全 文 ：第 27卷第 5期 　　　西　南　农　业　大　学　学　报 (自然科学版 ) V o.l 27, No. 5
2005年 10月 Jou rna l o f Southw estAg ricultu ra lUniversity (N atural Science) O c.t 2005
文章编号:1000 - 2642(2005)05 -0616 - 05
柑橘属 2n花粉自然发生与
沙田柚 2n花粉诱导研究①
向素琼 1, 2 ,龚桂枝 1 ,郭启高 2 , 汪卫星 2 ,李春艳 2 ,李晓林 2 ,梁国鲁 2*
(1.中国农业科学院 柑橘研究所 ,重庆　400712;2. 西南大学 园艺园林学院 ,重庆　400716)
摘要:果树 2n配子育种较其他植物起步晚 ,尤其是利用 2n花粉进行育种的研究在柑橘上还无先例。试验中初步观察
了柑橘属部分品种的 2n花粉自然发生情况 , 证实了柑橘属内未减数花粉的存在。同时通过秋水仙碱不同浓度与作用
时间处理促进了柑橘 2n花粉的发生 ,将长寿沙田柚 2n花粉发生比例由当年的自然发生率 0. 87%提高到 9. 76%。初
步观察了 2n花粉离体萌发状况 ,其萌发率与花粉管伸长速度较为正常 ,但萌发启动比单倍性花粉慢。
关　键　词:柑橘;多倍体;2n花粉
中图分类号:S 666. 01　　　　　　文献标识码:A
SPONTANEOUS GENERATION OF 2n POLLEN IN CITRUS AND
INDUCTION OF 2n POLLEN IN CITRUS GRAND IS
X IANG Su - q iong1 , 2 , GONG Gui- zh i1 , GUO Q i- gao2
WANGW ei- xing2 , LI Chun - yan2 , LI X iao - lin2 , LIANG Guo - lu2*
(1. C itrus Resea rch Institu te, CAAS, Chongqing 400712, Ch ina;2. Co llege o f Ho rticulture and Landscape, Southw est Unive rsity,
Chongqing 400716, Ch ina)
Abstrac t:Obse rva tion o f spontaneous occurrence of 2n po llen in a few Citrus spec ies confirm ed the ex istence o f unreduced po llen in them.
T rea tm en t o fCitrus grandis w ith differen t concen tra tions of co lchic ine and a t d iffe rent tim e for po llen ch rom osom e doub ling induc tion en-
hanced the 2n po llen frequency from 0. 87% ( spon taneous occu rrence) to 9. 76%. Exam ina tion o f in vitro germ ination of these 2n po llen
g ra ins revealed that their germ ination percentage and po llen tube e longa tion ra te we re w ithin the norm a l range, though the start of germ ina-
tion w as de layed som ewhat as compared w ith the haploid gam etes.
K ey words:Citrus;polyploid;2n po llen
　　2n配子 ,是由于减数分裂过程中某些因素导致
形成具有体细胞染色体数的花粉或卵细胞 ,常被称为
未减数配子 。由于近年来人们认识到杂合性对于多
倍体成功的重要性 ,而又有研究表明 , 2n配子在传递
杂合性和上位性方面具有特殊价值 ,因而 2n配子在
植物多倍体育种中的研究应用逐渐升温[ 1 ～ 2] 。 2n配
子在马铃薯 [ 3] 、毛白杨 [ 4] 、桑树[ 5] 、柿树[ 6] 、大白菜 [ 7]
上已经有人做过了大量的研究 ,在桃 、李 [ 8] 、枇杷 [ 9] 、
苹果[ 10]和越桔等其他果树上也有关于 2n配子诱导
的报道。有关柑橘 2n配子的研究 ,其 2n雌配子的存
在主要是通过自然多倍体的发现和一些常规杂交中
出现了异常的倍性而推测的 。而 2n雄配子方面 ,则
只有 Cava lcan te等 (2000) [ 11]报道以克里迈丁 (C.
① 收稿日期:2005 -09 - 20
基金项目:重庆市自然基金资助项目(8573)
作者简介:向素琼(1971 - ),女 ,四川苍溪人 ,西南大学博士研究生 ,从事果树遗传育种与现代生物技术研究。
*为通讯作者
DOI牶牨牥牣牨牫牱牨牳牤j牣cnki牣xdzk牣牪牥牥牭牣牥牭牣牥牨牬
clementine)与桔柚 (C. paradisi×C. tangerina)杂交的
后代‘Lee’为研究材料 ,观察其自然授粉植株的小孢
子母细胞的减数分裂时 ,偶然发现其中 1株的花粉粒
大且形状不同 ,可能是 2n花粉 ,另外有 2株在小孢子
发生时期发现有二分体与三分体 ,被认为会产生 2n
花粉 ,目前这方面的研究甚少。长寿沙田柚是我国地
方品种 ,品质优良 ,唯其种子太多(100粒左右),严重
影响其商品价值 。因此本文在观察柑橘属部分品种
的 2n花粉自然发生情况基础上 ,以秋水仙碱为诱变
剂对长寿沙田柚 2n花粉诱导进行了初步研究 ,期望
为利用 2n花粉进行无核育种积累理论和技术资料 。
1　材料与方法
1. 1　材　料
11个柑橘品种的花粉均采自中国农业科学院柑
橘研究所资源圃;2n花粉诱导试材为长寿沙田柚
(Citrus grand is),田间处理部分在柑橘研究所资源圃
进行。
1. 2　成熟花粉粒大小分布观察
于春季花粉成熟期采集柑橘属 11个品种的花
蕾 ,分 2种方法处理:一部分置于干燥器内 ,花药开裂
释放出花粉 ,将花粉分散在加有清水的载片上直接观
察;另一部分先用固定液(甲醇 ∶冰乙酸为 3 ∶1)固
定 ,然后将花粉涂片。在带有目镜测微尺的显微镜下
测量花粉直径 ,每品种计数不少于 2 000粒。
1. 3　秋水仙碱诱导 2n花粉方式方法
于 3月初开始定期采长寿沙田柚花蕾检查其小
孢子母细胞减数分裂进度 ,当多数小孢子母细胞开始
进入前期Ⅰ时 ,进行诱导处理。
处理方式方法:滴液法 ,用脱脂棉包扎花蕾 ,然后
滴加秋水仙碱溶液并保持湿润 。秋水仙碱浓度设定
为 0. 15%, 0. 30%, 0. 45%, 0. 60% 4个水平 ,处理时
间为连续处理 1, 3, 5, 7 d。每一组合处理 20个花序 ,
每花序最多留 4朵花 ,滴药后套袋保湿。以清水处理
为对照 。处理结束后将药液和棉花除去并用清水冲
洗 。最后于花粉成熟期采样观察 ,每个组合观察 2
000个以上花粉粒 ,测量其直径统计出 2n花粉 、正常
花粉和败育花粉的比例 ,方差分析比较各组合的差异
显著性 。
1. 4　花粉萌发动态观察
萌发培养基:在 50 mL去离子水中加入卡拉胶
0. 28 g,蔗糖 15 g,少量硼酸 (约 0. 005 g),加热充分
溶解。
萌发湿室的准备:在可以放置载玻片的适度大小
的培养皿上下盖垫上滤纸 ,用去离子水保持充分湿润。
播种花粉:在洁净的载玻片上倒上萌发培养基 ,
然后用解剖针沾少许含不同倍性花粉的混合花粉点
播于培养基表面 , 载玻片放于培养皿内 , 22 ～ 25℃恒
温培养。观察花粉萌发动态 ,每隔 1 h统计萌发率直
至萌发数不再增加 。
2　结果与分析
2. 1　自然状态下柑橘属 2n花粉发生情况
根据前人对 2n花粉的研究 ,花粉大小与其染色
体数目有正相关性 ,因此可以通过测定花粉直径大小
来判断是否二倍性花粉 。柑橘花粉在水相或经固定
液固定状态下一般为球形 ,基本包含 3种类型的花粉
(见图 1, 2):①正常花粉粒;②2n花粉粒 ,直径约为
正常花粉的 1. 3倍;③败育花粉粒 ,直径约比正常花
粉小 1 /3左右 。通过此标准统计各种类型花粉比例
(见表 1)。供试品种分属柑橘属的宜昌橙类 、枸橼
类 、柚类 、甜橙类和宽皮柑桔类 ,对这 11个品种的自
然花粉连续 2 a的观察表明 ,除汤姆逊葡萄柚 、哈姆
林 、锦橙 3个品种未发现 2n花粉 ,其他品种的 2n花
粉发生率为 0. 05% ～ 2. 95%,不同年份间不稳定 。
其中长寿沙田柚 2n花粉发生率为 2. 04%和 1. 05%。
这些统计结果证明了柑橘属植物未减数花粉的存在 。
观察中还发现 ,正常花粉一般为 4个萌发孔 , 2n花粉
中出现了一定数量的 5个萌发孔。相对于 2n胚囊 ,
2n花粉在实践中更具实用性和可操作性 ,可直接用
于杂交进行无核育种研究 ,但自然条件下供试的 11
个基因型发生 2n花粉的比率还较低 ,无法有效进行
人工搜集 ,直接应用的可能性不大。因此只有通过物
理 、化学方法进行 2n花粉诱导提高发生比例 ,或者将
其有效分离 ,才有可能用于实践 。
图 1　不同大小花粉分布图
Fig 1　Dis tribu tion of pollen size
图 2　 1 , 2n花粉 2～ 6,正常花粉 7,败育花粉
Fig 2　1 , 2n pollen 2～ 6, norm al pol len 7, sm all po llen
617第 27卷第 5期　　　　　向素琼等　柑橘属 2n花粉自然发生与沙田柚 2n花粉诱导研究
表 1　自然状态下 2n花粉发生比率. /2001, 2002*
Tab le 1　D istribution of po llen s ize in C i tru s
品 　种
C u ltivar
观察总数
TotalNo.
正常大小花粉 /%
Norm al pollen rates
正常花粉大小 /μm
Average pol len s ize
2 n花粉 /%
2n Pollen rates
败育花粉 /%
Sm all pollen rates
紫花宜昌橙 2 040(2 150) 98. 28(97. 72) 34. 0 0. 05(0. 09) 1. 67(2. 19)
北京柠檬 2 050(2 100) 96. 15(97. 81) 31. 5 0. 83(0. 48) 3. 02(1. 71)
梁平柚 2 300(2 300) 98. 61(98. 65) 31. 0 0. 22(0. 48) 1. 17(0. 87)
长寿沙田柚 3 585(3 400) 96. 68(97. 98) 31. 2 2. 04(1. 05) 1. 28(0. 97)
强德勒柚 2 000(2 000) 94. 70(95. 60) 31. 0 0. 85(0. 65) 4. 45(3. 75)
汤姆逊葡萄柚 2 000(2 000) 92. 95(93. 35) 33. 7 0(0) 7. 05(6. 65)
克里迈丁 2 500(2 000) 94. 80(93. 55) 28. 8 2. 92(2. 95) 2. 28(3. 50)
本地早 2 000(2 100) 98. 20(98. 72) 28. 4 0. 45(0. 33) 1. 35(0. 95)
哈姆林 2 200(2 200) 98. 46(98. 78) 29. 7 0(0) 1. 54(1. 22)
塔罗科血橙 2 000(2 000) 98. 20(98. 30) 30. 5 0. 15(0. 35) 1. 65(1. 35)
锦　橙 2 000(2 000) 98. 75(98. 60) 29. 6 0(0) 1. 25(1. 40)
　　注:括号内数字为同品种 2002年数据。
Note:Number in paren thesis is pollen data of the sam e cu ltivar in 2002.
表 2　不同浓度秋水仙碱诱导长寿沙田柚 2n花粉效果差异
Table 2　 Induced resu lts of d ifferent con cen tration colch icine in C it-
ru s grand is
浓　度 /%
C oncentrtion
处理天数 /d
Treat
days
2n花粉发生率 /%
2n Pollen
rates
败育花粉率 /%
Sm all pollen
rates
枝条死亡率 /%
Death
rates
0(对照 , CK) 7 0. 87 1. 10 0
1 1. 31 1. 20 0
0. 15 3 1. 55 1. 34 0
5 2. 70 1. 96 0
7 1. 46 2. 75 0
1 2. 37 2. 05 0
0. 30 3 3. 58 2. 98 0
5 9. 76 3. 56 0
7 4. 30 5. 42 0
1 4. 20 3. 00 0
0. 45 3 5. 35 3. 83 0
5 8. 80 5. 60 0
7 3. 27 7. 90 25
1 3. 47 3. 30 0
0. 60 3 2. 10 6. 80 0
5 1. 29 12. 78 40
7 0 30. 50 50
2. 2　秋水仙碱诱导 2n花粉效果分析
2. 2. 1　处理适宜时期　对植物染色体加倍 ,关键是
选择细胞处于旺盛分裂时期给予足够的外界刺激 。
柑桔类花粉母细胞的减数分裂时期因品种而异 ,并且
与当年蕾期 、花期迟早有关 。参考前人研究结果的同
时 ,对长寿沙田柚的花粉母细胞减数分裂过程与花芽
发育的外部特征进行了观察 ,发现长寿沙田柚减数分
裂时期大概开始于花蕾长度约 3. 5 ～ 4. 5 mm时 ,由
于前期Ⅰ时间长 ,选择前期 Ⅰ开始时处理是长寿沙田
柚性细胞加倍的适宜时期。
2. 2. 2　不同处理对 2n花粉诱导的影响　利用秋水
仙碱处理长寿沙田柚花蕾 ,除 0. 6%处理 7d外均促
进了 2n花粉的发生。以秋水仙碱的浓度和处理时间
双因子实验测验 2n花粉诱导率变异的显著性差异
(见表 2),方差分析表明不同处理组合的诱导率存在
明显差异 。最佳处理组合为 0. 3%处理 5d , 2n花粉
比例达到 9. 76%,较当年自然情况提高 10倍左右 。
从表 2中可看出 ,低浓度的秋水仙碱对 2n花粉诱导
作用效果不明显 ,随着浓度升高 , 2n花粉发生率上
升 ,但到一定高度后 ,诱导率反而下降。用 0. 4%处
理 7d及 0. 6%处理 5d以上时 ,对植株的伤害加强 ,
有 25% ～ 50%枝条会在停止处理后几天至数十天内
枯萎死亡 ,同时高浓度的秋水仙碱对花药壁甚至植株
产生了严重毒害作用 ,正常生理代谢受到影响 ,花粉
败育量增加 (见图 3, 4)。从表 2中还发现用秋水仙
碱处理的花粉倍性变异有时甚至低于对照 , 1种情况
是药剂导致了花蕾受毒害死亡 ,另 1种可能就是田间
试材单枝或花序间本身发育上存在的差异 。因此采
用适中浓度处理较长时间有多次加倍的机会 ,又不至
于让试材受毒害死亡。
618 西　南　农　业　大　学　学　报　(自然科学版)　　　　　　　　2005年 10月
表 3　方差分析表
Tab le 3　Analys is ofVariance
差异源
Variance
平方和
SS
自由度
df
均方和
MS
F值
F
P值
p_V alue
临界值
F cri t
处理浓度 Concen tration 38. 764 9 3 12. 921 63 3. 858 544 0. 038 234 3. 490 295
处理时间 T im e 48. 317 17 4 12. 079 29 3. 607 012 0. 037 471 3. 259 167
误　差 E rror 40. 186 03 12 3. 348 836
总　和 Total 127. 268 1 19
表 4　不同倍性花粉萌发进程
Tab le 4　Germ ination p rocess of d ifferent p lo idy pollens ofC i tru s grand is
萌发进程
Germ ination p rocess
1 ～ 3 h萌发率 /%
G erm ination rates
3～ 6 h萌发率 /%
Germ ination rates
6 ～ 9 h萌发率 /%
G erm ination rates
>12 h萌发率 /%
Germ ination rates
2n花粉 2n Pollen 0 30. 5 77. 4 79. 6
n花　粉 n Pollen 5. 6 63. 7 82. 7 94. 5
图 3　诱导后长寿沙田柚不同大小花粉分布图
F ig 3　 pollen distribu tion of shatianyou after indu ction
图 4　1, 2n花粉 2 ～ 5,正常花粉 6 ～ 10,败育花粉
F ig 4　 1, 2n po llen 2～ 5, norm al po llen 6～ 10, sm all pollen
2. 3　不同倍性花粉萌发动态比较
由表 4可知 ,处于相同萌发环境中的 2n花粉与
n花粉大部分能萌发 , 2n花粉萌发率为 79. 6%,低于
n花粉的 94. 5%。在显微镜下观察花粉管的伸长比
较表明 , 2n花粉的伸长速度较正常 ,与同时启动萌发
的 n花粉的花粉管伸长速度无明显差异 ,但 2n花粉
萌发时花粉管更肥大 ,萌发启动比单倍性花粉慢 ,最
初 3 h无 2n花粉萌发 。因此 ,如果能在授粉后的前
几个小时抑制单倍性花粉萌发的启动 , 2n花粉就会
有机会参与授粉受精。在金荞麦上就有研究发现四
倍体比二倍体植株抗辐射能力强得多 ,运用到花粉
上 ,康向阳等 [ 12]利用不同倍性毛白杨花粉对辐射的
敏感性差异 ,通过辐射抑制或杀死部分单倍性花粉 ,
从而在一定程度上提高毛白杨 2n花粉的萌发率 ,使
其在受精过程中获胜机会增加 ,从而较大幅度提高了
三倍体育种效率 ,这也为以后 2n花粉利用提供了启
发性思路 。
3　讨　论
3. 1　利用花粉大小鉴别 2n花粉的可靠性
植物产生 2n配子有几个方面的特征表现:后代
出现非期望的倍性 、花粉粒大小和形状变化 、四分体
阶段二分体或三分体的出现 。诸多关于 2n花粉的研
究报道认为 , 2n花粉的体积和 DNA含量约为 n花粉
的 2倍 ,其直径则约为正常花粉的 1. 3倍。花粉直径
大小与染色体倍性之间存在着极显著的相关性 ,已在
多种植物如毛白杨 、马铃薯 、苹果的研究中得到证实
并运用此特性进行了人工分离。因此 ,以花粉粒直径
大小来判断二倍性花粉是简便可靠的 。
3. 2　2n配子诱导处理方法的选择
关于小孢子染色体加倍的处理方法 ,主要有节上
插毛细管法 、花束柄上插毛细管法 、滴液法 、注射法
等 。由于不同处理方法吸收药液的组织面积大小不
同 ,插毛细管处理时 ,多数是插毛细管于花束柄 ,其组
织仅靠毛细管作用吸收药液 ,数量有限 ,而且经长距
离运输后 ,到达花药时药液数量 、浓度就更低了 ,作用
效果较差 。滴液法直接处理花蕾明显优于其他方法 ,
药液与组织的接触面积大 ,吸收药液的面积也大 ,并
且药液运输距离短 。同时有采用离体和活体 (直接
在植株上 )方式处理 ,毛白杨上有采用注射法 ,但一
般在离体花枝的花蕾上进行 ,对于减数分裂到花粉成
熟间隔时间长的植物则应用困难 。如柚类 ,从小孢子
形成期到成熟花粉粒形成约需 10 d,这还不包括四分
体形成前的减数分裂时间 ,要在如此长的时间内保证
619第 27卷第 5期　　　　　向素琼等　柑橘属 2n花粉自然发生与沙田柚 2n花粉诱导研究
离体花粉发育必须的生理与环境条件很难。作者也
用离体方式进行了处理 ,但花蕾多数中途萎蔫脱落 ,
未能得到成熟花粉粒 ,主要是由于柑桔开始减数分裂
后还需较长时间才能形成成熟花粉粒 ,还未摸索到长
时间内保证离体花粉发育必需的生理与环境条件。
3. 3　2n花粉育种低效原因
在毛白杨群体中存在着自然 2n花粉 ,国内学者
也通过人工加倍获得较高比率(有的达到 90%左右 )
的 2n大花粉 ,但即使采用含 2n花粉比例如此高的花
粉授粉 ,收获种子 ,但播种后的杂种苗中 ,三倍体所占
比例仍然相当低 。其主要原因在于 2n花粉的生活力
与萌发特征 ,在参与竞争中处于劣势 。关于 2n花粉
的活力与萌发特征 ,有报道其活力低 、花粉管生长慢
而肥大 ,也有 2n花粉生长快的报道。在毛白杨的 2n
花粉育种中还发现 ,人工诱导的 2n花粉与天然 2n花
粉相比 ,遗传或生理上的不平衡性表现明显 ,导致竞
争能力比天然二倍性花粉差 。还有人认为 ,如果 2n
花粉发生在小孢子形成后的有丝分裂时期 ,则育性正
常 ,如果能在此时获得 2n花粉则竞争力较强 。因此 ,
2n花粉在混合倍性花粉处于劣势的真正原因还有待
于深入研究 。
3. 4　2n配子利用展望
利用植物 2n配子育种具有许多优越性:可提高
后代倍性并避免体细胞加倍等无性多倍化使杂种育
性和生活力降低的缺陷;克服远缘杂交不亲和性和胚
乳平衡数障碍;2n配子在传递杂合性和上位性方面
有特殊价值;利用 2n配子在二倍体水平上杂交可获
得三倍体或四倍体 ,避免了秋水仙碱大多只能获得偶
数多倍体的缺陷 。 2n配子育种 ,把染色体加倍产生
的倍性效应与杂交产生的杂交优势结合起来 ,扩大了
遗传基础 ,使遗传改良幅度大大提高 。近期在东方百
合上还有报道其 2n配子杂种后代存在染色体数目的
多样性 , 出现了一定数量的三倍体和不稳定的非整
倍体 ,这在遗传研究上很有价值 [ 13] 。
三倍体在许多果树上可获得无核品种 ,同时还能
通过无性繁殖长期保存和利用 。但过去三倍体的获
得通常是先用秋水仙素处理产生四倍体 ,待开花时再
与二倍体杂交形成 ,此法育种周期较长 。而果树遗传
上的高度杂合性 、优良多倍体品种的存在和无性繁殖
特性使得果树比某些作物更适合利用 2n配子育种 ,
也为无核品种选育提供了新的技术和方法 ,目的性
强 ,可缩短育种年限 。如果 2n配子发生比例得以大
幅度提高和采取一定措施提高其在授粉后的竞争力 ,
应该在果树育种中会有所作为。
参考文献:
[ 1] 　丛佩华 , 吴禄平 ,景士西. 2n配子的发生及在果树育种
中的应用 [ J] . 果树科学 , 1998, 15(4):347 -353
[ 2] 　唐仙英 , 罗正荣 , 蔡礼鸿. 植物未减数配子及其应用研
究进展 [ J] . 武汉植物学研究 , 1999, 17(增):1 -7
[ 3] 　屈冬玉. 2n配子在马铃薯育种中的应用 [ J] . 马铃薯杂
志 , 1988, 2(2):102 - 105
[ 4] 　李　云. 杨树三倍体选育研究进展 [ J] . 植物学通报 ,
2001, 18(4):451 - 458
[ 5] 　杨今后 , 杨新华.桑树雄配子人工二倍化培育优良三倍
体的研究 [ J] . 桑业科学 , 2001, 27(3):177 -180
[ 6] 　谷晓峰 罗正荣. ‘禅寺丸 ’甜柿 2n花粉形成机制的研究
[ J] . 园艺学报 , 2003, 30(2):135 -140
[ 7] 　张成合. 大白菜 2n配子发生的遗传分析 [ J] . 园艺学
报 , 2000, 27(4):295 -296
[ 8] 　张新忠 , 刘国俭. 热激处理对桃 、李离体花枝 2n花粉
产生的影响 [ J] . 园艺学报 , 1998, 25(3):292 -293
[ 9] 　汪卫星 , 郭启高 , 向素琼 , 等. 热激处理对枇杷 2n花粉
发生率的影响 [ J] . 果树学报 , 2003, 20(4):284 -286
[ 10] 　李　斌 , 石荫坪 , 束怀瑞 .利用苹果花粉粒形态进行倍
性鉴定 [ J] .园艺学报 , 1998, 25(2):133 - 138
[ 11] 　CavalcanteH C , Sch ifino -W ittmann, Dorne lles A L C.
M e iotic behaviour and po llen fertility in an open - po llina-
ted population o fLeem anda rin[ J] . Scientia Ho rticultu-
rae, 2000, 86:103 - 114
[ 12] 　康向阳 , 朱之悌 ,林惠斌. 白杨不同倍性花粉的辐射敏
感性及其应用 [ J] . 遗传学报 , 2000, 27(1):78 -82
[ 13] 　郑思乡 , 向仕华 ,章海龙 ,等. 东方百合 2n雌配子诱导
及三倍体多样性研究 [ J] . 云南农业大学学报 , 2005,
20(3):309 -312
620 西　南　农　业　大　学　学　报　(自然科学版)　　　　　　　　2005年 10月