全 文 ：蚕 业 科 学
第 14 卷 第 1 期 C A N Y E K E X U E 1 9 8 8 年 8 月
桑属几个种及品种细胞色素
氧化酶同工酶的研究’
何 大 彦 冯 文 和
(四川 省农科院蚕桑研究所 ( )四 川大学生物系 )
用聚丙烯酞胺凝胶电泳的方法 , 对 四川 桑属植物 的 5 个种 、 两个 品种及两个 引进种的细胞色素氧
化酶同工酶进行了研究。 结果 : ( 1) 桑属内有共同的特征酶带 , (2 ) 桑 属内各种 、 品种间的酶谱有显
著差异 , 每个种都有不同的特征酶谱 ; ( 3) 用组平均聚类法研究同工酶分类 , 在桑属植物分类上有一
定的适用价值 , ( 4) 上述研究结果与过氧化物酶同工酶的排序法分类比较 , 除华桑有差异外 , 其它桑
种 、 品种均表现规 律性的一致倾向 , 为桑属植物分类提供了新的依据 。
主题词 : 桑属 桑品种 细胞色素氧化酶同工酶 聚丙烯酞胺凝胶电泳
同工酶具有物种的特异性和组织器官的特异性 , 其结构上的差异 , 主要反映了遗传基因
的差异 。 因此 , 它可以用作基因存在及表达的一种生化指标 , 从分子水平上来识别物种 、 品
种 、 杂种在外部形态上难 以区别的遗传变异 , 被广泛用于种质资源上亲缘关系的鉴定 , 探查
进化系谱 , 预测遗传性状的杂种优势等 〔` 〕 。 本文用聚丙烯酞胺凝胶电泳技术 , 对桑属 几 个
种及品种的过氧化物酶同工酶进行了研究 , 讨论了它们的亲缘关系 , 得到了较好的结果 。 本
文又对这 几个桑种及品种的细胞色素氧化酶同工酶进行了研究 , 试图从多种同工酶的表型上
来探讨桑属植物应用同工酶分类法的可能性 。
材 料 一与 方 法
一 、 供试桑种 、 品种
白桑 ( M o r u s a l b a L i n n e ) 、 山桑 ( M . b o m b夕e f s K o i d z ) 、 华 桑 ( M . c a t几a 夕a -
n a H e m s l )
、 蒙桑 ( M . o o n g o l i e a C 。 K 。 S e h n ) 、 鸡桑 ( M 。 a u s t r a l i s P o i r e t 〔 =
M
. a e id o s a G r i f f 〕 ) , 以上 5 个种原产四川 ; 长果桑 ( M 。 l a e o i g a t a W a l l ) 原产云 南 ,
鲁桑 ( M . o u l t i c a u l`5 P e r r ) 从浙江引进 ; 琵琶桑 ( P i p a ) 、 剑鲁桑 ( J i a n l u ) 为四 川地
方品种 。 供试材料均取自四川省农科院蚕桑研究所品种桑园内 。
二 、 试验方法
各桑种 、 品种 , 分别于 4 月下旬采集 2 一 3 株树上新梢第一位幼叶为供试样品 。 采样后
立即放入冰瓶暂存 , 以 1 : 3 ( W / V ) 加入 T ir s— 甘氨酸缓 冲 液 ( p H S . 3 ) 匀 浆 , 于4 ℃ , 8 8 0 o r / m in 离心 30 分钟 , 分装上清液于洁净瓶内 , 于 一 20 ℃条件下保存备用 。
采用聚丙烯酞胺盘电泳 , 主要参考 〔“ 〕的方法并略加改进 。 凝胶浓 度 为 7 % , 电极使用
本文 1 9 87一 06一 1 8收到 , 修改寄回 : 19 8 7一 1 0一2 6 。
为国家 自然科学墓金委员会 资助课题 。
DOI : 10. 13441 /j . cnki . cykx . 1988. 01. 001
2 蚕 业 科 学 扭卷
T r is — 甘氨酸缓冲液 ( p H S . 7 ) , 电泳时电流为 2 . 5一 3 . o m A /管 , 在 4 一 8 ℃ 电泳 2 . 5一
3 小时 。 每样品电泳重复 4 次 。
细胞色素氧化酶染液的配制及染色 : 用 1 %二甲基对苯二胺 : 1 % a 一蔡酚 : o . I M磷 酸
( p H 7
.
4 ) 缓冲液 二 1 : 1 , 2 . 5 。 将电泳胶条放入染液中 , 放入 37 ℃恒温箱中保 温 30 一 40 分
钟 。 当细胞 色素氧化酶呈现蓝色区带后 , 立即将着色胶条在衬托的 白纸上测量酶带的迁移距
离 , 计算迁移率。
结 果
一 、 桑属不同种 、 品种的细胞色素组化醉同工酶谱
经聚丙烯酞胺凝胶电泳表明 , 各桑种 、 品种间在酶带数量 、 相对迁移率 ( R , ) 上有较大
的差异 , 如图 1和表 1 。 从酶带数量上看 , 7 个桑种和两个品种的细胞色素氧化酶同工酶共
有 13 条不同的 R ,值酶带 , 比以冬芽为材料的过氧化物酶同工酶的 26 条 R 、值酶带数减少一半 。
其中华桑 、 鸡桑 、 山桑酶带数最多 , 各有 5 条带 ; 长果桑有 4 条酶带 , 其它桑种 、 品神酶带
最少 , 各有 3 条酶带 。 从酶带 fR 值上反映出 , 白桑与蒙桑各有 3 条酶带 , 几乎完 全 相 似 ( 第
4
、
9 和 13 带 ) , 山桑与鸡桑有 3 条相似酶带 ( 第 l 、 1 和 12 带 ) , 白桑与鲁桑各 3 条酶带
中有两条酶带相似 ( 第 4 和 13 带 ) , 其它桑种 、 品种在第 12 和 13 酶带上亦很相似 , 可以认为
第 12 或 13 酶带是桑属内各种的特征酶谱 。 这些结果 , 与作者进行过氧化物酶同工酶研究结果倾
向一致 。 但华桑与山桑亦有 4 条酶带相似 ( 第 l 、 5 、 8 和 n 带 ) , 这一结果与过氧化物酶
同工酶研究结果有差异 。
A月 .
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目
长果桑 蒙桑 华桑 鸡桑 山桑 白桑 鲁桑 琵琶桑 剑鲁桑
图 1 桑属几 个种及品种细胞色素氧化酶同工酶谱
人 深色带 B 较浅色带 C 浅色带
二 、 绍属不同种 、 品种细胞色索氧化醉同工酶的相似系数与不相似矩阵
根据酶谱计算出各桑种 、 品种间的相似系数 , 列出不相似矩阵 ( 如表 2 ) , 以利分析它
们之间的亲缘关系 。 相似系数计算参考 〔” 〕的方法进行 。
相似系数 ( C ) = 2Wa + b x 1 0 0%
式中 , a 代表 A种的酶带数 , b代表 B种的酶带数 , W代表 A 、 B两种的相似酶带数 。
不 相似值 ( d ) = 10 。 一 相似系数 ( C ) 。
从表 2 配对计算桑属各种 、 品种间酶诺相似系数来看 , 白桑与蒙桑的相似系数 为 1卯 :
1 期 何 大弯等: 桑属几个种及品种细胞色素氧化酶同工梅的研究
表 1 桑属几个种及品种细胞色素氧化酶同工酶R :值
种 名 酶 带 1。 …1 1 1 21 1 3l 4
长 果 桑 介 。 5 30 。 6 0
,d今白,J几J比jC八…O八曰
!
-
;…!..…leseses蒙 桑 土0 0 . 5 6 0 . 9 10 。 9 1
4 2
{
…。 . 3。 一 0 。 3 9 0 . 4 0
0
。
3 2 0
。
3 9 0
。 选1
0
.
3 3 0
。
4 1
}
表 2 桑属几个种及品种细胞色素氧化酶同工酶谱相似系数 ( C )与不相似矩阵表
种
} 长果桑
及 品 种 { _
, ( 尸 1 少
桑 …鸡
3 夕 (
桑 ! 山 桑 } 白 桑
p 礴 少 ( P S ) ( P O )
鲁 桑
( P 7 )
琵琶 桑
( r s )
剑鲁桑
( F 。 )
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八U乃U月与O的
25朴。
肠然0n一丫月」八U卜é, J月!
长 果 桑 ( P i )
蒙 桑 ( P Z )
华 桑 ( P 3 )
鸡 桑 ( P ` )
山 桑 ( P 6 )
白 桑 ( P 6 )
仑 桑 ( P ? )
琵 琶 桑 ( P a )
剑 鲁 桑 ( P。 )
2 8
O { 3
华桑与山桑为 8叭 鲁桑与蒙桑 、 鲁桑与白桑 、
一…\…:
剑鲁桑与琵琶桑均为 67 ; 山桑与鸡桑为 60 , 表
飞 明它们之间亲缘关系较密切 ; 长果桑与山桑 、 鸡桑 、 蒙桑 、 华桑 、 白桑的不相似值 在 70 以上 , 表明亲缘关系较疏远 。 上述结果与过氧化物酶同工酶分析结果比较 , 除华桑与山桑有差
异外 , 其它桑种均表现一致倾向 。 由此可见 , 同工酶在桑属植物上具有特异性和稳定性。
三 、 桑属不同种 、 品种细袍色素氧化醉同工酶的聚类分析
根据各桑种 、 品种的酶谱相似系数 , 采用植物数量分类中的组平均法 , 对桑属 7 个种 、
2个品种进行聚类分析 ( 如图 2 ) , 以利桑种 、 品种间的亲缘关系进行比较 。 组平均聚类分
类法 , 按 c’ 〕的方法并参考 ” 的作法进行 。 其聚合过程如下 :
按聚合策略 、 组平均法的定义公式为 :
D 八十 B = 、篇艺 D ; k ( 1 。 1 )
i任奎
k任 B
1 4卷
其中 , D A 十 B对任何相似距离都适用 。
D C A
, B = 一」 ~ ( 。 e n 人 D e * + n C n 。 D e 。 )
l C l ^ + O
_ n A n
t n B
一— U C 人 丫—n 人+ B u A + B D cB
· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · , · · · , · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · … … ( 1 . 2)
据表二酶谱相似系数所列矩阵 , 运用聚合策略的组平均法 定义公式 ( 1 . 2 ) 进行 聚 合 。
第一次合并时 , 选择相似系数最大者合并 , 本文为 P Z和 P 6 ( 白桑与蒙桑 ) , D 2 6 = 10 0 。
再用 ( 1 . 2 ) 公式补算 D 3 : , 、 D ` 2 , 、 D S : , 、 D 7 2 · 、 D 。 : , 、 D , : ,有 :
。 . I n
工少 吸 , 十 — 二少 , 右 二二2
1
1 。 , ` 。 , 、
又~ 、 ` O 宁 乙 0 夕艺
同理可算得 : D 4 : , 二 25
由此得到新的矩阵 , 如表 3
D 5 2
二 2 5
D
7 :
( 三 )
1一2一牡D
= 6 7 D
s Z
,
= 3 3 D
。 2 , = 3 3
以下依次合 并 , 得到新的矩阵 ( 二 )
( 合并过程略 ) 。 然后绘制聚合树状图 ( 如图 2 )
远近和亲疏 。
… ( 七 ) ,最后 , 将全部种群合并 成 一 组
, 从图 2 可看出各桑种 、 品种亲缘关系的
表 3 合 并 后 的 矩 阵
l p
` p Z ` p 3 p ` p , p , p `
P
, 。 } : 8 : : 。 。 5 :
·
: 8
25
0
2 5
4 0
0
0
8 O
6 0
0
6 7
.
3 3
25 一 0
2 5 2 5
O 一 2 5
一
0 一 0
3 3
2 5
弓 p 。 几 p o p , p 。 几 p 。 p 7
图 2 桑属几个种及品种细胞色素氧化酶同工酶
相似系数的组平均聚合树状图
P i长果桑 , P Z蒙桑 , P 3华桑 , P 毛鸡桑 , P。 山桑 ,
P。 白桑 , P 7鲁桑 , P S 琵琶桑 , F . 剑鲁桑
注 : P l
P 4
P 8
长果桑 F Z尹
鸡 桑 F S
琵琶桑 F 。
白桑 · 蒙桑
一 山桑
剑鲁桑
讨 论
一 、 桑属是桑科中一个多种属 , 该属仅在中国就有 14 种 , 在四川有 7 个种 1 个变种 。 但
这些桑种的起源 、 进化及亲缘关系尚待研究 。 H . H i r a n o , T . nI o k u c ih , T . V a g oj n u n 。
( 1 9 7 9 )
、 日本平野久 ( 1 9 7 9 ) , 中国陈道明 ( 一9 5 0 ) 和杨今后等 ( 1 9 8 2 ) , 应用同工酶刘
一些桑品种的遗传特性与亲缘关系进行过讨论 。 但未涉及到四川的野生桑种与品种 。 本文对四
川桑属植物 7个种 两个品种的细胞色素氧化酶同工酶进行了研究 , 酶谱经聚类分析 , 山桑 、
i 期 何大彦等 : 桑属几个种及 品种细胞色素氧化醉同工醉的研究 6
鸡桑 、 华桑被聚为一个类群 , 蒙桑 、 白桑 、 鲁桑及琵琶桑 、 剑鲁桑两个品种被聚 为另 一 类
群 ; 长果桑聚为一个独立的类群 , 表明了各桑种 、 品种间亲缘关系有远近 , 为桑属植物分类
提供了新的依据 。
二 、 从酶谱表型上看 , 以幼叶为材料的 , 细胞色素氧化酶 同工酶的 fR 酶带数较少 , 仅有
13 条 , 酶带多者 5 条 , 少者仅 3 条 , 区带着色浅 , 特征酶带在第 12 或第 13 带上 。 而以冬芽为
材料的 , 过氧化物酶同工酶的 fR 酶带数较多 , 有 26 条酶带 , 多者 8 条 , 少者 4 条 , 一般为 5
一 6 条 , 区带着色深 、 较清晰 , 特征酶带在第 5 带上 。 从这里可看出 , 桑属植物不 同种 、 品
种的同工酶在不 同器官 、 组织的酶带表型上虽有差异 , 但它们都有一 致的规律 、 特点和特征
酶带 , 表明桑属植物的同工酶具有特异性 、 稳定性和重现性 。 因而利用同工酶在桑属植物上
进行分群 、 分类和亲缘关系鉴别是可能的 。,`j
参 考 文 献
〔1〕 林 伯年 , 19 86 , 浙江农业 大学学报 , 12 ( 3 ) : 3 2 8一 , 3 4 。
〔 2〕 兰州生物制品研究所生化组 , 1 97 8 , 生物化学与生物物理进展 , ( 4 ) : 4 5一59 。
〔 3〕 王义 弘等 , 2 95 2 , 东北林学院学报 , ( 1 ) : 14 9一 15 5 。
〔4 〕 阳含熙等 , 19 3 1 , 植物生态学的数量分类方法 , 北京 , 科学 出版社 , 2 15 一 2 2 4 。
〔 5〕 熊全沫 , 19 8 6 , 遗传 , 8 ( 1 ) : 1 一 导。
S T UD IES O N C YT O C H ROM E OX ! D AS E !SO E N Z YME !N
M o r u s W IT H T HE D! S C E L EC T R O P HO RE S IS
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H e D a y a n
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S i c h u a n A e a d e o y o f A 夕 r f e u l t u r a l S c蓄e n e e : )
F e n g W
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( D e P a r t o e n t o f B `0 10 夕夕 , S `c h u a n U n i o e r s i t夕 )
AB S T R AC T
T h e e y t o e h r o m e o x i d a s e i s o e n z y m e i n t h e r e s t i n g b u d s o f M
o r u s h a v e b e e n
s t u d i e d w i t h p o l y a e r y l a m i d e g e l d i s e e l e e t r o p h o r e s i s a n d t h e r e s u l t s a r e a s
f o l l o w s
:
1 ) T h e e y t o e h r o m e o x i d a s e i s o e n z y m e p a t t e r n s a r e s h o w n t h e e o m m o n e五a -
r a e t e r s i n t h e M
o r u ` 。
2 ) T h e e y t o e h r o 位 e o x i d a s e i s o e n z y m e a t l a s 15 r e m a r k a b l e d i f f e r e n e e a m o n g
e a e h s P ec i e s a n d v a r i e t i e s o f t h e M
o r “ s 。
3 ) T互e a n a l了 t i e a l 皿 e t h o d a n d R r o n t h e e y t o C h r o m e o x i d a s e i s o e n z 了m e
时 l a s . 19五t b e u s e d i n t h e t a x o n o 皿 y o f M o r u s .
S u b je e t
: 娜 . r翻 M u lb e r r y v a r i e t y C y t o e h r o m e o x id a s e i s o e n z y m e
P o l y a e r y l a m i d e g e l e l e e t r o Ph o r e s i s
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