全 文 ：嗯
苹果属核糖体 D N A的
分子分析和克隆化
C
.
J
.
S im o n N
.
F
.
W
e e d e n
对小苹果两个基因型 ` Whi te人 n ge l’ 和 ` R o b“ ta 6’ 的核锗体墓因进行了鉴定以测定墓 因型之间和 羞 因 型
内的异质性程度 。 最初用大豆 r D N人克隆序列进行 的研究未能侧定苹果属某些荃 因间的间隔区段 .设什出一种 利
用电泳 法纯化的苹果属 r D N A的交 替探侧法 。 将整个墓 因组 D N A用 13种核酸内切限制酶的混合物进行 双 消 化 ,
确定 了 35 个 限制 位点的位里 。 在 小苹果彗 因型间和基 因型 内都观察到 限制位点的 多 态 性 。 将 ` W h i et 人n `el ’ 中
的核箱体 D N A在噬菌体和质粒载体 中克隆并 用 n 种醉进行定位 , 确定了引起长度异质性的间隔区 。 这些 克 隆 可
用作遗传标记并用于检侧苹果属及 其相近 分类群的群体动力学和分类学。
勺
尽管核糖体基因具有实用性和重要性 , 但在许
多园艺作物中还来检测过 . 作为我们努力应用分子
技术进行苹果育种和苹果属种质特性记述工作的一
部分 , 我们研究了 4 55核糖体的重复单位 . 最 初我
们用豌豆和大豆中的异源克隆 做 S o ut h e , : `杂 交 分
析 . 然而 , 随着我们研究的进展 , 很显然 地 同 源
r D N A探针变为需要 ; 我们这里报道苹果属几种 核
糖体D N A克隆的分离以 及 小 苹果基因型 ` w h i te
A n g e l
’ 和 ` R o b u , t a s ’ 中 4 55 r D N A重复单位的
限制定位 .
材料和方法
、
植株材料 小苹果基因型 ` w h i t e A n 吕e x’ 不}-
`
R o b u s t a s
’ 是从纽约州立农业试验站 获 得的 .
`
R o b u s t a s
’ 是 从 用 于 砧 木 育 种 的卜l d l u s x
r o b u s t a杂交后代中选出 的 . ` W h i t e A n g e l ’ 没
有明确的分类地位 , 但看来似乎来源于三 叶 海 棠
( S im o n 等 , 19 9 1 ) . 叶片材料于 8 月初从成熟 l` }勺
单株树体上采得 . 把叶片浸 泡 在 1D 多 的 漂 自 剂
( 0
.
525 万次氯酸钠 ) 溶液中 , 10 分钟后用清 水 冲
洗干净 , 去除中脉后 , 将叶片等分 为 2 09一 组 , 浸
丁: 液氮中不与结 : .
D N A分离 按 ! }具M u r r a y 等 ( 198 0 ) 的方法 经
适当改变从冰冻样品中分离D N A . 在有法氮 存 尤
的条件下 , 把每一 2 09冰冻的叶片样品首先在 不 诱
钢搅拌器中粉碎 . 将粉末转至盛有 15 Om l冰冻核 酸
提取缓冲浓 ( p H 二 7 . 5 ) 的玻璃搅拌器中 . 缓冲液
含 2 . 85 M 一上l 梨 糖 醉 . 0 . IM T r i s缓 冲 液 , s m M
E D T A和2 0m M亚硫酸氢钠 。 把混和物快 i屯搅乎’ f生均
匀 , 然 后 通 过 两层干酪包布和 一层米拉 布 ( M ir 唱
cl ot h ) 过滤到在冰 _ !二的离心瓶中 , 瓶子置于S or v al l
G S A转子里 , 在 4 ℃下 !’ J 50 X g 旋 转 15 分 钟 . 小
心地将片状沉淀在 5 m l沂鲜提取缓冲液中再 悬 浮
并转移到 50 m l离心管中 . 化管中加 5 0m l核溶 解 缓
冲液 〔0 . 2M T r i s , 5 0m M E D T A . 2 M N a C I ,
2 多+ 六烷基三甲 基 嗅 化 铁 ( C T A B ) 〕 . 再加
Z m l s 多 s a , k o s y l , 将溶液摇匀 . 混和物在6 5℃
下温育2 0分钟 , 然后用15 m l抓仿 /异戊醇 ( 2 4 : 1 )
提取 . 生长季后期采的叶片上产生大是的浑浊物 .
可能是水相的碳水化合物 . 用多达 6 次的抓仿提取
并在10 , OOD x g下离心除去浑浊 物 . 已 澄 清 水 层
中的D N A用二倍体积的冷 乙醉沉淀 , 将沉淀 物 绕
于玻璃棒上搅出 . 并在65 ℃ 一 ;IJ用 3 . 6 m l T E缓冲 液
( 10m M T r l s
.
pH 7
.
5
,
lm M E D T A ) 溶 解 l 小
时 . 不浓物沉淀下来 . 收集 _ !: 层 i寿液 在 .l ℃下 保
存 .
分子定位 用多利`限制酶洛绿一D N A s 等分 试
样 ( s m g ) 进行单消化不l]双 消 {匕. 定位在苹 果属
r D N A
_
L的酶包括A p a l , B a m H l , B g l l . D r a
I
,
E e o 只 1
.
E c 0 R V
,
} 萝i n D I , K P n l , S a c l , S Ph
I
,
X b a l
,
x h o l 和 x m n l 。 在供应厂商建议的
条件下 , 衍种酶用 10 个单 {、、 庄25 旧反应体 积 中进
行消化作用 , 过夜 . 在少除 R N A 的反应中应 用·了核
糖核酸酶 ( R N a s e A ) ( 1 00 m g · m l 一 且 ) 。 双消化是
用一些酶的混和物分两步 .进行的 , 以 使反应盐浓度
达到最适 . 将E co R l酶月{x b a l 酶选作双消化体系
中的标准参照物 , 因为它们所 t7J 的位点在苹果核搪
体的重复单位 _ _卜分布广 , 而 目. 它们是最先被用来给
重复单位的编码区和间隔区定位的 .
用 0.7多琼脂糖平板凝胶 在 1x TB E 缓 冲 液
( 0
.
08 9 MTr is
,
2 0m M ED T A
,
0
.
08 0M硼酸 . PH
7
0
6 ) 中在低 电压 ( I v · c m 一 1 ) 下跑 电泳分 离 限
制性D N A s 。 用OS ut h e nr ( 197 5 ) 所描述的吸印 技
术将凝胶中的D N A 转移到硝基纤维素膜上 .
把三个D N A s做成探针用于探查滤膜 。 按照 制
造说明用D N A聚合酶 I / D N A酶 I 把含有 豌 豆 核
糖体基因整个重复单位的质粒进行切 口转移并用于
最初的定位 。 然后 剥 下 硝 基 纤 维 素膜 , 把 从
J
.
D o yl
e获 得 的 大 豆 克 隆 r D N A 的 重 复 单 位
( D o y le
,
19 85 ) 与这些滤膜杂交来确定间隔 区 是
否能够分辨得清 楚 些 . 对 ` w hi et A n ge l ’ D N A
用E e o R l , E e o R v 于「B c l l 三消化后得到相对 纯
的间隔区序列 . 再肘凝胶分离得到间隔区的同源探
针。 大约 25 0林g 经三重消化后白佗田 N A 在0 . 7琼脂糖
制备凝胶上在低 电压 ( I v · c m 一 1 ) 卜跑电泳 , 并
用嗅乙锭染色后 , 用从B i o1 01 获得的一套设备 . 应
用粉状玻璃法 ( p o w d e r e d s l a s s m e t h o d ) 从凝胶
切片上分离和提取出一段 6 一 k b rD N A片 段 , 该片
段 比凝胶中其他D N A 具有更高的分子 量 . 将 6 一 k b
片段进行切 口转移并与先前用豆科植物探针检测过
的同一批滤膜杂交 .
开始时 ,杂交是在42 ℃ ,有 40 多甲酞胺存在的条
件下进行的 。 后来 , 用没有甲酞胺的缓冲系,统得到了
更好的结果 , 但需要在65 ℃下温育 . 这一过程中使
用的缓冲液含0 . 75 M N a C I . 125 m M柠檬酸二水合
三钠 . 0 . B终S D S , 5 0 m M N a : H p O ` ( 用 I n H C I将
PH 调到 7 . 2、 7 . 4 ) , 5 倍 的D e n h ar d t s溶 液 , 2
.
5
m M E D T A
.
5 多葡聚糖硫酸醋以及1 00协g变性的
小牛胸腺D N A / m l . 滤膜的清洗是在65 ℃时在 2 倍
S S C
,
0
.
1书S D S中进行的 . 经过一 次 3 0分 钟 和 2
次 1 小时的冲洗之后 , 将膜包被在一个簿的塑料膜
里 . 在一 70 ℃下对着 X 一光软片放置 , 并 用D u P O nt
C r o n e x 增感屏 .
`
w h i t e ^ n g e l
’ r n N A 的 分 子 克 隆 切割
约 40 0卜g的 ` W h i t e A ” g e l ’ D N A , 使 与 各 20 0单
位的E e o R I 和 B e l l 配合 . 低电 压 ( I V · e m 一 1 )
下将限制产物在 0 . 7终琼脂糖平板凝胶土 电 泳 . 凝
胶于黑暗中用澳乙锭染色并用蒸馏水脱色数小时 ,
以提高各个带的清晰度 . 同时也将凝胶中的 T BE ,
特别是硼酸稀释 . 随后将凝胶平板放在塑料包裹物
上用紫外光 ( 3 OZn m ) 瞬时照射摄影 , 仔细检 查所
得的照片 . 根据前面定位研究已知核箱体基因片段
的大小约为 4 k b和 6 k b , 据此确定与其相 对 应 的
带的位置 . 用一把新的剃须刀片把带有rD N A序 列
带 的 凝 胶切下来 , 然后用粉状玻璃法 ( V og el s t -
ie n
.
1 97 9 ) 从切下的凝胶中把其中的D N A提 取出
来 。
大小如 4 一 k b和 6 一 k b片段的各级别经 纯 化 的
插入D N A 以两种浓度分别与0 . 5协g商品化 脱 磷 酸
的入g t l o噬菌体臂段混合 . D N A重里的相对浓度 约
为 1 : 1 和 4 : 1 ( 入g t 10 : 插入D N A ) . 连接 反
应的 10闪反应体积中包括D N A酶、 二单 位T ` D N ^
连接酶 , 5 0m M T r i s · H C I p H S . 0 , 7 m M M gC I * .
l m M D T T 和 0 . s m M A T p , 于 4 ℃下过夜 . 用商品化
的包装抽提液 ( P a c k a g e n e , P or m e g a )把连 接D N A
装入噬菌体。 用反应的稀释液感 染 新 鲜 培 养 的
C 60 0 h f l E
.
c o l i菌株 , 在 0 . 7形L B上层琼 脂铺板 ,
以得到反应的近似效价值 .
按照膜 ( 菌落 /噬菌斑筛网 , N E杖 ) 的制作者
的要求把噬菌斑上的D N A挑起 . 筛选滤膜用 的 探
针是由将含有大豆核搪体基因的质粒中的凝胶纯化
插人D N A进行切 口转移而制备的 . 按上面所 述 的
方法将滤膜杂交并冲洗。 按M a n i a t i s等 ( 19 8 2 ) 所
述 , 用 巴斯德吸管将与放射自显影图 _肚正号相对应
的噬菌斑吸出 , 再次铺板予以确认 。 用已确认为阳
性物的高密度平板来制备 D N A微型制 剂 . 并 通 过
oS ut he rn 分析做最后鉴定 。 对与大豆 r D N A探 针表
现同源性的含有适宜大小捅入物的分离物选出进行
亚克隆 . 以获得p U C 13质粒 .
对苹果属 r D N A后来进行的分析集中在含有 基
因间隔区的 6 一 k b插入物上 . 为了便于操作和分析 .
将 6 一 k b E co R I 插入子从含有 阳 性 克隆的噬菌体
中取出并亚克隆成为 pU C 13 质粒 . 将从噬菌体分离
出来的D N A 微型制剂约 2 协g用E co R I 限制酶切并
在 0 . 7多制备琼脂糖凝胶上电泳 . 按如前所述方 法
把捅人子从凝胶土切下来并用粉状玻璃法提取 . 将
这个D N A I司1 00 n g商八产;脱磷酸 p U C 13载休连接 , 取
2 0件l , 在如前所述的条件下过夜 . 把 1微升经过 5倍稀
释的连接产物转入足 冠的D H 5 a细菌细胞 ( B R L )中
并铺于 L B平板上 , 平板含75拼g · m l 一 1氨节青窗 素 ,
2 0协g · m l一 x 一 g a l基因和 0 . l m M异丙基书 一 D 一硫代
半乳糖六环普 ( IP T G ) . 第二天早上挑出白色菌落并
使之在 5 m l含 50卜g · m l 一 1氨带青霉素的液体L B中
生长 . 通过 iL cl 煮沸过程从培养物中提取质粒D N A
沙
珍
了
曦(W l l l mz ig
.
198 6 )
.将最后的片 状 沉 淀 溶 于
10 0川无菌燕馏水中 。 一个 5一闪的 等 分 试 样 用
E co R I限制并用凝胶电泳法分析 .将凝胶吸 印 在
硝基纤维素膜上 .与标记的大豆探 针 D N A杂 交 。
将表现阳性的含有擂入子的克隆留下做进 一 步 分
析。
重复单位的定位 由干基因组 D N A的定 位 表
明几乎所有的多态现象都是 在 6一 kb片 段 上 发 现
的 , 所以仅仅对 6 一 k b序列进行了限制 定 位 。 所有
用于基因组D N A 定位的酶类用来进行双 消 化 , 对
三个阳性亚克隆 ( p A R 7 2 , p A R 73和 p A R 77 ) 进行
了限制定位 . 为了分辨某些多态性区 域 , 例 如 从
6 ` 端到加 S编码区的区域和 3 ` 端到2 65编 码 区 的
多态区域的细微结构 , 需要进行多种的双消化 . 在
1 终琼脂糖T B E凝胶上对消化产物进行分析。
亚市复定位 以下叙述的初步证据表明决定间
隔区长度变异的假定亚重复可由Sp h l 的酶切 位点
定出 . 用S ph l 或D .r 1限制二个克隆的D N A并 在
3 拓N us i e v e G T G 琼脂粘 ( F M C . R o e k l a n d ) 凝
胶上进行凝胶 电泳 , 作为分子溉标准的H ae l 所切
的中x 174 〔 3 协g ) 包括在内。 从 如上制备的D N A
微型制剂中分别取 5 t1[ 和 15州丰羊`异,D N A . 先在 2 . 9
V
·
c m
一 1下 电 泳 2 0分 钟 . 再 在 5 . 8 V · c m 一 1下 电
泳 , 直到澳酚蓝的染色径迹接近凝胶底部。
结果与讨论
核糖体基因的编码区六各分类群间极端保守 .
E c k e n or d e等 ( 19 85 ) 报道刘 卜米和大豆核糖 体序
列的序列分析表明 18 5编码区 中98 形具有保守 性 ,
6
.
8和 2 65区中舫多为保守性 . 这一事实使我们用核
糖休贡复单位的编码区进行的限制图配位工作变得
容易 了. 苹果属 r D N A和且它分类君仕D N A 之 间限
制位点在编码区内的许 多地方具有相似性 .
豌豆和大豆探针表明节果属的两个垫因型的每
孟一`叨一汉。明一工二心闪一心óQ上一卜们
一工``国公^。以一区。口口一工`心闰一.弓X一ùP。ō工一心ó自一志卜门
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一
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、匀 h ir七 A n g尸 { r D N A
落 马健“ 】城 落哟一`洛义一`-试ǎ只
。乙1。`减一。`犬l e`吠
图 l 由整个墓因组 D N A 定位推出的 `R o b u s t a s ’ (上 )和 `W h i t e A n g e l , (下 )的
一般化的 r D N A重复单位的限制图 。
括 号中的百 分数 表明位点 大约 以 所标明的重复单位的比例 出 现 。 B gl l , B gl l 和 A p a l 未 定 位 在 ` Whi et
人 n g el ’ 上 . 深粗 线条表示 1 85 , 5 . 8 5和 25 5编码区 ( 由左到右 ) 的位豆 . 25 5区域 _ L B a m H I位点边上的星号 表 示
冬 正如 丈中所描述的那样 , B a m H l住点是部分杭消化 的。 这些序列 的街接重 复意味 粉它们是由许多童复一 个 拔 甘
一个编 组在一个阵列中 . 从 ` W ih et A o ge l ’ 中克隆出来供作进一步分析的 b一 k b E c 。 R l片段 包括本图中最左 和
最右端 的区域 .
个重复单位上有一个 X ba l位点和至 少 两 个 E co R
!位点 .几乎毫无例外 , 所有已发表的双子叶植物
的rD N A图都表明X b a l 位点 在 18 5编 码 区 的 6 护
端 . E co R I 位点则接近 18 5 和25 5区域的 3 ` 端 。 用
这两个酶和 E co R V酶进行的单消化 和 双 消 化 作
用 . 结果生成的片段大小类型表明 . 与其他植物相
比 . 苹果属这些酶位点的分布是典 型 的 . E co R V
几乎总是 见 于 5 . 85 区。 因 此 . 我 们 把E co R I 和
X b a l 酶作为标准参照点来给基因图上其它酶 的位
点定位 .
通过基因组D N A 定位实验的解 析 , 图 1 概 括
了两种小苹果基因型 rD N A完全的限制图。 这些 图
说明了这两个小苹果 基 因 型 之 间 的 变 异 性 .
` R ob us at 6
’ 的一些重复单位里有多出的E co R l
和B g l l 酶 限制位 点 。 `W h i t e A n g e l ’ 相对 于
`
R ob us at s
’ 多含有一个 B a m H I位 点 . 所 有的
位点多态现象都见于基因间的间隔区 . 在重复单位
的非编码区内也发现基因型内的变异性并用限制酮
酶标记后面的括号中的数值表示 . 百分数代表包含
每一特殊位点的核糖休重复单位的大约比例 , 正象
根据放射自显影图信号强度肉眼所判断的那样 。 在
`
w in t e A n ge l
’ 中发现的重复单位长度 的 差异
未在图 1中示出 , 这种差异是由 3 ` 端到25 5编码 区
的间隔区中亚重复数的不同而造成的 ( 见下文 ) .
检测小麦 ( T ir it c u m )种系间rD N A 重复单位 分
离区分散速率的热洗提研究表明基因间的间隔区分
散很迅速 ( A p P ] e s和D v o r ak . 19 82 ) . 在苹果 属 和
豆科植物各种间我们发现这种现象更为突出 . 用克
隆化的豆科植物探针得到的结果表明 . 在豆科植物
与苹果属 r D N A 间隔区之间的同源性很低 ( 资料 未
示出 ) . 当 用 豆 科植物探针时 , 完全定位于基因
间的间隔区的限制片段缺失或仅能通过 S o ut h er n杂
交法模糊地分辨出 . 这可能是在所用的条件下它们
的序列已分散到不能与苹果属间 隔区D N A杂 交的
程度。 为了保证制出一张精确的间隔区图谱 , 我们
设计出一种交替探测法 , 用凝胶分离的苹果属探针
使得那些在用克隆 f匕的豆科植物探针时看不到的片
段显现出来 . 这个6 一 kb E co R I r D N A片段对所有苹
果属 r D N A间隔 区的限制片段有很好 的探测效果 .
基因的早期定位表明 6 一 k b E co R I 片段 包含
全部的苹果间隔区 . 为了努力得到此区的相当纯的
序列 , 采用了如下步骤 . 首先 用E co R 1 . E co R V
和B e l l 对全部 ` W h i t e A n g e l ’ D N A进行 三 消
化 . E co R V在 `w h l et An g e l , 里有一个核箱 体
切 点 . 并 且 不 在 6 - k bE OC R I片 段上 。 B cl l 在
`
w ih t e 彻ge I’ rD N A 上没有切点 , 它也具有能
很好消化苹果D N A的特性 . 通过实行三消 化 作用
看到 . 相 对 于 ` w hl et A n ge l, 其 他 的 D N A来
说 . 6 一 k b E co R I核糖体序列是异常的 大 . 将消
化产物电泳后 , 6 一 k b片段与几乎所有其余的苹果
D N A 分离。 很显然 . 这些探针很好地解析 出 苹果
属的间隔区序列 , 正如以后用克隆化的苹果属序列
确定的那样 。
凝胶分离的探针促进了片段排序 , 它的另一特
征是探针仅含于基因的 6 一 k b E co R I , 主 要包括
间隔区和 18 5序列 . 这种探针不 测定对 8 . 9一 k b E co
R l 片段有专一性的片段 ( 为 6 . 85和2 65 r R N A 。编
码的片段 ) . 因此 , 在含有 6 一 k b探针的杂交过程中 .
信号的缺失肯定了用豆科植物探针定位在3 . 9一 k b区
域 的 片 段的位置 。 用于说明片段顺序的最后一种
方法是考虑使用两个探针系统时的信号强度 。 表明
与豆科植物探针杂交得好的条带总是定位 在 编 码
区 , 而来自间隔区的片段在放射自显影图上一般微
弱 . 凝胶分离的探针说明了源自间隔区片 段 的 位
置 , 因为它在来自间隔区和来自编码区的区域所表
现出的信号强度相同 。 这种方法可以用于对其它分
类群 46 5 r D N A 重复进行的类似分析 .
从 ` W h i t e A n g e l ’ 中克隆出来的三个 r D N A
序列 ( 克 隆P A R 7 2 , P A R 7 3和PA R 7 7 ) 的 编 制 图
( 图 2 ) 与基因组D N A定位的结果 很 相 符 . 只有
见于基因间的间隔区的 B a m H I 位点是例 外. 这个
位点在全部三个所分析的克隆中都没有 . 这三个克
隆虽略有不同 , 但却能对多态现象的本从迸 r了比较
精密的检测 。 p A R 72 克隆和 p A R 73 克隆在 它 们 的
X h o l 和 S p h l 图上有所不同 . 相比 之 下 . p A R 7 T
比另两个克隆约小2 0 个碱基对 . 体积大小的多态
性的本质可部分地由限制 酶S p h l 阐 明. 基 因 组
D N A的定位表明所见到的S ph l 片段的总数与整个
序列的长度不相等 。 这与从 3 ` 端到25 5编 码区 S p h
I 位点所在区域中常见的长度多态性的证据联系在
一起 , 使我们做出这样的猜测 , 即假定的决定 长度
多态性的亚重复可能包含一个S p h l 位 点 。 在 3 拓
凝胶上可以看到由S p h l 生成的D N A小片段 . 两个
最小的sP h l 片段合起来大小约 2 0 0bp . 这 表 明 它
们可能代表亚重复 , 而且这个亚重复包 含 2 个 s p h
1位点 . 需要对这些位点所在区域进行序列分析以
砂
诊
了
E e oR I
克隆位乐
住e oR I
克隆!立系
一
2冬一
喊 亚重复区
.侧刃ù谷的三`司自ú.二减一 u住洲三勺左H一.石哎一公自ó u日X
火月。
I K卜
卜一一一一!
J 二
摘 .曰
有
冬
5 0 卜I / D r盈I
j立点
图 2 `W hi e A tn g el , 一般化 的克隆化 D N A 限制图 , 表示 区决 定长度多态现象的亚重复区
准确解析出这些亚重复是如何编组的 . 个克隆中都没有 . 飞廷复进行最初的墓因组 D N A定位
D ar l 限制位点的结果为亚重复区的异 质性提 分析结果证实了 B a m H l 位 汽存在 ; 然而 在 放射
供了进一步的证据 。 虽然这个酶只定位在 基 因 组 自显影图中预计缺少那个位点的序列位置 _h观察到
D N A上 . 但是各克隆的限制图表明由于非常 频繁 一条微弱 }守带 。 这条带在胶初的分析巾被忽视 , 一
的切点导致产生一个附加的D N A 消化和明 显 损失 直被认为是D N A不完全消化的结果 。 但 是 , 从 克
区 ( 资料末示出 ) . 这种情 ,况很象S p h l 对基因 组 隆序列中得到的资料使伐们断定 一些重复单位缺少
D N A 的结果 。 克隆序列分析表明用D ar l 消化后生 这个位点 , 而我们恰好检测的以是这样序 列 的 克
成一个10 ObP 片段 . 这表明每一 亚重复序 列 有一个 隆 .
D ar l 位点 。 与用 S p h l 消 化 的 情 况一 样 , 克隆 对分析过的所有其它限 制 酶 来 说 . 基 因 组
p A R 72 再次表现出一个大小稍有差异的亚 重 复 片 D N A定位产生的图与克隆片段产生 的 图 是 相 配
段 . 这种现象提供了进一步的 证 据 表 明D r a l 和 的 . 因此 , 用同源 D N A 片段来探测间隔区序 列 的
S ph l 类型是相关联的 . 基因组D N A定位方法 , 看来似乎是分析 r D N A多态
对限制酶B a m H I 观察到两个不一致的 现象 . 性的一个极好的方法 . 这一技术不需要有克隆方面
两个小苹果基因型内均在2 65 编码区中有一个 看来 的专门知识 . 只要能够分离出高质量 的 核 D N A 并
似乎是 多 态 性 的 B a m H I位 点 . 但 是 , F l a V e l直 进行单消化 、 双消化和 S o u t h e r n 吸印即可 .
( 198 5 ) 综合报道 . 指出 r D N A 比一般的整体D N A 苹果 45 5 rD N A 重复的结构与在其它双 子 叶
甲基化作用更为普遍 . 大多数限制酶对这种或那种 植物中测得的很相似 ( C h o u m a n e等 . 198 8 ) 不 仅
类型的D N A 甲基化作用敏感 . 位于 2 65 区 中部 的 E co R l 、 E co R V和X b a l 的叹制位点 分 别 存
B am H l 位点出现在克隆的 rD N A 的所有重复中 . 在 于 5
.
85 区内的25 5和 18 5序列 的 3 ` 端和 185 编 码
那里甲墓化作用不是一个限制因子 , 而却 抗 基 因 区的 5 ’ 端 , 而且间隔区的结构也相似 . 靠近 25 5编
组D N A 的消化 ( s i eg el 等 , 19 83 ) . 在苹果属 4 85 码序列 3 ’ 端的亚重复位置和亚重复 的 外 观 大 小
rD N A 图上用星号而不是用括号来表示这 种 “多态 ( 1 90 b p ) 都很典型 .
现象” , 因为很可能位点是存在的但它本身却抗酶 我们检测苹果属核糖体基因的主要兴趣在于对
切 . 重要的是要认识到 , 由于各重复单位间甲基化 这个基因系在将来研究苹果属基因组的编组和分析
类型的差异而产生的拟遗传多态性 , 可能会夸大根 遗传多样性方面的实用性进行评价 . 本研究证明遗
据 R F L P资料对遗传多样性的估计 . 传变异的先决条件确实存在于小苹果各基因型间 .
基因组 D N A 图与rD N A克隆图之间第二个不一 45 5 r D N A 基因系可以用在这种应用 中 . 本研 究
致的现象是B a m H U仪点在基因间时间隔 区 _ _ L . 中做出的图描绘了苹果属 r D N A巾 35 个定位的 限制
B a m H l 位点出现在基因组 D N A 图上但在全 部三 位点 、 代表 了约 2 形的全部核糖体序列 . 这一资料
日本 的果 树栽培 沙
杉山廷
日本由四个主要岛屿组成 , 位于北纬 26、 45 度
之间 . 从亚热带到温带延伸近3 0 00公里 . 山脉将这
个国家分成两个区域 . 东边濒临太平洋 , 西部面向
日本海 . 由于沿太平洋岸自南向北的暖流影响 , 东
部地区的冬季要比西部地区温暖 . 太平洋滨海一带
还有无霜区 .
落果 , 这些果树无法应用棕叶形或中央领导干整枝
方法。
果树栽培与气候条件 ·
夏季 . 南风将太平洋的暖湿气团带给日本 . 所
以 . 东部夏季多雨 , 特别是 6到 9 月 。 正常年份是
南部的降水比北部多 , 因为梅年 6 到10 月 , 日本南
部总要遇到几次台风袭击 。 按生产面积和产最 , 日
本最重要的果树是温州蜜柑(表 1 ) , 占本国果实产量
的 38多 . 果树面积的 29 多 . 其次为苹果 , 其产量和
面积分别占2 0拓和 15 多。 温州蜜柑栽培在日本南部
和东部滨海无霜区 ; 与此相反 , 苹果则生长在 日本
北部 , 因为它们在南部的湿热条件下容易感病 。 其
它果树如葡萄 、 日本梨 、 桃、 柿子等穿插在温州蜜
柑和苹果产区 , 整个日本都有分布 . 日本的果树业
长期以来受到多雨气侯导致的病害和台风引起落果
的打击 . 其结果使生产者形成了一种独特白饮伎术以
克服这些缺点 . 其中之一是套袋 , 即将苹果 、 梨 、
桃和葡萄的幼果用纸袋包起来以防止病虫为害 .
如今 . 果实的病虫害可通过化学药剂防治 , 但
为 了形)kJ 良好的果实外观 . 套袋仍然被采用 . 套袋
对防止苹果和梨的果诱也很有效 .
另一项技术是梨的棚架整枝 . 按传统的棚架 .
通常在高 于 l 米左右分 2 、 3 个骨 于枝 . ’ 它们被绑
缚在 1 8米高的棚架上 , 这一整形 方 法有 两 个 缺
点 , 一是操作不方便 . 二是夏季容易从骨于枝的弯
曲处长出许多徒长枝 。 然而 . 由于台风引起的严重
日本果树业的特点
日本的果树业具有三大特点 , 第一 , 日本的果
园通常很小 , 从表 2 可知 . 90 终以上的果园都不到
一公顷 . 当 然 , 大 多 数果园还同时拥有水稻田 ,
一般水稻田也不到一公顷 . 这些不足一公顷的果园
当然是不足以维持园主生计的 , 所以他们都是些半
农场主 . 第二 , 许多果园 , 尤其温州蜜柑 . 都座落
在山坡上 。 第三 . 果实的生产要求大量的 劳 力 投
入 。 表 3 表明「 , 某些品种的苹果 、 梨 、 桃每公顷的
用工量在 30 0小时以上 , 因为田间授粉 、 疏果 、 套
袋都靠手工操作 . 超过整个用工量的 40 多 . 相反 ,
温州蜜柑和柿子用一!几星相对少得多 , 因为这些树多
数情祝下既不要人工授粉也不需套袋 .
日本果树栽培不到 12 0年的历史 . 许多 果 树如
苹果 、 桃 、 梨 、 甜樱桃 、 李子 、 葡萄等都是在 19 世
纪0T 年代从国外引入的 . 因此 , 比较迟的时侯才形
成吃鲜食水果的习惯 。 水果仍然用来送人情 , 特别
是看望病人 . 所以 , 作为一种礼品 , 要求果实大而
漂亮 。 为了结大果 , 生产者 J巫常进行人工授粉和疏
花 、 疏果 . 为了生产具有 良好外观的果实 , 还安增
加额外的工作量 . 按照进一要求 , 侮公 顷苹呆在疏
果后要用双层纸袋对10 、 15 万只幼果进行套袋 . 在
采收前一个月除去外面的纸袋 , 以便让一些光线能
透过内层的红色纸袋 , 使果实受光 . 为 了刺激果实
着 色 , 采前一周冉除去内层纸袋 , 让果实直接照射
太阳光 . 并且在树冠下铺上含铝的抓乙烯膜通过光
线的反射改善果实的光照 . 有时 . 还人为地转动果
实 , 改善果实阴面的受光 , 促进整个果实均匀地着
矛
可用来解释苹果属其它基因型的限制模式 . 对核糖
体D N A结构的认识可以帮助解释在群体或分 类 研
究中或进行连锁图分析中得到的各种限制类型 .
译 自 ( J . A m e r . S o e . H o r t 。 S e i 。 》
19 9 2
, 1 17 ( 1 ) : 1 6 4~ 1 6 8
译者 王 晶
校者 罗国光 才