全 文 ：第４１卷　第１０期
２０１３年１０月
西北农林科技大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．）
Ｖｏｌ．４１ Ｎｏ．１０
Ｏｃｔ．２０１３
网络出版时间：２０１３－０９－２２　１７：０９
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３９０．Ｓ．２０１３０９２２．１７０９．０２４．ｈｔｍｌ
桉属植物内参基因的筛选及评估
　［收稿日期］　２０１２－１２－０３
　［基金项目］　广东省自然科学基金项目（１０４５２４０４８０１００４３２８，８１５２４０４８０１００００１１，Ｓ２０１２０１０００８７３７）；国家星火计划项目（２０１２ＧＡ７８００１９，
２０１１ＧＡ７８００６７）
　［作者简介］　黄真池（１９７２－），男，湖南岳阳人，副教授，博士，主要从事植物生理生化及分子生物学研究。
　［通信作者］　曾富华（１９５２－），男，湖南浏阳人，教授，博士，主要从事植物生理生化及天然产物研究。
黄真池１，欧阳乐军１，２，张　龙１，２，沙月娥１，２，曾富华１
（１湛江师范学院 生命科学与技术学院，广东 湛江５２４０４８；２湖南农业大学 生物科学与技术学院，湖南 长沙４１０１２８）
［摘　要］　 【目的】分析桉属植物候选内参基因的表达稳定性，筛选合适的内参基因，为深入研究桉属植物愈伤
组织芽分化及体细胞胚胎发生过程中基因的表达变化提供参考。【方法】以尾巨桉、粗皮桉、尾叶桉的叶片及尾叶桉
的绿色、红色和白色３种愈伤组织为材料，提取其总ＲＮＡ后逆转录得ｃＤＮＡ；分别将桉属植物ａｃｔｉｎ基因和拟南芥ａｃ－
ｔｉｎ基因的ＧｅｎＢａｎｋ序列输入Ｐｒｉｍｅｒ３Ｐｌｕｓ软件，设计Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）引物，同时选择ＲＴＥＦ和
ＲＡＲＳ为候选内参基因；以ｃＤＮＡ为模板进行ｑＰＣＲ，得４个候选内参基因的Ｃｔ值；并用ＲｅｆＦｉｎｄｅｒ软件分析候选内
参基因的表达稳定性。【结果】ＲｅｆＦｉｎｄｅｒ软件分析结果显示，４个候选内参基因ＲＴＥＦ、ＲＡＲＳ、ＥＡＣＴ、ＡＡＣＴ的稳定
系数分别为１．１８９，１．８６１，２．８２８和３．２２４，基因表达稳定性由高到低依次为ＲＴＥＦ、ＲＡＲＳ、ＥＡＣＴ、ＡＡＣＴ。【结论】以
ＲＴＥＦ为内参基因分析桉属植物的基因表达变化较为理想。
［关键词］　内参基因；桉属；愈伤组织；ＲｅｆＦｉｎｄｅｒ软件
［中图分类号］　Ｓ７１８．４３ ［文献标志码］　Ａ ［文章编号］　１６７１－９３８７（２０１３）１０－００６７－０６
Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｇｅｎｅｓ
ｉｎ　Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｓｐｅｃｉｅｓ
ＨＵＡＮＧ　Ｚｈｅｎ－ｃｈｉ　１，ＯＵＹＡＮＧ　Ｌｅ－ｊｕｎ１，２，ＺＨＡＮＧ　Ｌｏｎｇ１，２，ＳＨＡ　Ｙｕｅ－ｅ１，２，ＺＥＮＧ　Ｆｕ－ｈｕａ１
（１　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｓｃｈｏｏｌ，Ｚｈａｎｊｉａｎｇ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈａｎｊｉａｎｇ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ５２４０４８，Ｃｈｉｎａ；
２　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｕｎａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ，Ｈｕｎａｎ４１０１２８，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｈｅ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　４ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｅｆ－
ｅｒｅｎｃｅ　ｇｅｎｅｓ　ｂｙ　ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ　ｔｈｅｉｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ．【Ｍｅｔｈｏｄ】Ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　６　Ｅｕｃａ－
ｌｙｐｔｕｓ　ｔｉｓｓｕｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｕｒｏｐｈｙｌｌａ　ｌｅａｆ，ｔｈｅ　Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｕｒｏｐｈｙｌｌａ×Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓ
ｌｅａｆ，ｔｈｅ　Ｅｕｃａｌｉｐｕ　ｐｅｌｌｉｄａｌｅａｆ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｇｒｅｅｎ　ｃａｌｕｓ，ｔｈｅ　ｒｅｄ　ｃａｌｕｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｗｈｉｔｅ　ｃａｌｕｓ　ｏｆ　Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｕｒｏ－
ｐｈｙｌｌａ，ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ｔｏ　ｇｅｔ　ｃＤＮＡ　ｂｙ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ＰＣＲ．４ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
ｇｅｎｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ａｃｔｉｎ　ｏｆ　Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ（ＥＡＣＴ　ＡＢ５０５６２４．１），ａｃｔｉｎ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（ＡＡＣＴＮＭ＿１１４５１９．２），
ＲＴＥＦ（ＥＱ９７４１０３．１）ａｎｄ　ＲＡＲＳ（ＥＱ９７３７８４．１）ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｐｅｒｆｏｒｍ　ｔｈｅ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ
（ｑＰＣＲ）．Ｔｈｅｎ，ｔｈｅ　Ｃｔ　ｖａｌｕｅｓ　ｏｆ　ｑＰＣＲ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ＲｅｆＦｉｎｄｅｒ　ｓｏｆｔｗａｒｅ．【Ｒｅｓｕｌｔ】Ｔｈｅ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｖａｌｕｅｓ
ｏｆ　４ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｇｅｎｅｓ，ＲＴＥＦ，ＲＡＲＳ，ＥＡＣＴａｎｄ　ＡＡＣＴ，ｗｅｒｅ　１．１８９，１．８６１，２．８２８ａｎｄ　３．２２４，ｒｅ－
ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＲＴＥＦｗａｓ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｓｔａｂｌｅ　ｇｅｎｅ，ａｎｄ　ＡＡＣＴｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｍａｘｉｍｕｍ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ．【Ｃｏｎｃｌｕ－
ｓｉｏｎ】ＲＴＥＦｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｓ　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｓｐｅ－
ｃｉｅｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｇｅｎｅ；Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ；ｃａｌｕｓ；ＲｅｆＦｉｎｄｅｒ　ｓｏｆｔｗａｒｅ
DOI:10.13207/j.cnki.jnwafu.2013.10.028
　　 实 时 定 量 ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ，
ｑＰＣＲ）灵敏度高、重复性好、特异性强，在低丰度ＲＮＡ
的转录分析中优势明显。为了消除样品间因ＲＮＡ提
取效率、ＲＮＡ纯度及完整性不同造成的误差，采用
ｑＰＣＲ技术时需要使用内参基因进行相对定量分析。
目前，常被用作内参基因的管家基因有ａｃｔｉｎ、ｔｕｂｕｌｉｎ、
ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ＲＮＡ和ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　１－α等［１－３］。有报
道表明，这些管家基因在不同的试验条件下转录水平
有明显差异［４－６］。这种表达差异会影响ｑＰＣＲ分析的
准确性，甚至得出错误的结论［７－８］。
近年来，对一些模式植物，如拟南芥、烟草、水稻
等的内参基因表达的稳定性开展了较多研究［９－１０］，
但对木本植物的类似研究仅见葡萄、杨树和龙眼
等［１１］。Ｆｅｒｎáｎｄｅｚ等［１２］研究了蓝桉 （Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ
ｇｌｏｂｕｌｕｓ）在冷驯化条件下６个基因的表达情况，发
现泛素蛋白基因和α－微管蛋白基因的表达最为稳
定。ｄｅ　Ａｌｍｅｉｄａ等［１３］报道，蓝桉插条生根时，不管
是否经生长素处理，组蛋白 Ｈ２Ｂ基因和α－微管蛋白
基因的表达最为稳定。Ｂｏａｖａ等［１４］研究表明，巨尾
桉无性系在生物和非生物逆境条件下，延长因子２
基因和泛素蛋白基因的表达最为稳定。ｄｅ　Ｏｌｉｖｅｉｒａ
等［８］的研究表明，蓖麻转录延伸因子－Ⅱ基因（Ｐｕｔａ－
ｔｉｖｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ－Ⅱ，Ｒｉｃｉｎｕｓ
ｃｏｍｍｕｎｉｓ　ＲＴＥＦ，ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＱ９７４１０３．１）及其天
门冬氨酰－ｔＲＮＡ合成酶基因（Ａｓｐａｒｔｙｌ－ｔＲＮＡ　ｓｙｎ－
ｔｈｅｔａｓｅ，ｐｕｔａｔｉｖｅ，Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ　ＲＡＲＳ，Ｇｅｎ－
Ｂａｎｋ：ＥＱ９７３７８４．１）在巨桉等６种桉树的叶片、木质
部和花器官等组织中的表达最为稳定。
桉树具有速生、丰产、轮伐期短等特点，是优良
的纸浆用材，经济效益显著［１５］。目前，世界上已知
桉树有７００多种。桉树中的尾巨桉、粗皮桉和尾叶
桉具有林相整齐、树干通直、木材蓄积量高等特点，
在我国华南地区栽种面积较大。目前，国内尚未见
基于ｑＰＣＲ技术筛选桉属内参基因，并分析其表达
稳定性的研究报道。因此，本研究以尾巨桉ａｃｔｉｎ
基因和拟南芥ａｃｔｉｎ基因作为２个候选内参基因；同
时，由于不同的组织器官、生长发育阶段、生物或非
生物胁迫和激素等都会影响内参基因的特异性表
达［１６］，故选用ＲＴＥＦ 和ＲＡＲＳ 基因作为另外２个
候选内参基因；以尾巨桉、粗皮桉和尾叶桉３种桉属
植物的叶片和尾叶桉的绿色、红色和白色３种愈伤
组织为材料，分析４个桉属内参基因的表达稳定性，
尝试建立适用于分析桉树愈伤组织基因表达变化的
体系，为深入研究桉属植物愈伤组织芽分化及体细
胞胚胎发生过程中基因的表达变化提供参考。
１　材料与方法
１．１　材　料
供试材料包括温室栽培的２年生尾叶桉（Ｅｕ－
ｃａｌｙｐｔｕｓ　ｕｒｏｐｈｙｌｌａ　Ｓ．Ｔ．Ｂｌａｋｅ）、尾巨桉（Ｅｕｃａ－
ｌｙｐｔｕｓ　ｕｒｏｐｈｙｌｌａ×Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓ）和粗皮桉
（Ｅｕｃａｌｉｐｕ　ｐｅｌｌｉｄａ）的成熟叶片，以及按文献［１７］的
方法以尾叶桉实生苗下胚轴作为外植体培养获得的
绿色、红色和白色愈伤组织。
１．２　ＲＮＡ提取与反转录
称取１００ｍｇ新鲜叶片或愈伤组织块于液氮中
研磨成粉。先用１ｍＬ　ＲＮＡｉｓｏ－ｍａｔｅ　ｆｏｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｔｉｓ－
ｓｕｅ处理，再按ＲＮＡｉｓｏ　Ｐｌｕｓ试剂的操作手册说明
提取总ＲＮＡ，用非变性琼脂糖凝胶电泳（１２ｇ／Ｌ，６
Ｖ／ｃｍ，恒压）检测提取总 ＲＮＡ 的品质。在１０μＬ
反应体系中分别加入５×ｇＤＮＡ　Ｅｒａｓｅｒ　Ｂｕｆｆｅｒ　２
μＬ，ｇＤＮＡ　Ｅｒａｓｅｒ　１μＬ和总ＲＮＡ　７μＬ，瞬时离心
混匀，室温反应５ｍｉｎ，以去除总ＲＮＡ中残存的基
因组ＤＮＡ；然后在上述反应体系中依次加入５×
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　Ｂｕｆｆｅｒ　４μＬ，ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　Ｅｎｚｙｍｅ
ＭｉｘⅠ１μＬ，ＲＴ　Ｐｒｉｍｅ　Ｍｉｘ　１μＬ和 ＲＮＡａｓｅ－ｆｒｅｅ
Ｈ２Ｏ　４μＬ，瞬时离心混匀，３７℃反应１５ｍｉｎ，８５℃
５ｓ使酶失活，所得产物为初始ｃＤＮＡ，用于后续标
准曲线和基因表达稳定性的分析。所用试剂均为宝
生物工程（大连）有限公司产品。
１．３　引物设计及ｑＰＣＲ
根据尾巨桉ａｃｔｉｎ基因（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓ×
Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｕｒｏｐｈｙｌｌａ　ｍＲＮＡ，ｓｉｍｉｌａｒ　ｔｏ　ａｃｔｉｎ　ｓｅ－
ｑｕｅｎｃｅ　ＥＡＣＴ，ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ５０５６２４．１）和拟南芥
ａｃｔｉｎ基因（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ａｃｔｉｎ－１２ｍＲＮＡ，
ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｃｄｓ　ＡＡＣＴ，ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：
ＮＭ＿１１４５１９．２）的序列，用Ｐｒｉｍｅｒ３Ｐｌｕｓ软件设计２
对引物。分别为：ＥＡＣＴ（扩增２６８－５１０片段）：
Ｆ．５′－ｇｔｔｇｇａａｔｇｇｇｔｃａｇａａｇｇａ－３′，Ｒ．５′－ｔｔｃｇａａｃａｔｇａｔｔｔ－
ｇｇｇｔｃａ－３′；ＡＡＣＴ（扩增９８３－１０３９片段）：Ｆ．５′－
ａｃａｔｔｇｔｇｃｔｔａｇｔｇｇｔｇｇｃａ－３′，Ｒ．５′－ｃａａｇａｔａｇａｇｃｃｔｃｃｇａｔｃ－
ｃ－３′。参考ｄｅ　Ｏｌｉｖｅｉｒａ等［８］的方法设计２对引物，
分别为ＲＴＥＦ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＱ９７４１０３．１）：Ｆ．５′－ｔｃ－
ｃａａｔｃｃｇａｇｔｃｇｃｔｇｔｃａｔｔｇｔ－３′，Ｒ．５′－ｔｇａｔｇａｇｃｃｔｃｔｃｔｇｇｔｔｔ－
ｇａｃｃｔ－３′；ＲＡＲＳ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＱ９７３７８４．１）：Ｆ．５′－
ａｇａｇｇｔｇａａａｔｔｃｃａｇａａｇｃｃｃｇｔ－３′，Ｒ．５′－ｃｔｔｃｃｃｔｔｔｇｇｃｔｔｃ－
ｃｇｃｃａａｔｔａ－３′。取３种桉树叶片和尾叶桉的３种愈伤
组织材料初始ｃＤＮＡ各３０μＬ，等体积混合得ｃＤ－
８６ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４１卷
ＮＡ母液，设其模板数为１０５ 拷贝。再取３０μＬ　ｃＤ－
ＮＡ母液进行１０倍梯度稀释，设其模板数分别为
１０４，１０３，１０２，１０１ 拷贝。以梯度稀释的ｃＤＮＡ溶液
作模板，进行ｑＰＣＲ扩增。ｑＰＣＲ反应仪器为Ｃｈｒｏ－
ｍｏ　４ＴＭＳｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）。ｑＰＣＲ反应体系为：ｉＱＴＭ
２×ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（２×Ｍｉｘ　ｆｏｒ　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ
ＰＣＲ，Ｂｉｏ－Ｒａｄ）１２．５μＬ，１０μｍｏｌ／Ｌ的上、下游引物
各１μＬ，ｄｄＨ２Ｏ　８．５μＬ，模板２μＬ，总体积为２５
μＬ。扩增程序：９４℃１０ｓ，５８℃１０ｓ，７２℃１５ｓ，延
伸后荧光读数，共４０个循环；从７０～９５℃，每升高
１℃荧光读数１次。每个反应３次重复。用 Ｏｐｔｉ－
ｃｏｎ　Ｍｏｎｉｔｏｒ　３．１软件，分析４个内参基因的扩增效
率、标准曲线斜率、相关性、目的片段解链温度等。
同时，用琼脂糖凝胶电泳（１８ｇ／Ｌ，６Ｖ／ｃｍ，恒压）检
测扩增产物的大小。将６种组织的初始ｃＤＮＡ稀释
１倍后作为模板，按ｑＰＣＲ方法同时进行４个基因
片段的ＰＣＲ扩增，得Ｃｔ值。
数据处理用ＤＰＳ　３．０１软件。基因表达稳定性
比较用Ｃｏｔｔｏｎ　ＥＳＴ　ｄａｔａｂａｓｅ数据库（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．
ｌｅｏｎｘｉｅ．ｃｏｍ）的ＲｅｆＦｉｎｄｅｒ软件进行综合分析。
２　结果与分析
２．１　桉属植物ＲＮＡ的提取及品质检测
桉树组织中的多糖、酚类和醌类物质含量丰富，
这些物质的化学性质与核酸相似，严重干扰 ＲＮＡ
的提取；预试验中用几种市售 ＲＮＡ提取试剂盒均
未能得到高品质的总ＲＮＡ，或者总ＲＮＡ得率非常
低；但桉树组织经ＲＮＡｉｓｏ－ｍａｔｅ　ｆｏｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｔｉｓｓｕｅ预
处理，再用ＲＮＡｉｓｏ　Ｐｌｕｓ提取，即可得到高品质的总
ＲＮＡ。经紫外分光光度法检测，所得桉树组织总
ＲＮＡ的 ＯＤ２６０／ＯＤ２８０值为１．８～２．１。非变性琼脂
糖凝胶电泳结果显示提取的总 ＲＮＡ 完整，２８Ｓ
ｒＲＮＡ条带亮度高，约为１８ＳｒＲＮＡ条带亮度的２
倍，无可见的ＤＮＡ污染（图１）。
图１　６种桉树组织总ＲＮＡ的琼脂糖凝胶电泳结果
Ｍ．５ｋｂ　ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１～６．分别对应尾叶桉绿色、红色、白色愈伤组织及尾叶桉、尾巨桉和粗皮桉叶片
Ｆｉｇ．１　Ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｆｒｏｍ　６　Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｔｉｓｓｕｅｓ
Ｍ．５ｋｂ　ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１－６．Ｇｒｅｅｎ　ｃａｌｕｓ，ｒｅｄ　ｃａｌｕｓ，ｗｈｉｔｅ　ｃａｌｕｓ，Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｕｒｏｐｈｙｌｌａｌｅａｆ，
Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｕｒｏｐｈｙｌｌａ×Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓ　ｌｅａｆ　ａｎｄ　Ｅｕｃａｌｉｐｕ　ｐｅｌｌｉｄａｌｅａｆ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ
２．２　桉属植物４个候选内参基因的ｑＰＣＲ标准曲线
从图２可以看出，桉属组织４个候选内参基因
ＲＴＥＦ、ＲＡＲＳ、ＥＡＣＴ和ＡＡＣＴｑＰＣＲ的融链曲线
均只有１个特征峰值，说明扩增特异性较好。从表
１可以看出，以ｃＤＮＡ母液为模板扩增时，ＥＡＣＴ基
因对应的Ｃｔ值最小，说明其在６种材料中的综合表
达量最高；Ｏｐｔｉｃｏｎ　Ｍｏｎｉｔｏｒ　３．１软件分析结果显
示，各内参基因扩增效率为１００％左右，标准曲线的
ｒ２ 值大于０．９８。琼脂糖凝胶电泳结果表明，扩增片
段条带整齐，无可见引物二聚体（图３）。
图２　桉属４个候选内参基因的ｑＰＣＲ扩增融链曲线
Ｆｉｇ．２　Ｍｅｌｔｉｎｇ　ｃｕｒｖｅｓ　ｏｆ　４ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　６　Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｂｙ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ
９６第１０期 黄真池，等：桉属植物内参基因的筛选及评估
表１　桉属植物４个候选内参基因的ｑＰＣＲ标准曲线及扩增条带参数
Ｔａｂｌｅ　１　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｃｕｒｖｅｓ　ａｎｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｏｆ　４ｃａｎｄｉｄａｔｅ
ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｓｐｅｃｉｅｓ
基因
Ｇｅｎｅ
ｃＤＮＡ母液的Ｃｔ值
Ｃｔ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　ｉｎｉｔｉａｌ
ｃＤＮＡ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ
扩增效率／％
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ
曲线斜率
Ｓｌｏｐｅ　ｏｆ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｃｕｒｖｅ
ｒ２
条带大小／ｂｐ
Ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｓｉｚｅ
解链温度／℃
Ｔｍ
ＲＴＥＦ　 ２６．８　 ９８．８ －３．３５　 ０．９８８　 １５２　 ８２
ＲＡＲＳ　 ２６．９　 １０３．０ －３．２５　 ０．９８７　 １５５　 ８１
ＥＡＣＴ　 ２２．５　 ９９．３ －３．３４　 ０．９９２　 ２４３　 ８３
ＡＡＣＴ　 ２７．５　 １００．０ －３．３２　 ０．９８７　 １５８　 ７８
图３　桉属植物４个候选内参基因ｑＰＣＲ扩增条带的
琼脂糖凝胶电泳结果
Ｍ．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１～４．分别为ＲＡＲＳ、
ＲＴＥＦ、ＥＡＣＴ和ＡＡＣＴ
Ｆｉｇ．３　Ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ
ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｏｆ　４ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ
Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｂｙ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ
Ｍ．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１－４．Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｏｆ
ＲＡＲＳ，ＲＴＥＦ，ＥＡＣＴａｎｄ　ＡＡＣＴ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ
２．３　桉属植物４个候选内参基因的Ｃｔ值
将各材料的初始ｃＤＮＡ稀释１倍后作为模板，
进行ＲＴ－ｑＰＣＲ反应，得Ｃｔ值（图４）。从图４可以
看出，由于桉属６种材料的含水量、发育状态、ＲＮＡ
提取得率和ＲＮＡ完整性不同，不同材料在扩增同
一基因，或同一材料在扩增不同基因时，Ｃｔ值均有
明显差异，其原因主要是同一组织中不同基因的表
达强度不同。ＤＰＳ　３．０１软件统计分析显示，同一扩
增反应的３个重复的标准差很小，Ｃｔ值非常接近，
说明扩增反应重复性好，能准确反映基因的转录水
平。
２．４　桉属植物４个候选内参基因的表达稳定性
Ｃｏｔｔｏｎ　ＥＳＴ　ｄａｔａｂａｓｅ数据库的ＲｅｆＦｉｎｄｅｒ软件
整合了Ｄｅｌｔａ　ＣＴ、ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ、Ｎｏｒｍｆｉｎｄｅｒ、Ｇｅｎｏｒｍ
等内参基因稳定性分析软件，能综合评估基因的表
达变化，得出可靠的结论。经分析，桉属４个内参基
因表达的稳定性由高到低依次为ＲＴＥＦ、ＲＡＲＳ、
ＥＡＣＴ、ＡＡＣＴ（表２）。从表２可以看出，由于不同
软件评价基因表达稳定性的计算方法不同，用单个
软件分析时，ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ软件的评价结果与其他３
个软件不一致；ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ软件评价结果显示，
ＡＡＣＴ为最适内参基因，而其他软件认为ＲＴＥＦ的
表达最为稳定。由此可见，由于软件间的算法和判
断标准不同，不同软件得出同一内参基因的表达稳
定性系数不一致，因此评估内参基因时宜综合分析
后进行排序比较。
图４　６种桉树组织中４个候选内参基因
ｑＰＣＲ　Ｃｔ值的比较
１～３．分别为尾巨桉、粗皮桉和尾叶桉的叶片组织；
４～６．分别为尾叶桉的绿色、红色和白色愈伤组织
Ｆｉｇ．４　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ　Ｃｔ　ｏｆ
４ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　６　Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｔｉｓｓｕｅｓ
１－３．Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｕｒｏｐｈｙｌｌａ×Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓ　ｌｅａｆ，
Ｅｕｃａｌｉｐｕ　ｐｅｌｌｉｄａｌｅａｆ，Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｕｒｏｐｈｙｌｌａｌｅａｆ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；
４－６．Ｇｒｅｅｎ　ｃａｌｕｓ，ｒｅｄ　ｃａｌｕｓ　ａｎｄ　ｗｈｉｔｅ　ｃａｌｕｓ　ｏｆ
Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｕｒｏｐｈｙｌｌａ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ
　　应用ＲｅｆＦｉｎｄｅｒ软件分析６种桉树组织，尾叶
桉３种愈伤组织、尾叶桉叶片和３种愈伤组织中内
参基因表达的稳定性，结果（图５）显示，４种内参基
因的稳定性评估结果完全一致，不仅稳定性排序相
同，而且稳定性系数也完全一致，均以 ＲＴＥＦ的表
达最为稳定；对尾巨桉、粗皮桉和尾叶桉３种桉树叶
片的稳定系数分析结果与上述３种分析稍有不同，
但也以ＲＴＥＦ的表达最为稳定，ＡＡＣＴ稳定性最低
（图５）。
０７ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４１卷
表２　桉属植物４个候选内参基因的表达稳定性评估
Ｔａｂｌｅ　２　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ　ｏｆ　４ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｓｐｅｃｉｅｓ
软件
Ｓｏｆｔｗａｒｅ
表达稳定性由高到低排序
Ｒａｎｋｉｎｇ　ｏｒｄｅｒ　ｏｆ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ
Ｄｅｌｔａ　ＣＴ　 ＲＴＥＦ２．３７　 ＲＡＲＳ２．４５　 ＥＡＣＴ３．１４　 ＡＡＣＴ３．４９
ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ　 ＡＡＣＴ０．２６１　 ＲＴＥＦ２．２４９　 ＲＡＲＳ３．３２２　 ＥＡＣＴ３．８９４
Ｎｏｒｍｆｉｎｄｅｒ　 ＲＴＥＦ０．８７６　 ＲＡＲＳ１．００６　 ＥＡＣＴ２．７０１　 ＡＡＣＴ３．２１６
Ｇｅｎｏｒｍ　 ＲＴＥＦ１．７５３　 ＲＡＲＳ１．７５３　 ＥＡＣＴ２．２３５　 ＡＡＣＴ２．８６４
ＲｅｆＦｉｎｄｅｒ　 ＲＴＥＦ１．１８９　 ＲＡＲＳ１．８６１　 ＥＡＣＴ２．８２８　 ＡＡＣＴ３．２２４
　　注：表中数据为用软件计算得出的稳定系数，数值越小，内参基因的表达水平越稳定。
Ｎｏｔｅ：Ｄａｔａ　ａｒｅ　ｔｈｅ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｔｈｅ　ｓｍａｌｅｒ　ｔｈｅ　ｖａｌｕｅ，ｔｈｅ　ｍｏｒｅ　ｓｔａｂｌｅ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｓ．
图５　基于ＲｅｆＦｉｎｄｅｒ软件评估６种桉树组织中４个候选内参基因的表达稳定性
Ｆｉｇ．５　Ｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　６　Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ｂｙ　ＲｅｆＦｉｎｄｅｒ　ｓｏｆｔｗａｒｅ
３　结论与讨论
ｑＰＣＲ是分析基因表达的快捷、准确的技术，但
其结果是否准确依赖于内参基因是否可信。多数研
究直接选用ａｃｔｉｎ、ｔｕｂｕｌｉｎ、ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　Ｃ 等基因作为
内参基因，而未对这些基因在研究材料中的表达稳
定性进行评估［１８－１９］；如果内参基因在不同组织或不
同发育阶段的表达有明显变化，则有可能导致研究
者得出完全相反的结论［７－８］。本研究比较了桉属ａｃ－
ｔｉｎ基因、拟南芥ａｃｔｉｎ基因、ＲＴＥＦ 基因和ＲＡＲＳ
基因的表达稳定性，通过比对发现，桉属ａｃｔｉｎ和拟
南芥ａｃｔｉｎ基因的表达稳定性都不够理想；ＲＴＥＦ
基因在桉属的６种组织中的表达均最为稳定，表明
ＲＴＥＦ基因可作为评估桉属植物基因表达的理想内
参基因。
桉属植物再生难度大，但其遗传改良又必须以
高效再生体系为基础［２０］。本研究探讨了尾叶桉愈
伤组织中内参基因表达的稳定性，证实ＲＴＥＦ基因
可作为桉属植物基因表达变化分析的内参基因。本
研究结果可为分析桉属愈伤组织芽分化和体细胞胚
胎发生过程中基因表达的变化及桉属植物再生的分
子机理提供参考。
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ｔｗｅｅｎ　ｂｕｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｅｖｅｒａｌ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｂｉｏ－
ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｉｎｄｅｘｅｓ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｔｙｐｅｓ　ｏｆ　Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｕｒｏｐｈｙｌｌａ　ｓ．ｔ．
ｂｌａｋｅ　ｃａｌｕｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，２０１０，４６
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ｏｆ　ｄｉｈｙｄｒｏｆｌａｖｏｎｏｌ　４－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｐｓｄｆｒ１ｆｒｏｍ　ｔｒｅｅ　ｐｅｏｎｙ
（Ｐａｅｏｎｉａ　ｓｕｆｆｒｕｔｉｃｏｓａ　ａｎｄｒ．）［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　Ｊｏｕｒｎａｌ，
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ｐｓｂＯｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｉｎ　ａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｈｏｔｏｓｙｎ－
ｔｈｅｔｉｃ　ａｐｐａｒａｔｕｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ　ｉｎ　Ｆｅｓｔｕｃａ　ａｒｕｎｄｉｎａ－
ｃｅａ　ａｎｄ　Ｆ．ｐｒａｔｅｎｓｉｓ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｐｌａｎｔ，２０１２，３４：１９１５－
１９２４．
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ｃａｌｙｐｔｕｓ　ｕｒｏｐｈｙｌｌａｆｒｏｍ　ｓｅｅｄｌｉｎｇ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｈｙｐｏｃｏｔｙｌｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｌ
Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，２０１０，５４：１３１－１３４．
２７ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４１卷