全 文 ：中图分类号:S 853.74　文献标志码:A　文章编号:1673-4696(2010)02-0205-05
杨树花提取物及其复方制剂的药理学试验
房春林1 , 2 ,杨光友1＊ ,杨海涵2 ,李　超1
(1.四川农业大学 动物医学院 ,四川 雅安　625014;2.四川省新兽药工程技术研究中心 ,四川 成都　611130)
　　摘要:通过药敏试验 、联合抗菌作用试验 、抗细菌感染试验及抗炎试验 ,对杨树花提取物及其复方制剂
的药理作用进行了研究。结果显示 ,杨树花水提液及其复方制剂对大肠杆菌 、沙门氏菌标准菌和致病菌有中
度抑菌活性;杨树花水提液的乙酸乙酯及正丁醇萃取物对大肠杆菌标准菌和致病菌 、沙门氏菌标准菌也有中
度抑菌活性 ,但对沙门氏菌致病菌的抑菌活性较低 ,杨树花与黄芩联合抗菌具有相加作用 。抗细菌感染及抗
炎试验结果证实 ,杨树花水提液及复方制剂在昆明系小白鼠体内对大肠杆菌具有抑菌作用 ,高 、低剂量杨树
花水提液可使小鼠耳肿胀度明显降低 ,其抑制率分别为 65.0%和 51.6%。结果表明 ,杨树花提取物及其复
方制剂具有明显的抑菌 、抗炎作用 。
关键词:杨树花;抑菌;抗炎;联合抗菌作用
Experiments on pharmacology of Populus tomentosa
extracts and their compound preparations
FANG Chun-lin1 , 2 , YANG Guang-you1 , YANG Hai-han2 , LI Chao1
(1.College of Veterinary Medicine , S ichuan A gricultural University ,Ya an 625014 , China;
2.S ichuan Engineering Research Center f or New Veterinary Drugs , Chengdu 611130 , China)
　　Abstract:Pharmaco logical ef fects o f Populus tomentosa ex t racts and thei r compound preparations w ere
studied in the drug sensitivi ty test , the combined antibacterial activi ty test , the antibacterial infection test
and the anti-inf lammato ry effect test.In result , Populus tomentosa aqueous ex t ract and the compound
preparation had moderate antibacterial activity against four tested bacteria(pathogenic and standard st rains
of Escherichia coli and Salmonella).Ethyl acetate and n-butanol ex t racts of the Populus tomentosa aque-
ous ex tract also had a moderate ant ibacterial activity ag ainst pathogenic and standard st rains of E.coli and
standard st rains of Salmonel la.In contrast , the antibacterial act ivity against the pathogenic Salmonel la was
low , and Populus tomentosa and Scutellaria baicalensis had addit ive ef fect on the antibacterial activity
ag ainst E.coli.In the antibacte rial infect ion and anti-inf lammat ion tests , the Populus tomentosa aqueous ex-
t ract and compound preparat ion had antibacterial activity ag ainst E.coli in v ivo , and high and low do se
groups of Populus tomentosa aqueous ext ract reduced the auricular sw elling in Kunming mice , and the inhi-
bition rates w ere 65.0% and 51.6%, respectively .The results show ed that the Populus tomentosa aqueous
ext racts and their compound preparation possessed the significant antibacterial and anti-inf lammatory ef fects.
Key words:Populus tomentosa ;antibacte ria;anti-inf lammatory;combined antibacterial activity
　　随着化学类药物在兽医临床的广泛和不规范应
用 ,造成了临床部分耐药菌的产生 ,这给动物疫病的
防控带来了一定困难 ,而中兽药作为我国传统兽医
学的一部分 ,应用于兽医临床具有高效 、低毒 、无耐
药性等特点 ,甚至部分中兽药具有消除细菌耐药质
粒的作用。因此 ,加强对中兽药药理 、药效及毒理学
收稿日期:2009-12-09;修回日期:2010-01-18
基金项目:教育部“长江学者和创新团队发展计划”创新团队项目(IRT0848)
作者简介:房春林(1978-), 男 , 四川广安人 , 博士生 , 从事新兽药研发工作。 ＊通讯作者 , 教授 , 博士 , E-mail:guang
you1963@yahoo.com.cn
中国兽医科学　2010 , 40(02):205-209
Chinese Ve te rinary Science
DOI :10.16656/j.issn.1673-4696.2010.02.020
等方面的系统研究 ,对开发中兽药新药应用于兽医
临床具有重要意义。
　　杨树花为杨柳科植物毛白杨(Pop ulus tomento-
sa)、加拿大杨(Pop ulus canadensis)或同属树种植
物干燥雄花序[ 1] ,性味苦寒 ,具有清热解毒 ,化湿止
痢之功效;毛白杨在我国西北 、华中 、华北 、东北和西
南地区分布极广 ,常用水煮液治疗人和家畜的各类
细菌性痢疾和肠炎 ,临床效果良好 ,同时具有明显的
抗肿瘤 、解热镇痛和抗风湿作用[ 2] ,为 2005版《中华
人民共和国兽药典》(二部)收载药材 ,但因目前缺乏
对杨树花药理 、药效及毒理学等方面的系统研究 ,限
制了杨树花在兽医临床上的开发利用 。2005版《中
华人民共和国兽药典 》(二部)仅有单方口服液和片
剂 ,其注射液及复方制剂均无国家标准 ,这远远不能
满足实际生产对其制剂开发的需求 。本试验主要对
杨树花水提液及其复方制剂的药理学进行评价 ,为
新兽药的研究开发提供理论基础。
1　材料与方法
1.1　药品及试剂
　　杨树花(产地河南)、黄芩(产地四川)均通过鉴
别 ,由四川三星堆植物化工厂提供;杨树花水提液
(相当于原生药 1 g/mL)、黄芩提取液(相当于原生
药 0.375 g/mL)、杨树花复方注射液(相当于原生药
1.375 g/mL ,杨树花 1 g/mL ,黄芩 0.375 mg/mL ,
批号:20090112)均由笔者所在教研室自制;石油醚 、
正丁醇 、乙酸乙酯等均为分析纯 ,由成都长征试剂公
司提供;致病性大肠杆菌(ES320)、沙门氏菌
(ES321)分离于临床自然感染猪 ,由四川农业大学
药理教研室提供;大肠杆菌标准菌 CMCC(B)
44102 、沙门氏菌标准菌 CMCC(B)50094 购于中国
兽医药品监察所 。
1.2　实验动物
　　昆明系小白鼠 180只 ,体重 18 ～ 22 g ,雌 、雄各
半 ,由四川大学华西实验动物中心提供 。
1.3　体外抑菌试验
1.3.1　杨树花的提取工艺及活性部位的萃取　称
取杨树花 200 g ,加注射用水 3 000 mL ,煎煮 2次 ,每
次 1.5 h ,合并煎液 ,浓缩至 200 mL 左右 ,加入乙
醇 ,4 ℃条件下沉淀 2 次 ,每次 12 h ,乙醇浓度分别
为 700 mL/L 和 800 mL/L ,除去沉淀得乙醇溶液 ,
挥尽乙醇得杨树花水提液 A 液 200 mL。取 A 液
100 mL 于分液漏斗中 ,加入石油醚 300 mL ,充分振
摇萃取 ,静置 ,待溶液完全分层后 ,放出上层的石油
醚萃取液 ,剩余的水溶液用同样的方法再萃取 3次 ,
将 4次的石油醚萃取液合并 ,减压浓缩得石油醚萃
取物 B;石油醚萃取后 ,向剩下的下层水溶液中加水
至总体积为 100 mL ,于分液漏斗中摇匀 ,加入 300
mL 乙酸乙酯 ,充分振摇萃取 ,静置 ,待溶液完全分
层后 ,取出上层的乙酸乙酯萃取液 ,剩余的水溶液用
同样的方法再萃取 3次 ,将 4次乙酸乙酯萃取液合
并 ,减压浓缩为乙酸乙酯萃取物 C;乙酸乙酯萃取后
剩余的水溶液按上述同样的方法用正丁醇萃取 4
次 ,将上层的正丁醇萃取液合并 ,减压浓缩得正丁醇
萃取物 D;B 、C 、D 萃取物均加水稀释至 100 mL
备用。
1.3.2　杨树花复方注射液和黄芩提取液的制备　
取上述制备的杨树花水提液 50 mL ,加入抗氧化剂
搅拌溶解 ,并加入黄芩提取液 50 mL 搅拌均匀 ,减
压浓缩至 50 mL ,用乙酸调节 pH 值为 6.0 ～ 7.2 ,
0.45μm 滤膜过滤 ,灭菌 30 min 即得杨树花复方注
射液(E);黄芩提取液(F)的制备参照《中华人民共
和国兽药典》(二部)的方法[ 1] 进行 。
1.3.3　菌悬液的制备　将供试菌大肠杆菌 、沙门氏
菌菌种接种于营养琼脂斜面培养基上进行活化 ,挑
取单个菌落接种于新鲜营养肉汤培养基中 , 37 ℃培
养 18 ～ 24 h ,采用平板菌落计数法 ,用肉汤稀释菌悬
液浓度至含菌体约 1 ×105 ～ 1 ×106 CFU/mL ,
备用。
1.3.4　药敏纸片的制备　选用优质滤纸用打孔器
打成 6 mm 直径的圆形纸片 , 121 ℃高压灭菌 30
min ,分别放入各供试液中浸泡 24 h ,取出挥干多余
滤液 ,保存备用。
1.3.5　体外抑菌活性的测定　采用滤纸片法[ 3-4] 测
定体外抑菌活性 。以无菌生理盐水作为阴性对照 ,
分别对 A 、B 、C 、D液及杨树花复方注射液 E 进行抑
菌试验 ,试验重复 3 次 ,取其平均值。抑菌效果判
定:抑菌圈直径>20 mm 为极敏感 , 15 ～ 20 mm 为
高度敏感 , 10 ～ 15 mm 为中度敏感 ,抑菌圈直径<
10 mm 为低度敏感 。
1.3.6　最低抑菌浓度(M IC 值)的测定　采用试管
二倍稀释法[ 5] 。同时设营养肉汤 、菌液对照管 ,分别
测定 A 、C 、D 、E液及黄芩提取液 F 对大肠杆菌 、沙
门氏菌的最低抑菌浓度 ,肉眼观察试管内液体澄清
的最低药物浓度记为 M IC 值。
1.4　杨树花与黄芩的联合抗菌作用
　　采用棋盘法[ 6-7] 研究杨树花与黄芩的联合抗菌
作用 ,根据所测杨树花 、黄芩水提液对标准大肠杆菌
的 MIC值 ,以两药物各自2M IC到 1/8M IC分别进
行联合 。计算 FIC 指数 , FIC 指数≤0.5 则两药为
206 中国兽医科学 第 40 卷
协同作用;FIC 指数 =1 则为两相加;FIC 指数 ≥2
则为拮抗 。
1.5　杨树花水提液及复方注射液的抗细菌感染试验
　　将 140只(雌 、雄各半)小白鼠随机分成 7组 ,每
组 20只 ,即感染对照组 、杨树花水提液高 、中 、低治
疗组 ,杨树花复方制剂高 、中 、低治疗组 。试验组各
组连续3 d按0.1mL/20 g 剂量腹腔注射给药(杨树
花水提液及复方注射液高 、中 、低剂量组药物浓度均
分别为 0.5 、0.25 、0.062 5 g/mL ,高剂量组给药剂
量约相当于临床给药剂量的 8 ～ 10倍),每天 2次 ,
末次给药后第 1 h ,试验组和感染对照组分别用约
5.5×107/mL浓度的菌液进行腹腔注射感染 ,每只
0.2 mL。腹腔注射感染后第 1 、6 h ,各组分别按各
剂量给药 ,观察并统计 4 d内小鼠的死亡率 、精神状
态 、临床症状等 。对照组腹腔注射生理盐水。
1.6　杨树花水提液的抗炎试验
　　参照文献报道方法[ 8] ,取健康小鼠 40只 ,雌 、雄
各半 ,随机分为 4 组:空白对照组 ,磷酸地塞米松对
照组及杨树花水提液高 、低剂量组 。试验组各组连
续 3 d按 0.1 mL/20 g 剂量腹腔注射给药(杨树花水
提液高 、低剂量组药物浓度均分别为 0.3 g/mL 和
0.06 g/mL ,高剂量组用药剂量约相当于临床用药
量的 5倍),每天 1次 ,空白对照组腹腔注射生理盐
水 。于末次给药后第 1 h ,在小鼠右耳两面涂抹二甲
苯 ,30 min后处死动物 ,沿耳廓基线剪下双耳 ,分别
用直径 9 mm 打孔器在左 、右耳相对称部位取下耳
片称重 ,观察小鼠耳廓肿胀情况 ,并计算耳肿胀度
(耳肿胀度=右耳廓重-左耳廓重)。
2　结果
2.1　体外抑菌试验
2.1.1　体外抑菌活性　杨树花水提液 、杨树花水提
液萃取物及杨树花复方注射液在体外对大肠杆菌 、
沙门氏菌标准菌和致病菌均有较好抑菌效果 ,但各
药物对大肠杆菌标准菌和致病菌 、沙门氏菌标准菌
的抑菌效果差异不显著 ,杨树花复方注射液对沙门
氏菌致病菌效果优于杨树花水提液(P <0.05)和杨
树花水提液萃取物(P<0.01)。试验结果见表 1 。
表 1　杨树花提取物及杨树花复方注射液对细菌的体外抑菌活性
Table 1　Antibacterial activity in vitro of Populus tomentosa extracts and their compound injections
细菌
Bacteria
n
抑菌圈直径/mm 　Zone of inhibit ion diam eter
A B C D E
阴性对照
Negative cont rol
大肠杆菌(44102)
Escherichia co li(44102) 3 14.67±2.08a 6.00±0 14.80±1.54a 15.00±5.65a 17.75±4.59a 6.00±0
沙门氏菌(50094)
Sa lmonel la(50094) 3 13.60±3.51a 6.00±0 11.67±3.53a 12.00±3.21a 13.27±1.76a 6.00±0
大肠杆菌(ES31)
Escherichia co li(ES31) 3 12.25±3.88a 6.00±0 13.50±0.71a 12.25.±1.76a 13.75±1.06a 6.00±0
沙门氏菌(ES32)
Sa lmonel la(ES32) 3 11.50±0.70Ab 6.00±0 7.75±1.06Bc 9.50±0.54Bd 12.60±1.07Ae 6.00±0
A:杨树花水提液;B:石油醚萃取物;C:乙酸乙酯萃取物;D:正丁醇萃取物;E:杨树花复方注射液。下表同
同一行中标有不同小写字母的均数之间差异显著(P<0.05),标有不同大写字母的均数之间差异极显著(P<0.01)
A:Populus tomentosa aqueous ext ract;B:Pet roleum ether ext ract;C:ethyl acetate ext ract;D:n-Butanol ex t ract;E:Com pound inject ion of Popu-
lus tomentosa.The sam e as follow s
The di fference betw een means wi th a di fferent sm al l let ter w ithin a line i s sig ni fican t(P<0.05), and th e dif ference betw een means wi th a di ffer-
ent capi tal letter w ithin a line is very signif icant(P<0.01)
2.1.2　最小抑菌浓度的测定　杨树花水提液 、杨树
花水提液萃取物 、杨树花复方注射液及黄芩提取液
对细菌的最低抑菌浓度(MIC)见表 2。
2.2　杨树花与黄芩的联合抗菌作用
　　杨树花与黄芩联用时对标准大肠杆菌的 M IC
分别为 31.75 mg 和 92.75 mg ;其 FIC 指数 =
MIC甲联合/M IC甲单用 + M IC乙联合/M IC乙单用 =0.754。
因此 ,杨树花与黄芩的联合抗菌作用为相加作用。
2.3　杨树花水提液及复方注射液的抗细菌感染
试验
　　大肠杆菌感染对照组小白鼠在感染后第 12 h
均出现不同程度的拉稀 、被毛粗乱 、弓背 ,并在 24 h
内先后出现死亡;给药组无明显拉稀现象 ,表明杨树
花水提液及其复方制剂对大肠杆菌在体内均有明显
的抑菌作用 ,但高剂量组出现部分小鼠死亡 ,剖解发
现肝 、肾 、脾等器官明显肿大 ,肺出血 。结果见表 3。
207第 2 期　　　　　　　　　 　　房春林等:杨树花提取物及其复方制剂的药理学试验
表 2　杨树花提取物 、杨树花复方注射液及黄芩提取液对细菌的最低抑菌浓度(MIC值)
Table 2　Minimum inhibitory concentration of Populus tomentosa extracts , the compound injections and Scutellaria baicalensis
extract against bacteria
细菌 Bacteria MIC/(mg·mL
-1)
A C D E F
大肠杆菌(44102)Escherichia coli(44102) 125 125 125 85.6 187.5
沙门氏菌(50094)Salmonella(50094) 62.5 125 125 85.6 187.5
大肠杆菌(ES31)E scher ich ia col i(ES31) 125 250 250 85.6 375
沙门氏菌(ES32)Salmonel la(ES32) 125 250 125 85.6 375
F:黄芩提取液
F:S cu tellaria baicalensis extract
表 3　杨树花水提液及其复方注射液的抗细菌感染效果
Table 3　Antibacterial infection ef fect of the Populus tomentosa aqueous extract and the compound injection against E.coli
组别
G roup s
剂量
Doses
药物浓度/(g·mL -1)
Concent rat ion of drug
小鼠数
Mouse counts
小鼠死亡数
Death coun ts
死亡率/ %
M ortalit y
A
高剂量 High dose 0.500 0 20 5 25.0
中剂量 M oderate dose 0.250 0 20 0 0
低剂量 Low dose 0.062 5 20 0 0
E
高剂量 High dose 0.500 0 20 8 40.0
中剂量 M oderate dose 0.250 0 20 0 0
低剂量 Low dose 0.062 5 20 0 0
感染对照组
Infect ion cont rol
0.009 0 20 19 95.0
2.4　杨树花水提液的抗炎试验
　　二甲苯诱导的小鼠耳廓出现明显肿胀 ,杨树花
水提液各剂量组对小鼠耳廓肿胀均有较好的抑制作
用 ,表明杨树花具有良好的抗炎效果。结果见表 4。
表 4　杨树花水提液的抗炎效果
Table 4　The anti- inflammatory effect of Po pulus tomentosa
aqueous extract
组别
G roup s
n
药物浓度/(g·mL -1)
Concent rat ion
of drug
肿胀度/m g
Sw elling
抑制率/ %
Inhibi ti on
rate
NaCl溶液
S odium chloride
solut ion
10 0.009 0 7.13±1.82 0
地塞米松
Dexamethasone
sodium phosph ate
10 0.000 2 2.11±0.26 70.4
高剂量
High dose
10 0.300 0 2.48±0.43＊＊ 65.0
低剂量
Low dose
10 0.060 0 3.45±0.51＊ 51.6
与对照组比较 , ＊P<0.05;＊＊P<0.01
C om pared w ith th e NaCl solut ion group as cont rol g rou p , ＊P<0.05
and ＊＊P<0.01
3　讨论
3.1　体外抑菌试验结果表明 ,大肠杆菌 、沙门氏菌
标准菌和致病菌对杨树花水提液及其复方注射液均
表现出了中度敏感;大肠杆菌 、沙门氏菌标准菌对杨
树花水提液的乙酸乙酯及正丁醇萃取物也表现出了
中度敏感 ,但沙门氏菌致病菌对杨树花水提液的乙
酸乙酯及正丁醇萃取物表现为不敏感 ,与杨树花水
提液和复方注射液差异极显著(P<0.01),这可能
与萃取过程中活性物质的损失有关。最低抑菌浓度
的试验结果表明 ,杨树花及其复方制剂对大肠杆菌 、
沙门氏菌的 M IC 值为 62.5 ～ 125 mg/mL ,杨树花
水提液乙酸乙酯及正丁醇萃取物对大肠杆菌 、沙门
氏菌的 M IC 值为 125 ～ 250 mg/mL 。据报道 ,中药
苍术 、鱼腥草 、金银花 、黄柏 、板蓝根 、蒲公英和连翘
对大肠杆菌的 M IC 值分别为 167 、250 、167 、250 、
125 、500和 250 mg/mL[ 9] ,石榴皮 、大青叶 、鱼腥草 、
苦参和白头翁提取物对沙门氏菌的 M IC 值为 125
～ 500 mg/mL[ 10-11] 。相比而言 ,杨树花水提液及其
复方注射液的抑菌效果优于其他中药提取物 ,具有
较强的产品开发价值。
3.2　本试验对杨树花单方水提液及复方注射液进
行了药理学方面的研究 ,抗菌联合作用试验证实了
杨树花与黄芩抗菌具有相加作用 ,体外抑菌试验也
表明杨树花复方注射液对沙门氏菌致病菌效果优于
单方水提液(P<0.05)。这初步表明在对杨树花单
方制剂研究的基础上 ,以中兽医理论为依据 ,加强其
复方制剂的研究开发更有实际意义。
3.3　在抗细菌感染试验过程中 ,高剂量组小鼠出现
208 中国兽医科学 第 40 卷
部分死亡 ,且死亡时间未超过 12 h ,死亡剖解病理变
化表现为各脏器出血 ,肝 、肾肿大 ,而前期对杨树花
复方注射液急性毒性试验表明 ,杨树花复方注射液
的 LD 50为 46.4 g/kg ,按临床推荐剂量的 100 ～ 150
倍给药 ,小鼠无任何毒副反应 ,本试验中高剂量组用
药剂量为临床用药量的 8 ～ 10倍。这初步表明高剂
量组的给药剂量对小鼠不应该引起死亡 。因此 ,推
测小鼠出现部分死亡的原因可能是给小鼠接种细菌
后导致其自身抵抗力减弱 ,从而对再次给药时的药
物毒性的承受力降低而引起。抗炎试验表明 ,杨树
花能显著抑制小鼠耳肿胀 ,具有明显的抗炎作用 ,其
主要抗炎成分可能为酚甙类或黄酮类物质[ 2] 。
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(责任编辑　张文举)　
209第 2 期　　　　　　　　　 　　房春林等:杨树花提取物及其复方制剂的药理学试验