本研究克隆的肌动蛋白相似性较高的植物蛋
白序列用于系统发育分析。文中用于系统发育分析的蛋白序
列的物种名和序列号如下:Per:Persea americana(鳄梨)
ADA70361． 1;Mal:Malva pusilla(圆叶锦葵)AAD41039． 1;
Ara7:Arabidopsis thaliana(拟南芥)AAB52506． 1;Ste:Stevia re-
baudiana(甜叶菊)AAN40685． 1;Sin:Linum usitatissimum(亚
麻)AAW34192． 1;Ros1:Rosa hybrid cultivar(月季)BAF36000．
1;Rub:Rubus idaeus(黄树莓)HQ439557;Rub:Rubus ursinus(悬
钩子杂种) ;Bet:Betula luminifera(亮叶桦)ACJ38662． 1;Bet:
Betula platyphylla(白桦)ACB88021． 1;Ric1:Ricinus communis
(蓖麻)AAR1 5 1 7 4 ． 1;Act:Actinidia deliciosa(猕猴桃)
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2011 年 21(2) 生 物 技 术
图 3 黑莓、树莓肌动蛋白基因的 cDNA序列推导的氨基酸序列与其他物种的多重序列比对
各肌动蛋白登录号如下:黑莓(HQ439556) ;悬钩子杂种(无) ;树莓(HQ439557) ;桑(BAH23584． 1) ;杨树(XP_002331880． 1) ;李(ABU68265． 1) ;
蓖麻(XP_002530711． 1) ;月季(BAF96593． 1)。
Fig． 3 Multiple alignments of amino acid sequences of deduced Rubus spp． actin proteins and other species
GenBank accession numbers used were as follows:Blackberry (HQ439556) ;Youngberry (non) ;Raspberry (HQ439557) ;Mulberry (BAH23584． 1) ;
Poplar (XP_002331880． 1) ;Plum (ABU68265． 1) ;Ricinus (XP_002530711． 1) ;Chinese rose (BAF96593． 1)．
图 4 悬钩子植物与其他植物肌动蛋白氨基酸序列的聚类分析
Fig． 4 Phylogenetic analysis of Rubus spp． actin proteins
ABR45727． 1;Jat:Jatropha curcas(麻疯树)ADH82414． 1;Pop9:
Populus trichocarpa(杨树)XP_0023318． 1;Cuc3:Cucumis sativus
(黄瓜)AAZ74666． 1;Ara2:Arabidopsis thaliana (拟南芥)
AAB37098． 1;Pic:Picea abies(欧洲云杉)ACP19073． 1;Ros2:
Rosa hybrid cultivar(月季)BAF96593． 1;Ara1:Arabidopsis thali-
ana(拟南芥)AAA98561． 1;Ara4:Arabidopsis thaliana(拟南芥)
AAB39403． 1;Ara11:Arabidopsis thaliana(拟南芥)AAB39404．
1;Ric2:Ricinus communis(蓖麻)XP_0025307． 1;Euc:Eucommia
ulmoides(杜仲)AAT72934． 1;Pha:Phalaenopsis hybrid cultivar
(蝴蝶兰)AAN08622． 1;Pop3:Populus trichocarpa(杨树)XP_
0023083． 1;Car:Caragana korshinskii(柠条)ACK87035． 1;Rub:
Rubus fruticosus(黑莓)HQ439556;Cuc1:Cucumis sativus(黄瓜)
AAZ74664． 1。
2． 4 肌动蛋白基因在不同器官中的表达特性分析
利用 RT － PCR分析从 3 个悬钩子植物品种中分离的 ac-
tin基因的表达情况(图 5) ，结果发现 3 个品种中的 actin基因
在检测的各组织中均有不同程度的表达。具体而言，在黑莓
品种在成熟果实中表达量相对多些，而在悬钩子杂种品种不
同组织中，检测结果是其条带均较弱且较为相似。在树莓品
种中则发现 actin基因在幼叶中表达量较高。
3 讨论
关于模式植物和重要农作物的 actin 基因已有大量研究，
近两年来我国特有的一些特有植物如碱蓬、苎麻、中国枣等的
actin基因也相继被克隆［12 － 16］，在转基因表达产物研究中，ac-
tin基因也被认为是一个重要的稳定表达的内参基因之一［17］，
而悬钩子植物的 actin 基因至今尚未见报道。为了对悬钩子
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属植物不同品种类型优异性状的分子机制进行解析，本研究
从 3 个黑莓、树莓和悬钩子杂种品种类型中克隆了 actin 基因
片段，希望能作为看家基因研究其他功能基因的表达。从不
同品种中克隆的 actin cDNA片段和其推导的蛋白氨基酸序列
经序列比较表明，获得的 actin 基因片段与其他植物核苷酸序
列同源性都在 82%以上，与其他植物 actin 氨基酸序列同源性
均在 95%以上，表明其均是 actin 基因家族成员，同时验证了
悬钩子属植物中 actin 基因作为看家基因的高度保守性。本
研究也发现悬钩子杂种品种的 actin 基因与树莓品种的极为
相似，可能与该品种属于悬钩子杂种且具有红树莓的遗传成
分有关［18］。
图 5 肌动蛋白基因在不同悬钩子植物品种的不同组织中的表达分析
M:DNA 分子量标准 DL2 000;1、2、3、4 泳道分别代表从黑莓(Nava-
ho)、悬钩子杂种(Youngberry)和树莓(Kivigold)品种的幼叶、花、幼果
和成熟果中扩增的情况。每一样品的反应重复 3 次，显示结果为重复
间的相似结果。
Fig． 5 RT － PCR analysis of actin in different tissue of three Rubus culti-
vars
M:DNA Marker DL2 000;Lanes 1，2，3，4 meant amplification results
from leaflets，flowers，young fruits and mature fruits of three cultivars．
Each sample was performed for three replicates and the image showed the
similar result of replicates．
理论上，一个理想的内标应该在各种不同的细胞类型、不
同发育阶段、采用不同处理方法时都能稳定表达，一个稳定的
内标是确定目标基因相对表达的基础［19］。事实上，肌动蛋白
基因的表达也具有时间和空间上的特异性［20］。拟南芥有 10
个不同的 actin基因，其中 8 个是功能基因，其又分为营养体基
因与生殖细胞基因，属于在不同发育阶段差异表达的肌动蛋
白营养亚类型和生殖亚类型［21］。有研究者利用一对相同的特
异引物从黄瓜基因组 DNA中扩增出 3 个 actin片段，器官特异
性表达分析则表明，3 个基因中只有 Act3 在所有检测的器官
中都表达，表明 actin 基因家族不同成员间的表达不完全相
同［10］。本研究从 3 个品种中均得到一条特异 actin cDNA 条
带，且在检测的组织中均有一定量的表达，只是在不同品种类
型中在特定组织中检测量更高，尤其是黄树莓和悬钩子杂种
品种中的 actin，在进化树分析和表达分析中相对黑莓品种更
类似于拟南芥营养体基因类型，这也需要在更多器官组织中
的表达模式分析进一步来证实，而且关于悬钩子属植物 actin
基因家族也需要大量和深入研究。
黑莓和树莓等悬钩子属植物具有极高的营养成分和抗氧
化特性，蕴含着丰富的基因资源，这一优点已逐步得到关注，
也具有广阔的开发和利用前景。本研究首次从悬钩子属植物
品种中克隆了一个 actin cDNA 片段，这不仅填补了悬钩子属
植物 actin基因研究的空白，而且丰富了植物肌动蛋白研究的
资料库，为进一步以 actin为内标参照挖掘悬钩子属植物优异
基因奠定了基础。
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HSV － 1 UL － 12 基因的克隆、表达及产物复性
陈恬1，郭洪秀2，陈玮1，张磊2，祝捷2，余小平3，殷建华1*
(1．成都医学院病原生物学教研室;2．成都医学院生物技术系;3．成都医学院公共卫生系，四川 成都 610083)
摘要:目的:克隆及表达单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV － 1)UL12 基因，对其表达产物 HSV － 1 碱性核酸酶(AN)进行复性，为建立
抗 HSV － 1 药物的分子筛选模型奠定了基础，对于寻找抗病毒药物具有重要意义。方法:从 HSV － 1 感染的 Vero 细胞中提取
HSV － 1 基因组 DNA，通过 PCR克隆出 UL12 基因并对其测序;然后将 HSV － 1 UL12 基因先克隆至 pMD19 － T载体，再亚克隆到
pET32a表达载体上，并将重组载体转化到 E． coli Rosetta菌中进行表达;最后用梯度盐酸胍对表达出的包涵体进行复性。结果:
成功构建了 pET32a － UL12 重组载体，经序列比对，与 GenBank上公布的 HSV － 1 国际标准毒株 17 株的 UL12 基因序列的同源性
达到了 99． 2%。在 E． coli Rosetta菌中以包涵体的形式表达，经复性得到有活性的 HSV － 1 碱性核酸酶(AN)。AN同时具有核酸
外切酶和核酸内切酶的活性，与核酸作用 60min 时酶活性最高。结论:重组载体 pET32a － UL12 经表达、复性可获得有活性的
HSV － 1 AN。
关键词:HSV － 1;UL12 基因;克隆;表达;复性
中图分类号:Q786 文献标识码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2011． 02． 037
Clone and Expression of HSV － 1 UL － 12 Gene and Product － renaturing
CHEN Tian1，GUO Hong － xiu2，CHEN Wei1，ZHANG Lei2，ZHU Jie2，YU Xiao － ping3，YIN Jian － hua1*
(Department of Pathogenic Biology，Chengdu Medical College，Chengdu 610083，China)
Abstract:Objective:Cloning of UL12 gene from herpes simplex virus type 1，was the foundation of establishing molecular models for HSV
－ 1 drug screening． Method:The HSV － 1 genome was extracted from Vero cells infected with HSV － 1，plus，UL12 gene was amplified
by PCR and then sequenced;HSV － 1 UL12 was firstly cloned into pMD19 － T vector and then subcloned into pET32a expression vector，
and the recombinant vector was transformed into E． coli Rosetta bacteria to express;finally，the inclusion bodies expressed were renatured
by a gradient of guanidine hydrochloride． Result:The HSV － 1 UL12 gene has been successfully cloned and shares 99． 2% of sequence a-
lignment with the international standard HSV － 1 stain 17． The HSV － 1 alkaline nuclease expressed in inclusion bodies in E． coli Rosetta
bacteria had both exonuclease and endonuclease activities after renaturation，which reached a highest activity when it acted on DNA for
60min． Conclusion:HSV － 1 AN with biological activity was obtained after the recombinant vector pET32a － UL12 was expressed and re-
natured．
Key words:HSV － 1;UL12 gene;clone;expression;renaturation
收稿日期:2010 － 11 － 29;修回日期:2011 － 02 － 27
基金项目:国家自然科学基金面上项目(“膳食黑米花青素 BRACs 防
护视网膜光化学损伤及分子机制研究”，30972462) ;四川省杰出青年
科技基金项目(“抗 HSV － 1 药物碱性核酸酶分子筛选模型的建立”，
06ZQ026 － 024) ;成都医学院创新性实验项目(No． CX2010024 /
CX2010037)资助
作者简介:陈恬(1967 －) ，女，博士，副教授，研究方向:抗感染药理，
Email:chentianchina@ 126． com;* 通讯作者:殷建华，Email:ycdcmc@
163． com。
单纯疱疹病毒 1 型(herpes simplex virus type 1，HSV － 1)
属于疱疹病毒亚科，可引起人腰部以上黏膜和神经系统感染，
所致疾病主要有角膜炎、疱疹性脑炎、唇疱疹和龈口炎等，并
可形成潜伏感染［1］。Nina Bacher Reuven 等利用 λ 噬菌体表
面展示技术证明 HSV － 1 UL12 编码的产物有核酸酶活性［2］，
因为其反应的最适 pH较高［3］，所以被称为碱性核酸酶(AN)。
AN 被证实由疱疹病毒科基因组中共同保守序列编码［4］，对
HSV － 1 的大量增殖是必不可少的［5］。
本课题从 HSV － 1 的基因组中提取了 UL12 基因，并将其
克隆到 pET32a 载体上，再转化 E． coli Rosetta 中进行表达，最
后用梯度盐酸胍对以包涵体形式表达的 HSV － 1 AN 进行复
性，得到了有活性的 HSV － 1 AN。本实验的结果对于进一步
寻找抗 HSV － 1 药物有十分重要的意义。
1 材料和方法
1． 1 材料
Vero细胞(购于四川大学华西医院卫生部移植工程与移
植免疫重点实验室) ;E． coli BL12(DE3)plysS 菌株、E． coli
Rosetta(DE3)、原核表达载体 pET32a(+)、pET28a(+) ，购自
Novagen公司;高保真 Taq 酶、T4 DNA 连接酶、DNA λ Marker、
蛋白质分子量标准(低)、限制性内切酶 EcoRⅠ和 HindⅢ、E．
coli JM109 菌株、pMD19 － T 载体、EDTA 、NP － 40、TritonX －
100，购于大连 TaKaRa 公司;核酸测序由大连 TaKaRa 公司完
成;盐酸胍、异丙基硫代 － β － D 半乳糖苷(IPTG)为美国 AM-
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