全 文 ：农业生物技术科学
中国农学通报 第24卷 第8期 2008年 8月
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蔷薇科(Rosaceae)树莓属(Rubus L.)，又名悬钩子
属，落叶稀常绿灌木、半灌木或多年生匍匐草本植物[1]。
树莓种类繁多，形态多异，主要产地在北半球温带，少
数分布到热带和南半球，据陆玲娣1983年统计已知的
树莓属植物有750余种 [2]。树莓具有丰富的营养和独
特的保健功能，具有很高的营养价值和药用价值[3~5]，
是一类重要的小浆果类果树。欧美许多国家都利用不
同的分子标记对悬钩子类果树（树莓和黑莓）品种间的
基金项目：云南省自然科学基金重点项目（2003C0015Z）及云南省国际合作项目（2001GH11）云南省应用基础研究面上项目（2006C0093M）。
第一作者简介：杨燕林，女，1981年出生，云南大理人，植物保护学学士，初职，主要从事悬钩子属植物资源研究工作。通信地址：674100 云南省农业科
学院丽江高山经济植物研究所。Tel：(0888)3113771，Email：douding986@sina.com。
通讯作者：唐开学，Tel：(0871)5120870，Email：kxtang@pubilc.km.yn.cn。
收稿日期：2008-05-26，修回日期：2008-06-13。
悬钩子属植物分子标记技术和基因组研究进展
杨燕林 1,唐开学 2,和加卫 1,朱映安 1,和志娇 1,杨正松 1
（1云南省农业科学院丽江高山经济植物研究所，丽江674100；2云南省农业科学院，昆明650231）
摘 要:中国有着丰富的悬钩子属植物资源。近几年来,随着国内外分子生物学研究方法的不断提高和完
善,国外对悬钩子属的植物深入研究取得了较好的效果。而国内利用分子生物学手段研究该属植物的报
道还较少或欠深入。综合有关文献,笔者综述了国内外悬钩子属植物DNA分子标记技术应用情况和主
要的研究领域,遗传图谱构建及基因定位的最新研究进展,并对其研究前景进行了讨论。认为既要看到
各种分子标记方法在悬钩子属植物生物学许多领域得到了广泛的应用,并取得很好的效果,也要充分估
计这些分子标记方法在使用过程中具有局限性。文章指出,根据不同的研究目的以及研究对象,采取不
同的分子标记方法是研究取得成功的关键。同时,选择适当的分子生物学手段对悬钩子属植物进行广泛
和深入研究,对该属植物不论是在生产上的应用,还是生物多样性的保护方面都有不可估量的作用。
关键词:悬钩子;基因组;分子标记
中图分类号:Q7 文献标识码:A
Progress in the Molecular Technology and Gene of Rubus L.
YangYanlin1, TangKaixue2, He Jiawei1, Zhu Yingan1, He Zhijiao1, YangZhengsong1
(1Institute ofAlpine Economic Plant, Yunnan AcademyofAgriculture Sciences, Lijiang674100,
2Yunnan AcademyofAgriculture Sciences Kunming, Yunnan 650231)
Abstract: China has rich resources of Rubus L. In recent years, a deep research of Rubus L. abroad has
reached good result due to the development and improvement of research methods in the field of molecular
biology; while in our country there are only very few or shallow reports on the research of Rubus L. using
molecular biological methods. By referring to relative materials, this paper summarized the application of
molecular markers of Rubus L., its main research field and the newest research progress in construction of
genetic maps as well as gene identification of Rubus L. Besides, the applying future of its research was also
discussed. It pointed out that the molecular methodologies were applied widely in many fields of biology of
Rubus L. and good result has been reached, but most of the methodologies were still used with limitations.
Therefore, for the success of the research it was the key to choose different and suitable methodologies ac-
cording to research aims; and selecting appropriate means of molecular biology in its extensive and deep re-
search is going to play an inestimable role in the production application and the protection of biodiversity of
Rubus L.
Key words: Rubus L., gene group, molecular markers
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亲缘关系估测、品种的快速鉴定、优良基因的定位和筛
选以及遗传连锁图的构建等方面进行了深入研究，这
些深入研究为树莓育种奠定了良好的基础。而国内对
该属植物的遗传多样性分析及系统演化研究等反面的
研究相对较少或欠深入。中国悬钩子属植物资源丰富，
分布广泛，作者通过收集国内外大量文献资料，综述了
悬钩子属植物的DNA分子标记技术应用情况和主要
的研究领域，遗传图谱构建及基因定位的最新研究进
展，为中国悬钩子属植物的深入研究提供参考依据，促
进中国树莓产业的发展。
1悬钩子属植物分子标记技术的应用与发展
1.1RAPD(RandomamplifiedpolymophismicDNA,即
随机扩增多态性DNA)标记
随机扩增多态性DNA是由美国科学家Wiliams[6]
和Welsh[7]在PCR（polymerasechainreaction，聚合酶链
式反应）基础上几乎同时发展起来的。
RAPD标记可以在对受试物种缺乏任何分子生物
学研究的背景下，直接对基因组进行多态性分析；操作
简便，适合大量样本的快速分析。RAPD具有几乎是无
限的信息量，快速，高效，自动化的特点，1993年Parent
首次报道RAPD技术用于树莓栽培品种的鉴定[8]后开
始被广泛用于研究悬钩子属植物，Parent发现同一品
种采集于不同地点、生长的不同时期或是不同繁殖方
法得来的材料，都会得到相同的特异性条带；树莓栽培
品种的识别以及估计它们间的亲缘关系[9,10]，Fernan-
dez,M.P.等用10个随机引物和7个微卫星点鉴定了
在亲缘关系比较近以及在现代育种中频繁用到的比较
难区分的36个树莓栽培品种，两中标记都能区分亲缘
关系较近品种以及准确估计他们之间的遗传多样性，
能为育种工作者的品种权提供有力的证据；悬钩子属
种间和种类的亲缘关系 [11,12]、Korbin,M.等用 11个
RAPD随机引物和16对ISSR引物估计36个栽培品
种间的亲缘关系以此来确定它们的育种的稳定性，从
两个分子标记得到亲缘关系图谱虽然个别地方不同但
都非常相似，在这些分析中RAPD都能准确估计品种
间的亲缘关系，有些不同的品种只是品种名不同而基
因型非常相似，RAPD技术在树莓品种的鉴定中能更
准确的估计品种间的亲缘关系。亲子鉴定及种质来源
分析[13~17]，悬钩子属植物存在无融合生殖现象所以种
的鉴定非常难，特别是在鉴定杂交后代是有性生殖
还是无性生殖，单靠外部形态难以区分，而加上
RAPD技术辅助就更能准确的估计出种质来源的情
况；野生树莓的基因型分布以及遗传多样性分析与
遗传分化[18,19]Graham,J.等发现覆盆子在苏格兰的分布
上遗传多样性随着地理空间间隔距离增加多样性也随
之增大；悬钩子的系统分类[20~22]，李维林等用了 17个
随机引物在悬钩子属的5个种的15个个体中检测到
187多态性带，觉得RAPD技术可用于检测悬钩子属
植物遗传多样性，分类鉴定及悬钩子属的系统分化；单
性莓组种群遗传多样性与遗传分化 [23]，KorpelainenH
等发现兴安悬钩子虽然形态上存在很大的区别，但是
遗传多样性非常低。
虽然RAPD广泛应用于悬钩子并取得很好的效
果，但是不适用于属下的种间关系及属间关系分析，而
且稳定性和可重复性不如AFLP、SSR[24]。
1.2AFLP(Amplifiedfragmentlengthpolymorphism,扩
增片段长度多态性)标记
扩增片段长度多态性是 Zabeau和Vos等[25]提出
的，就是将基因组DNA经限制性内切酶（通常1个含
6碱基识别位点，如EcoRI或PstI或SacI，另一个含
4碱基识别位点，如MseI或SseI）双酶切形成不同分
子量的随机限制片段，再将特定的接头连接在这些片
段的两端，形成一个带接头的特异片段，用接头引物进
行PCR扩增，扩增产物经聚丙稀酰胺凝胶电泳后就可
鉴定限制性片段长度的多态性。AFLP标记既有RFLP
的可靠性，也有RAPD的灵敏性。该标记系统通过少
量的引物扩增产生了数量丰富的带型标记，并且分辨
率高，是一种十分理想和有效的遗传标记。
AFLP主要应用于亲子鉴定及种质来源分析，
AFLP方法首次被Johannes应用于欧洲树莓亲子鉴定
及种质来源分析[25]，他们最后得到的结果认为多倍体
的悬钩子种只不过是遗传差异非常低的假融合现象，
但在自然条件下也是存在有性杂交的从而保证了悬钩
子属植物的遗传多样性；而随后被应用于研究生物入
侵种粗叶悬钩子的遗传多样性[26]，发现本土树种的遗
传多样性高于入侵种的遗传多样性，从而有助于认识
入侵种的来源问题；北悬钩子的遗传多样性[27]，Han-
nele等研究的北悬钩子的6个居群发现遗传多样性很
高表明有性繁殖在这几个居群中起着很大的作用，最
近培育的新品种通过 AFLP也能明确的把他们区分
开。AFLP最近则被用于构建树莓的基因组的遗传连
锁图，并与 SSRs等标记被认为是构建“饱和”图谱的
有力工具[28]。
AFLP在应用中的缺点是其标记呈孟德尔式遗
传，非互显性，而且需要的价钱相对RAPD较高，对技
术人员的要求也较高。
1.3SSR(Simplesequencerepeat,简单序列重复)
SSR也称微卫星（Microsatelite），指的是在真核基
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因组中以少数几个核苷酸（多数为2~4个）为单位多次
重复的DNA序列。SSR技术就是对真核基因组中以1
至5个碱基为基础的重复序列进行PCR扩增，经电泳
分离，观察其变化的情况。由于在重复序列的两端往往
是趋于保守的DNA序列，因此可以利用和两侧区段
互补的短序列引物经PCR扩增反应、聚丙烯酰胺电泳
或放射自显影，得到因简单重复序列数不同而引起的
扩增片段的多态性。
由于SSR在真核基因组中很丰富，且它具有丰富
的多态性和信息量、共显性遗传和PCR扩增结果重复
性好等优点[29]，许多研究者都致力于开发出适合研究悬
钩子属植物的微卫星标记且取得了一定的成绩，Am-
selem等人从生物入侵种粗叶悬钩子中开发出的8个
微卫星标记[30]，随后就应用于其遗传多样性的研究[26]，
Graham等首次提出了适合用于研究野生树莓基因流
与根腐病抗病基因的SSR分子标记[31]，随后用PstI为
探针在基因组文库中选出10个微卫星标记，为研究悬
钩子属植物红树莓栽培种和野生种之间的基因流子标
记研究提供了一个新的研究手段，并对其在不同悬钩
子属植物中的应用进行了论证[32]，用SSR和AFLP和
EST-SSR标记一起构建了树莓的第一个基因组的遗传
连锁图后[28]最近又开发出了60个微卫星标记用于研究
构建红树莓遗传连锁图和45个微卫星标记用于究构
建黑树莓遗传连锁图谱[33]，构建控制树莓茎杆柔毛有无
的H基因的基因图谱[34]。
SSR应用中的主要缺点是由于SSR两侧引物具
有物种特异性，在具体实验中引物设计费时耗力[32]。
1.4ISSR(inter-simplesequencerepeat简单重复间序
列)
ISSR分子标记是在SSR标记基础上发展起来的
一种新技术，其基本原理是在SSR的5或3端加锚
14个嘌呤或嘧啶碱基，然后以此为引物，对两侧具有
反向排列SSR的一段基因组DNA序列进行扩增。重
复序列和锚定碱基是随机选择的，扩增产物经聚丙烯
酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后，每个引物可以产生比
RAPD方法更多的扩增片段，因此，ISSR标记是一种
快速、可靠、可以提供有关基因组丰富信息的DNA指
纹技术[35]。
ISSR标记用于悬钩子植物的研究报道还比较少，
Korbin,M.等用11个RAPD随机引物和16对issr引
物估计36个栽培品种间的亲缘关系以此来确定它们
的育种的稳定性，从两个分子标记得到亲缘关系图谱
虽然个别地方不同但都非常相似，在这些分析中ISSR
与 RAPD都能准确估计品种间的亲缘关系[11]；HONG
Y.-P等用于研究红树莓和黑树莓的遗传多样性取得
很好的效果，认为将来可以用于生物遗传多样性保护
和育种方面等的研究[36]。
虽然大多数的研究表明，ISSR分子标记具有许多
优点，但是也有一些研究表明，ISSR在对一些物种进
行遗传多样性评估时，结果可能低于别的分子标记手
段，原因可能是SSR基因在一个种群中分布状态不平
均，或是SSR基因不同的进化方式所导致[37]。
1.5DNA序列分析
最充分揭示 DNA多态性的方法是DNA序列分
析，用得最多的是用“通用”引物扩增 mtDNA、ctDNA
或核DNA片段，随后直接测序。现阶段，悬钩子植物
的DNA序列分析研究主要集中在核DNA片段测序
分析方面。
核DNA片段测序分析可以获得大量的可靠数据。
Alice等人利用对ITS序列测序得到的大量分子数据首
次阐明悬钩子属的系统进化关系[38]，并认为ITS序列是
研究悬钩子属植物种内或种间的系统发生和进化的强
有力工具。后来又不断补充新材料获得更多的分子数据
来完善悬钩子属的系统进化[39]，同时还利用ITS序列来
证明悬钩子属植物不同居群间的杂交和基因流[40]。利用
ITS序列分析壳针孢书属的系统发生关系时发现来自
不同树莓品种的树莓壳针孢属于同一株系[41]。这些研究
虽然取得了很好的效果，可在后来ClifordW.等利用
ndhF基因序列来分析空心莓亚属的两个种的分类问题
时认为ITS存在缺点，不及ndhF的效果好 [42]。说明
DNA测序在悬钩子属上的应用还存在争议，得继续对
大量悬钩子属植物进行深入研究找到合适的标记序列
来解决种群学和系统学问题。
2遗传图谱研究现状
Grahametal等[28]率先用 AFLP、SSR和 EST-SSR
三种分子标记构建了来自欧洲多刺、棕色茎杆、果小、
抗病性强的红莓品种GlenMoy与来自北美无刺、绿色
茎杆、果大、风味好但抗并性差的红莓品种Latham的
杂交后代群体的789cM长的遗传连锁图，最近又在现
有的基因图谱上增加了20个微卫星标记构建了控制
树莓茎杆柔毛有无的H基因的连锁群3、5和6谱[34]。
悬钩子属植物遗传图谱的构建相对同科其它属植物起
步较晚，现在还属于初步阶段，还不能有效的应用到生
产上。
3悬钩子属基因研究
对悬钩子属植物基因研究主要集中在与悬钩子植
物抗病、成熟期和果实大小、颜色和气味相关基因和基
因片段等几方面。
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表1分子标记以及它们在悬钩子属植物研究与培育新品种中的应用总结
分子标记
RAPD，SCAR标记
AFLP标记
SSR标记
ISSR标记
DNA序列分析
特殊基因引物的PCR
用途
品种鉴定、亲缘关系、居群结构、系统分类、遗传多样性
遗传多样性、品种鉴定、图谱构建
遗传多样性、图谱构建
遗传多样性、亲缘关系
亲缘关系、系统分类
病害的诊断
研究认为树莓植株茎杆柔毛有无与树莓抗病性有
关，如果茎杆密被柔毛的话则抗茎腐病、灰霉病和炭疽
病；但是容易感染茎斑病、黄锈病和白粉病。而控制树
莓茎杆柔毛有无的基因是H基因，虽然H基因是如何
影响植株抗病性和感病性还不知道，现已被深入研究
还构建了其基因图谱[34]。在很多植物中，已证实苯丙氨
酸氨裂解酶 (PAL)在果成熟有重要的功能。Amrita
Kumar等研究了编码苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)的两个
基因RiPAL1和RiPAL2在树莓中的结构、表达和进
化[43]，随后又研究了编码聚酮化合物的基因家族PKS
的十个基因（Ripks1-10）在果实成熟过程中的表达形
式[44]。随着对悬钩子属植物基因组的深入研究很多都
应用到生产上，利用基因枪等方法将H基因转化到树
莓植株中，得到的转基因植物在抗病性和果实大小等
方面都表现比较好。
4问题与展望
中国是树莓属植物的重要分布中心之一，已发布
的有202种、92个变种[45]，其中特有种 138种[2]，面对
这样丰富多样的物种资源国内对其各方面的研究多数
限于传统的研究方法。国内采用分子生物学对种和类
型的遗传多样性研究相对较少或欠深入，除用RAPD
方法研究悬钩子属系统分类与遗传多样性外未见用其
它分子标记对树莓进行遗传多样性和其它方面的研
究。这不但影响了对中国丰富的悬钩子属植物的利用
及其产业化的发展，还影响了对这个学科的了解及其
生物多样性的保护。
随着当今世界分子技术的飞快发展，加快和促使
了人们对各个领域的深入研究，分子标记手段的普及
和不断改进以及新的分子标记和优秀的科研人员不断
涌现，还有国外对悬钩子属植物的深入广泛研究为中
国加强对悬钩子属植物研究奠定了良好的基础，对中
国的悬钩子属植物的深入研究将会实现。从悬钩子属
植物核DNA和叶绿体DNA中分离出的微卫星标记
将在亲子鉴定、种群结构、物种形成、遗传资源保护和
遗传连锁图的构建中起越来越大的作用；大规模基因
组学研究将会为悬钩子属DNA不同区域和类型的多
态提供新的证据；不断增加的DNA序列将会进一步
促进物种的系统发生与遗传进化研究；构建悬钩子属
植物遗传图谱逐渐趋于饱和并用其研究数量性状将为
悬钩子属植物提供新的研究平台；利用不同的分子生
物学手段研究悬钩子属有效的种群大小、基因流在种
群中的分布状况将在保护物种方面起到重要作用。
虽然各种分子标记方法在悬钩子属植物生物学许
多领域得到了广泛的应用，并取得很好的效果，也要充
分估计这些分子标记方法在使用过程中具有局限性。
根据不同的研究目的以及研究对象，采取不同的分子
标记方法是研究取得成功的关键。分子标记以及它们
在悬钩子属植物研究与培育新品种中的应用总结表
1，利用适当的分子生物学手段对中国悬钩子属植物进
行广泛和深入研究，掌握越来越多的该属植物大量的
分子生物学信息，对该属植物不论是在生产上的应用，
还是生物多样性的保护方面都有不可估量的作用。
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