全 文 ：Vol. 32 No. 3
Mar. 2012
第 32卷 第 3期
2012年 3月
中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
Journal of Central South University of Forestry & Technology
收稿日期：2012-01-06
基金项目：国家林业公益性行业科研专项 (200904041)
作者简介：吴 硕 (1985—),女 ,河北石家庄人 ,硕士研究生 ,研究方向为经济林遗传育种 ;E-mail:snow-shuoer@163.com
通讯作者：傅建敏 (1963—),女 ,河南禹州人 ,副研究员 ,主要从事经济林育种与栽培的研究 ;E-mail:fjm371@163.com
柿科柿属 Diospyros L.植物为我国重要的经济
林资源。其中的柿 D. kaki、油柿 D. oleifera、君迁
子 D. lotus[1]等果实及其成分广泛用于食品、饮料
[2]、制药 [3]、工业 [4]等多种行业，具有良好的生态
效益和经济效益。中国柿属植物在长期生长进化
过程中，由于遗传变异和自然人工选择的作用，
分化出了许多宝贵的可利用新资源 [5]，但对这些宝
贵资源的研究，特别是针对各种用途的新品种的
选育研究相对滞后。因此利用先进的 SSR(Simple
senquence repeat，简单序列重复 )分子育种技术将
大大促进柿属资源新品种的创育效率。但截止至
2010年底，国内柿属 SSR引物极度缺乏 [6]，急需
柿属 EST-SSR 引物设计及遗传多样性研究
吴 硕 1，傅建敏 1，乌云塔娜 2，梁玉琴 1
(1.中国林业科学研究院 经济林研究开发中心，河南 郑州 450003；2.中南林业科技大学 经济林育种与栽培国家
林业局重点实验室，湖南 长沙 410004)
摘 要 :利用从 NCBI上下载的 9 474条 EST(Expressed Sequence Tags)序列，设计并开发 EST-SSR引物，
用于柿属种质资源的遗传多样性研究。下载的初始序列拼接成 1 390条重叠序列和 4 097条无重复序列。用
SSRHunter软件搜索到 601条 EST序列中含有 540个 SSR。SSR出现频率为 10.96%，其中以 2核苷酸为主。依
据检出的 SSR-ESTs序列设计 SSR引物 100对，对 9个柿属 (Diospyros L.)种质资源样品进行了 PCR扩增，其中
42对引物有扩增带，占设计引物的 42%，其中 30对引物有多态性，占可扩增引物的 71.4%。同时发现引物 15
是美洲柿 (雄 )的特异引物；引物 30是青化北野柿的特异标记；引物 69和引物 80为美洲柿的特异引物；引物
99是无核软枣的特异引物。
关键字 :柿属；EST；SSR标记；遗传多样性
中图分类号：S718.46 文献标志码：A 文章编号：1673-923X(2012)03-0152-06
Study on EST-SSR primer design and genetic deversity of Diospyros L.
WU Shuo1, FU Jian-min1, WUYUN Ta-na2, LIANG Yu-qin1
(1. Non-timber Forest Research and Development,Center of Chinese Academy of Forestry, Zhengzhou 450003, Henan, China;
2. The Key Lab of Non-wood Forest Product of Forestry Ministry, Central South University of Forestry & Technology, Changsha
410004, Hunan, China)
Abstract: The 9 474 ESTs of Diospyros L. in the database of NCBI were downloaded, then were used to design EST-SSR makers. The
obtained makers were used to analyze diversity of 9 germplasm resources (Diospyros L.). The 9 474 ESTs after some redundants and
some low qualities were removed, fi nally assembled into 1 390 contigs and 4 097 singles. Then by using SSRHunter software, 540 SSRs
in 601 ESTs were found, accounting for 10.96% of ESTs, and most of them were dinucleotides. One hundred primer pairs were designed
for polymorphism analysis in 9 genotypes(Diospyros L.). Forty two primer pairs showed the amplification, accounting for 42% of
designed primers, and 30 primer pairs showed polymorphisms, accounting for 71.4% of primers available. Meanwhile, P15 was special
primer of D.virginiana(male), P30 was special primer of north Qinhua-D.spp., P69 and P80 were special primers of D.virginiana, P99
were special primers of D.lotus.
Key words: Diospyros L.; EST; SSR maker; genetic diversity
DOI:10.14067/j.cnki.1673-923x.2012.03.016
153第 32卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
开发柿属 SSR标记。
随着近年来 cDNA文库的建立，开发了大量
的 EST序列。快速增长的 ESTs数据为 SSR标记
的开发带来了新的契机，已成为了 SSR标记的重
要来源。EST-SSR技术是近年来最为常用的 SSR
引物设计方法，在百合 [7]、高丹草 [8]、核桃 [9]和
铁皮石斛 [10]等多个物种中均成功设计出SSR引物，
且操作简便、引物特异性较高，且具有较高的信
息量，通用性好。因此本研究应用 NCBI上现有的
EST数据开发柿属的引物，辅助柿属育种及遗传
多样性研究。
1 材料与方法
1.1 试验材料
9个柿属植物种质资源，分别为湖南乌柿
D.cathayensis，浙江野柿 D.kaki，青化北野柿
D.kaki，青化南野柿 D.kaki，浙江柿 D.glaucifolia，
美洲柿 ( 雌 )D.virginiana(female)，美洲柿 ( 雄 )
D.virginiana(male)，云南野毛柿 D.artrotricha，无
核软枣 D.lotus。其中美洲柿 (雌 )和美洲柿 (雄 )
同属美洲柿种；浙江野柿、青化北野柿和青化南
野柿同为野柿；无核软枣属于君迁子种。
1.2 引物设计
利用 GenBank等数据库中查找并下载柿属
的 EST序列 [11]，然后用 EST-trimmer去除含末端
存在的 polyA、polyT的“尾巴”结构的序列和用
seqclean来屏蔽载体序列。再应用 vector NTI软
件进行做 EST序列的聚类和拼接 [12]，以获得无
冗余 EST和尽可能长的重叠序列 (contig)。应用
SSRHunter软件 [13]查找含 SSR的 EST序列，查找
的标准为 2、3、4、5和 6核苷酸重复基元的重复
次数分别大于或等于 7、5、4、3和 3次 [14]。应用
Primer Premier 5.0[15]和 Oligo设计引物，引物长度
为 18～ 22 bp，GC%为 40%～ 60% ，扩增产物
预期片段为 100～ 350 bp。引物由南京金斯瑞生
物科技有限公司合成。
1.3 实验方法
1.3.1 DNA提取
采用 CTAB法 [16]提取 DNA。选择不同植株
的适宜叶片，剪碎后液氮研磨，取 100 mg粉末
置于 1.5 mL离心管中，加入 800 μL抽提缓冲液
和 50 μL巯基乙醇，充分混匀后，65 ℃水浴保温
1 h。冷却至室温，在 4 ℃低温离心 12 000 r/min，
15 min。然后取上清液加入 70 μL 5M NaCl，充分
摇匀，静置 5 min。再加入 700 μL三氯甲烷混合
液 (三氯甲烷∶异戊醇 =24∶ 1)再次剧烈振荡混
匀后离心，12 000 r/min，12 min 。取上清液重复
加入三氯甲烷混合液 2～ 3次至无白色杂质产生。
再取上清液加入 700 μL异戊醇缓慢颠倒至无生白
色絮状沉淀，静置 5～ 10 min，然后 10 000 r/min
离心 6 min。弃上清液留沉淀，用 75%乙醇清洗 2
遍，每次离心 9 000 r/min，6 min。留沉淀，倒置
风干至无水珠。再加入 500 μL 1M NaCl，2 μL 10
ng/mL RNA酶，37 ℃水浴 1 h。再加入 1 000 μL
无水乙醇，-20 ℃沉淀 2 h。然后 1 000 r/min离心
6 min，弃上清液，用 75%乙醇 1 000 μL清洗沉淀，
1 000 r/min离心 6 min，用无水乙醇清洗沉淀，同
样 1 000 r/min离心 6 min弃上清液，倒置风干至
无水珠。最后加入 200 μL TE溶解 DNA，-20 ℃保
存。DNA用 1.5%琼脂糖电泳检测并定量。
1.3.2 PCR扩增和电泳检测
在前期实验中我们通过正交试验对柿属的
SSR反应条件和反应参数进行了优化。最终确定
总反应体积为 25 μL，模板 DNA 2 μL，2×Taq
PCR MasterMix(天根生化科技有限公司 )8 μL，
10 mmol/L引物 (金斯瑞生物公司 )各 1 μL，加
ddH2O至 25 μL。PCR扩增仪型号为 S10000(联想
生物科技有限公司 )。参数为 :94 ℃预变性 5 min，
94 ℃变性 1 min，51 ℃复性 1 min，72 ℃延伸 2
min，循环 35次，最后 72 ℃延伸 5 min，4 ℃保存。
扩增完毕，以 1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离，对有
扩增产物的样品再用 8%PAGE(聚丙烯酰胺 )电泳
分离，用紫外照相机 (Bio-Rad公司 )照相并记录
结果。
2 结果与分析
2.1 柿属植物 SSR引物开发设计
2.1.1 EST数据的取得与前处理
从 NCBI等数据库下载柿属植物的 EST序列
9 474条。初始 EST序列中首先去除小于 150 bp
吴 硕，等：柿属 (Diospyros L.)EST-SSR引物设计及遗传多样性研究154 第 3期
的低质量片段，再用 EST-trimmer去除含末端存在
的 polyA、polyT的“尾巴”结构的序列 317条；
用 seqclean来屏蔽载体序列，获得柿属植物 EST
序列 9 157条。
2.1.2 EST数据的聚类和拼接
应用 vector NTI软件进行做 EST序列的聚类
和拼接后，获得 5 487条有效的 EST序列，其中
包括 1 390条重叠序列 contig，为 25.3%，4 097条
无重复 single序列，为 74.7%。
2.1.3 EST中 SSR序列的发掘与分析
应用 SSRHunter软件，从 5 487条 EST序列
查找 SSR序列，查找的标准为 2、3、4、5和 6核
苷酸重复基元的重复次数分别大于或等于 7、5、
4、3和 3次。结果表明，5 487条 EST序列中找
出 601条序列含 SSR，SSR检出率达 10.95%。其
中二核苷酸重复组合有 12种共 367条，占 61%，
二次重复最多的是 CT组合，有 123条；三核苷酸
重复组合有 60种共 196条，占 33%，最多为 CTT
组合，有 15条；四核苷酸重复组合有 31种共 38
条，占 6%，最多为 CATA组合，为 3条 (表 1 )。
可见 SSR主要属于二、三核苷酸重复类型，且不
同重复基元出现与否及其频率高低有明显的偏倚
性。也与柿属现有的 EST数较少、覆盖度不足。
2.1.4 EST-SSR引物设计
应用 Primer5.0和 Oligo引物设计软件，按照
引物设计标准，对 601条 EST序列设计引物。结
果表明共设计出 155对合格的 SSR引物。从中选
取较好的 100对引物进行合成，对 9个柿属植物
种质资源进行多态性筛选。结果 42对引物有扩增
条带，其中 11对扩增出非目的条带，30对扩增出
稳定清晰的目的条带且有多态性，1对引物有目的
条带但无多态性。
2.2 遗传多样性分析
用筛选出的 30对引物 (表 2)对柿属的 9个种
质资源样本进行扩增，共获得 143扩增带，其中
142为多态性条带，多态性比例达 99.3%，片段长
度在 100～ 350 bp之间，平均每对引物约 5条带；
其中 P15、P30、P69、P78、P80、P89和 P99共 7
对引物均扩增出单一条带 (约占 0.7%)。
通过实验得到 5对特异性引物，分别为 P15
是美洲柿 (雄 )的特异引物，P30是青化北野柿的
表 1 含 SSR序列中重复基元种类数目
Table 1 Repeated types and numbers of SSR sequences
重复类型 SSR数量 比例
2核苷酸 367 61.06%
3核苷酸 196 32.61%
4核苷酸 38 6.33%
5核苷酸 0 0.00%
6核苷酸 0 0.00%
总计 601 100.00%
表 2 引物序列
Table 2 Information of primer pairs
引物编号 重复基元 引物序列 (5’-3’) 位置 来源 EST名称
15 (TTC)15 S: GGCTCTAAGCACCCTGTTG A: ATCCATCCTGTCCTCGTCT CDS DC586612 DC588418
19 (CT)12 S: AACTCATAGCCCTTTCGG A: CGTATCCTTCTTCAACTTCG CDS DC583764 DC586416
20 (CT)10 S: GCTCCCTTCTCCTCTGTAT A: GTCTTGATTCGCCATTTC CDS DC587449 DC589068
21 (TA)7 S:AAGAAAGGGCGATTGATAAG A: GGAGGAGCAAAACATAGAGC CDS DC583561 DC583558
25 (CT)11 S: GTTTTGTGGCTGGGGATG A: GAGATTGCCTGCGATGGT CDS DC586859 DC586861
28 (CT)14 S: CGGGAAATGGGAGATGAG A: AGAAATGCCGAGCAAAGC CDS DC588164 DC588165
29 (GAT)5 S: AGTGTTGTATGTTTGGGCGTAT A: CGACCAGCGATTTTCAGG CDS DC588140 DC588139
30 (GAT)5 S: TGTTGTATGTTTGGGCGTAT A: GCGATTTTCAGGCTTTTC CDS DC588140 DC588139
40 (AG)14 S: ACTCAAGCCCTAAAACAACG A: CGGTCAACTCGCCTAAACT CDS DC589918
41 (CAG)6 S: TCTCCAACTCAGCCTCCT A: ATTCCCCACAGATTCAGC CDS DC587276 DC587273
42 (CTT)7 S: ATACCCAACTCCTCCACC A: AGTCAAAGCACGAACAATG CDS DC585737
46 (GGC)5 S: CAAGGGAGGCTTCAAATG A: CCTGATAAAACCGATGGAC CDS DC586311 DC586312
64 (CTC)6 S: GTTTACCGCCGTTTTCCT A: TCATCTCCACCTGCTTCG CDS DC588752
66 (GAT)5 S: GTCAGAAGGAGGCGGCATT A: TTCCAGACCGACCCAACAG CDS DC588681
67 (GAT)5 S: AGGCTACCACTGCTTCATT A: GCGATTTTCAGGCTTTTC CDS DC588140 DC588139
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特异引物，P80和 P69为美洲柿的特异引物，P99
只能扩增出无核软枣 (图 1)。
柿属 9个样品聚类后分为 6类，见图 2。其中
浙江柿明显与其他柿属品种亲缘关系较远，表明
浙江柿这个种较为特殊，起源较为奇特，很有研
究价值。浙江柿、浙江野柿和青化北野柿 3个种
与其余 6种亲缘关系较远。野毛柿、无核软枣、
美洲柿和乌柿间亲缘关系较近。除美洲柿两个品
种外，乌柿和青化南野柿亲缘关系较近，起源相近。
而青化北野柿和青化南野柿虽名字相近，但亲缘
关系较远，可能分属不同的种。美洲柿的雌雄品
种同为美洲柿种下的两个品种，亲缘关系较其他
种要近。图中可见其虽有有微小差别，但亲缘关
系极近，表明此些引物用于鉴定品种间亲缘关系
准确可靠。
3 讨 论
近年来，公共数据库中 EST数量的剧增，为
SSR标记的开发提供了一条快速而有效的途径。
柿属在 NCBI上共有 9 474条 EST序列，相较于其
他种属来说数据量较少。下载的 EST拼接为 5 487
条序列，共查找出 601条含 SSR序列，SSR检出
率达 11.9%。高于水稻的 4.7%[17]，而低于茶树的
15.48%[18]。表明不同的物种和不同的搜索条件会
产生不同的结果。同时也表明初始数据量的多少
与 SSR的检出率无关。
查询出的柿属 SSR主要属于二、三核苷酸重
复类型，高阶核苷酸组合极少，表明不同重复基
元出现与否及其频率高低有明显的偏倚性。如果
EST数足够大且无偏倚性，则 4种不同的碱基随
机组合将产生单核苷酸 2种、二核苷酸 4种、三
核苷酸 10种，四核苷酸 33种，五核苷酸 102种
和六核苷酸 350种基本重复类型 [19]。而本实验中
的重复种类明显少于理论值，这或许与柿属现有
EST数较少、覆盖度不足有关。
筛选出来的 30对引物的扩增位置主要处于
CDS区域，仅有 3对引物来源于 5UTR，表明
SSR序列存在于基因的不同部位表现出差异性，
或许还表明位于CDS的引物相较 5’UTP和 3’UTP
更易产生扩增，均表现了引物的选择有其偏好性。
通过对 9个柿属种质资源的聚类分析，发现
浙江柿与其余 8个样品亲缘关系较远，可能有不
同的起源。同时结果表明美洲柿雌雄品种间亲缘
关系最近，符合事实情况，表明实验结果真实可靠。
续表 2
Continued table 2
引物编号 重复基元 引物序列 (5’-3’) 位置 来源 EST名称
99 (CT)7 S: TGATAAGGTGATTTGGGATG A: TCTGGATAGGGATTCGTG CDS DC588519 DC588515
69 (CT)7 S: GTGATTTGGGATGTTGTCG A: GATTACGGTTTCTGGATAGG CDS DC588515 DC588519
71 (CT)7 S: TAAGGTGATTTGGGATGTTG A: GATTACGGTTTCTGGATAGG CDS DC588515 DC588519
74 (GGC)6 S: CACAACACGAGGAGAAGC A: GTTTGGGGATTTGACAGG CDS DC590892 DC590891
76 (AGG)7 S: TCGGCTTCACCTATGTTG A:CGATTCCTTGGACCTTTG CDS DC585435
77 (CAT)5 S:TGGAGGTGCTAATGCTAAC A:TCCTATGCCCCTTCAATC CDS DC592750 DC592747
78 (CT)9 S: TCGGAGAAGGAAGATAAGG A: TAAGGAGGCTGTGATGGC CDS DC584661 DC586543
80 (TC)7 S: CGGCTGACTTTGTTTGAT A: TTCCTCCACTGCCTTCTC CDS DC586498
83 (TC)16 S: GAAGAACAGGGGAGAAGG A: TGGCAGCAGTAACAGCAT 5UTR DC591761 DC591754
85 (TC)16 S: TAGAAGAACAGGGGAGAAGG A:TGGCAGCAGTAACAGCAT 5UTR DC591761 DC591754
89 (AG)7 S: AGGTTGCGTCGTATCTTCC A:GCTCGCTTCTTGGTGCTCT CDS DC591211 DC588239
91 (AG)7 S: CGGAAGAGGGAGAAATCG A: GAATCGGGAAAGCAAGTT CDS DC592713 DC592707
93 (TC)14 S: CCAATCATCACGCACCTC A: TCTGAAAGCAACACCGAC 5UTR DC585656
95 (TC)10 S: GCCAAGGTTCATAGTTCG A: CCAGATAGTCGGGCAAAG CDS DC586440 DC584623
96 (CATC)5 S: AGCAAGCAACAACAAGCC A:AACTGTGAGAATGGGAGAAG CDS
DC588306 DC583454 DC586854
DC584426 DC586756 DC583887
DC583868 DC584115 DC585029
DC643097 DC644548
99 (CT)7 S: TGATAAGGTGATTTGGGATG A: TCTGGATAGGGATTCGTG CDS DC588519 DC588515
吴 硕，等：柿属 (Diospyros L.)EST-SSR引物设计及遗传多样性研究156 第 3期
图 a-e分别为引物 15、30、69、80和 99对湖南乌柿、浙江野柿、美洲柿 (雌 )、浙江柿、
美洲柿 (雄 )、云南野毛柿、青化北野柿、无核软枣和青化南野柿的扩增。
图1 特异性引物标记
Fig.1 Special makers
图 2 9个柿属种质资源样品聚类分析
Fig.2 Dendrogram of 9 germplasm resources of Diospyros L.
本试验确定了柿属常见种的亲缘关系，这对于加
速柿属 EST资源的开发利用、丰富其分子标记类
型、遗传资源评价、绘制遗传图谱和实现特定性
状的辅助选择等研究都具有重要的意义。
157第 32卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
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[本文编校 :吴 毅 ]