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杨梅叶多糖的提取及抗氧化性研究



全 文 :北方园艺2014(07):119~123 ·贮藏保鲜加工·
第一作者简介:李粉玲(1970-),女,本科,高级实验师,现主要从事
食品化学等研究工作。E-mail:lfl8832@126.com.
责任作者:蔡汉权(1967-),男,高级实验师,现主要从事植物组织
培养等研究工作。E-mail:hanquan010@126.com.
收稿日期:2013-11-14
杨梅叶多糖的提取及抗氧化性研究
李 粉 玲,蔡 汉 权,林   敏
(韩山师范学院,广东 潮州521041)
  摘 要:以杨梅叶为试材,采用超声波辅助提取技术研究了杨梅叶粗多糖的最佳提取工艺条
件以及杨梅叶中多糖的抗氧化性。结果表明:超声波辅助提取杨梅叶多糖的最佳工艺为超声波
功率250W,超声波处理20min,超声波温度65℃,料液比1∶60g/mL;其中,超声波温度对杨梅
叶多糖提取率的影响最大;杨梅叶中的多糖对·OH和O·2 均有明显的清除作用,具有一定的还
原能力,即杨梅叶多糖具有抗氧化性。
关键词:杨梅叶;多糖;超声波;提取率;抗氧化性;最佳工艺
中图分类号:S 667.6 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2014)07-0119-05
  杨梅(Myrica rubra Sieb.et Zucc.)属杨梅科
(Myricaceae)杨梅属多年生常绿乔木,是我国特色水果,
以浙江省种植面积最大[1]。杨梅为药食两用芳香植物,
已有几千年的利用历史。杨梅叶也具有一定的药用价
值,具有燥湿祛风、止痒、治疗皮肤湿疹等功效。杨梅枝
叶和根皮在中国和日本等地常用来作为收敛剂、解毒剂
和肠胃止泻剂等传统中药的成分[2]。2011年李国成
等[3]首次报道了杨梅叶中具有降血糖功效的化学成分,
其中包括山奈酚、檞皮素、杨梅素、槲皮素-3-O?α?L-鼠李
    
糖苷、杨梅苷和杨梅素-3-O-βD-葡萄糖苷6种化合物。
但目前,对于杨梅叶的研究多集中于杨梅叶中精油成
分、总黄酮、酚类物质的提取及其有效化学成分抗氧化
性等方面,对于杨梅叶中多糖提取的研究尚鲜见报道。
近年来,随着科技的进步,发现许多植物多糖与生物体
维持自身机能的机制密切相关,具有丰富的生物活性,
包括免疫调节、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗辐射、抗菌抗
病毒、保护肝脏等保健作用。此外,植物多糖优秀的吸
水性和高保湿特性,使得其被广泛运用到化妆品、食品
等领域。因此,从杨梅叶中提取多糖,既能“变废为宝”,
为促进杨梅叶资源利用,杨梅叶的开发利用提供科学依
据,同时也可为系统开发杨梅叶在食品保存、医药和保
健领域的应用提供理论参考。
对于植物多糖的提取,超声波辅助提取法具有明显
    
Toxicity Test of Different Fungicides and Its Mixed
Preparations Against Sclerotinia schinseng
WANG Yan,WANG Chun-wei,GAO Jie,MA Jing-jing
(Colege of Agronomy,Jilin Agricultural University,Changchun,Jilin 130118)
Abstract:Toxicities of 27fungicides and 69proportions of 9fungicides against S.schinseng were tested by mycelium
growth rate method in laboratory.The results showed that the inhibitory efect of bacilus subtilis 100bilion/g WP,
bacilus cereus 30bilion/g WP(Yiwei),difenoconazole 10% WG,penconazole 10%EC,trichoderma 20bilion/g WP,
trichoderma 0.2bilion/g WG,bacilus cereus 30bilion/g WP(Kebanding),dimethachlon 50% WP,propiconazole 25%
EC,physcion 0.5% AS was better.Their EC50values were lower than 0.05mg/L,EC90 values were lower than
5.0mg/L.In diferent proportions,46proportions had synergistic action,the most obvious synergistic action was bacilus
cereus 30bilion/g WP(Yiwei)+dimethachlon 95%TC 3∶1,the CTC was 988.54.Efective fungicides and proportions
were screened out,which had important significance to fungicides control the disease safely and eficiently.
Key words:Panax ginseng;Sclerotinia schinseng;fungicides;toxicity test;synergistic action
911
·贮藏保鲜加工· 北方园艺2014(07):119~123
的优势。有研究采用超声波辅助提取多糖,超声技术应
用于植物细胞破壁,大大的加快了反应速度,有效提高
了多糖提取率[4]。另外超声波破碎过程是一个物理过
程,浸提过程中无化学反应,浸提物在短时间内保持不
变,生物活性不减,同时提高了破碎速度,缩短了破碎时
间,可极大的提高提取效率[5]。现如今,超声波技术不
仅用于龙眼、荔枝、大枣、香菇等的多糖提取,还应用于
多种植物叶子的多糖提取,如厚朴叶子[6]、柿子叶[7]、竹
叶[8]等的多糖提取。
羟自由基和超氧自由基是生物体内主要的不稳定
的氧自由基,它们是造成机体老化和组织损伤的主要原
因,并且对许多疾病的发生变化产生了影响。近年来的
研究表明,植物多糖对自由基具有一定的抗氧化作用。
该试验通过提取杨梅叶中的多糖,研究杨梅叶中多糖对
羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除作用以及还原
能力,以期对杨梅叶多糖的抗氧化性进行验证。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为杨梅叶,日晒后烘干粉碎备用。
供试试剂:葡萄糖标准品(分析纯)、铝片、碳酸氢
钠、氯仿、正丁醇、苯酚、浓硫酸、浓盐酸、无水乙醇、石油
醚、硫酸亚铁、水杨酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、30%双
氧水、三氯乙酸、氯化铁、铁氰化钾、焦性没食子酸(邻苯
三酚)均为分析纯、去离子水。
供试仪器:数控超声波清洗器(KQ-500DB)购于昆
山市超声声仪器有限公司,紫外可见分光光度计(752S)
购于上海精密科学仪器有限公司,电热鼓风干燥箱
(101A-1)购于上海协达计控设备公司通州医科仪器厂,
循环水式多用真空泵(SHD-III)购于保定高新区阳光科
教仪器厂,冷藏冷冻箱(BCD-217YB)购于Haier,多功能
粉碎机(ST-02A)购于上海树立仪器仪表有限公司,电子
天平(FA2004N)购于上海精密科学仪器有限公司,调温
电热套(KDM)购于山东省鄄城永兴仪器厂,台式离心机
(KA-1000)购于上海安亭科学仪器厂,气浴恒温振荡器
(ET-Q)购于常州荣冠实验分析仪器厂。
1.2 试验方法
1.2.1 杨梅叶多糖的提取 杨梅叶的预处理:将杨梅叶
晒干到一定程度后,置于电热鼓风干燥箱内以60℃左右
烘干、粉碎、过50目筛,于试剂瓶中密封备用。称取样品
粉末10.00g于索氏提取器中,用60mL石油醚(80℃左
右)回流脱脂2次,1h/次;再用60mL无水乙醇回流2
次,1h/次,除去单糖和低聚糖,回流后烘干备用[9]。将
脱脂烘干后的杨梅叶样品粉末进行称重,计算提取率为
88.1%。杨梅叶粗多糖的提取:称取5份脱脂烘干后的
杨梅叶样品0.881g/份,放入5个碘量瓶中,加入一定量
的去离子水,超声波浸提,浸提结束后进行减压抽滤,收
集滤液。将所收集的滤液在电热套中加热浓缩至1~
2mL。浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇,充分搅拌,
放入冰箱中静置2h后在2 500r/min下离心25min,收
集沉淀,沉淀物用无水乙醇洗涤数次直至乙醇接近无
色,得到的沉淀烘干后即为杨梅叶粗多糖。粗多糖脱
色:粗多糖加适量去离子水溶解,加入0.010g高岭土进
行脱色,震荡10min左右静置一段时间,除去色素,减
压抽滤,取其滤液。脱色后的滤液,用去离子水定容至
100mL容量瓶中,利用苯酚-硫酸法测其吸光度A,根据
回归方程计算多糖的含量 W(mg)。
1.2.2 杨梅叶多糖含量测定 采用苯酚-硫酸法[10]测
定杨梅叶多糖含量。标准曲线的制作:准确称取干燥至
恒重的葡萄糖标准品10mg,加适量去离子水溶解,移至
100mL容量瓶中定容,得浓度为0.1mg/mL的葡萄糖
溶液。分别取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL的0.1mg/mL
葡萄糖标准液,加离子水稀释分别至0.01、0.02、0.03、
0.04、0.05mg/mL浓度的葡萄糖标准溶液。加入
1.0mL的5%苯酚溶液,混匀。沿管壁加入5.0mL浓
硫酸,静置5min后在25~30℃水浴中加热15min,转入
冷水浴中冷却。以蒸馏水为空白,置于490nm波长下
测定吸光度。杨梅叶多糖含量测定:取杨梅叶多糖浸提
液溶于适量去离子水中,转移到100mL容量瓶中,定
容。精密吸取上述溶液1.0mL,测定吸光度,根据回归方
程求出含量。计算公式:提取液多糖含量(mg/g)=c×V/
W,式中,c为标准曲线上查得的葡萄糖浓度(mg/g),V为
杨梅叶多糖溶液稀释后的总体积(mL),W为提取多糖
时称取的杨梅叶重量(g)。
1.2.3 抗氧化性的测定 羟自由基(·OH)清除试
验:将杨梅叶多糖配成0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、
0.35mg/mL 6种不同浓度的多糖溶液。反应体系中含
有8.8mmol/L H2O21mL、9mmol/L FeSO41mL、
9mmol/L水杨酸-乙醇1mL、不同浓度的多糖溶液
1mL。最后加H2O2 启动反应,以蒸馏水作为参比,在
波长510nm处测定各浓度的吸光度值[11-12]。自由基清
除率的计算公式为:·OH清除率(%)=[A0-(AX-
AX0)]/A0×100%,其中,A0 为空白对照液吸光度值,只
加入硫酸亚铁、水杨酸-乙醇、过氧化氢;AX为加入杨梅
叶多糖溶液后的吸光度值;AX0为不加显色剂H2O2的吸
光度值。超氧阴离子自由基(O·2 )清除试验:将pH 8.2、
50mmol/L Tris-HCl缓冲溶液4.5mL与4.2mL蒸馏
水混匀,于25℃水浴中20min后立即加入5mmol/L邻苯
三酚(25℃预热)0.3mL,混匀,在4min内,每隔30s在
325nm波长下测定吸光值,计算邻苯三酚溶液的吸光值
随时间的变化率A0[12]。再将1.0mL不同浓度的杨梅
叶多糖与3.2mL蒸馏水混匀,测定添加样品的邻苯三
酚溶液在325nm处吸光值,计算其吸光值随时间的变
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北方园艺2014(07):119~123 ·贮藏保鲜加工·
化率(AX)。超氧阴离子自由基清除率的计算公式为:清
除率(%)=(A0-AX)/A0×100%,其中,A0 为空白的平
均吸光值随时间变化率,AX为试样的平均吸光值随时间
变化率。还原能力测定:取一定浓度的多糖样品溶液
1mL加入pH 6.6的磷酸缓冲溶液和1% K3Fe(CN)6 溶
液各2.5mL,混匀,在50℃下保温20min,加入2.5mL
10%的三氯乙酸溶液,吸取此溶液2.5mL,加入2.5mL
蒸馏水和0.5mL 0.1%FeCl3,混匀,30min后于700nm
波长处测定吸光度[12-13]。
1.2.4 单因素试验 料液比对杨梅叶多糖得率的影响:
取5份处理后的杨梅叶粉末样品各0.881g,选择料液比
分别为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60g/mL,设置超
声波功率为200W,浸提时间为15min,各浸提1次,趁
热过滤,按苯酚-硫酸法测定多糖含量计算提取量。超声
波温度对杨梅叶多糖得率的影响:取5份处理后的杨梅
叶粉末样品各0.881g,选择料液比为1∶50g/mL,超声
波时间为15min、超声波功率为200W,在45、50、55、60、
65℃的环境下各浸提1次,趁热过滤,按苯酚-硫酸法测
定多糖含量计算提取量。超声波功率对杨梅叶多糖得
率的影响:称取5份处理后的杨梅叶样品各0.881g,选
择料液比为1∶50g/mL,超声波温度为60℃,在超声波
功率分别为150、200、250、300、350W的条件下超声波
15min,各浸提1次,趁热过滤,按苯酚-硫酸法测定多
糖含量计算提取量。超声波时间对杨梅叶多糖得率的
影响:称取5份处理后的杨梅叶样品各0.881g,按照料
液比为1∶50g/mL,超声波功率为200W,超声波温度
为60℃的条件,进行时间分别为10、15、20、25、30min的
超声波浸提各1次,趁热过滤,按苯酚-硫酸法测定多糖
含量计算提取量。浸提次数对杨梅叶多糖得率的影响:
称取3份处理后的杨梅叶粉末样品各0.881g,料液
比1∶50g/mL、超声波温度为60℃、超声波时间为
15min、超声波功率为200W,分别浸提1、2、3次,趁热
过滤,按苯酚-硫酸法测定多糖含量计算提取量。
1.2.5 正交实验 在单因素试验的基础上,选取温度、
料液比、超声波功率和超声波时间4个因素进行L9(34)
正交实验,以多糖含量为指标,筛选最佳工艺(表1)。
表1 正交实验因素与水平
水平
因素
A超声波
温度/℃
B料液比
/g·mL-1
C超声波
功率/W
D超声波
时间/min
1  55  1∶40  200  10
2  60  1∶50  250  15
3  65  1∶60  300  20
2 结果与分析
2.1 葡萄糖标准曲线的绘制
以吸光度A为纵坐标,葡萄糖含量为横坐标,制作
苯酚-硫酸法标准曲线(图1)。
图1 葡萄糖标准曲线
2.2 单因素试验结果
2.2.1 料液比对杨梅叶多糖得率的影响 由图2可知,
在料液比为1∶50g/mL时杨梅叶多糖提取量达到最
高。当料液比大于1∶50g/mL时,随着水量的增加,杨
梅叶多糖得率反而下降,这可能是因为水量增加过多反
而不利于多糖的提取,也会影响后期的浓缩处理。
图2 料液比对杨梅叶多糖得率的影响
2.2.2 超声波温度对杨梅叶多糖得率的影响 由图3
可知,当温度达到60℃杨梅叶多糖得率最高。刚开始多
糖得率随温度的升高而增加,但当温度大于60℃时,多
糖得率有下降趋势。这可能是因为高温对杨梅叶细胞
壁有一定的破坏作用,增加多糖的溶解度,也有可能使
多糖降解变性[14]。
图3 超声波温度对杨梅叶多糖得率的影响
2.2.3 超声波功率对杨梅叶多糖得率的影响 从图4
可知,杨梅叶多糖得率随着超声波功率的增加先增后
降,功率200W时最大。这是由于超声波功率增大,对
细胞壁的破碎作用增强,胞内多糖溶出速度快,得率增
加[15]。但是随着继续加大,提取液流动加速,物料停留
在超声场中时间减少,破壁作用也减弱了。
2.2.4 超声波时间对杨梅叶多糖得率的影响 由图5
可知,超声波浸提15min时多糖的得率最高。浸提时间
121
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图4 超声波功率对杨梅叶多糖得率的影响
图5 超声波时间对杨梅叶多糖得率的影响
小于15min,多糖提取不充分;浸提时间大于15min,随
着时间的延长,多糖得率逐渐降低,可能是浸提时间过
长使某些杂质溶出,使多糖的相对含量下降。
2.2.5 浸提次数对杨梅叶多糖得率的影响 由图6可
知,杨梅叶多糖得率随浸提次数的增加而增大。但是增
幅不大,因此从经济角度考虑,可以认为2次浸提已
充分。
图6 浸提次数对杨梅叶多糖得率的影响
2.3 正交实验结果
由表2可知,影响杨梅叶中多糖提取的主次因素顺
序为B>A>D>C,即超声波温度>超声波时间>超声
波功率>料液比,超声波温度对多糖提取率的影响最
大,所以要严格控制好温度的高低。根据最优水平确定
超声波辅助法萃取杨梅叶多糖的工艺为A3B3C2D3,即
超声波温度65℃,料液比1∶60g/mL,超声波功率
250W,超声波时间20min。由于该组合未出现在正交
组合中,故须进行验证。
2.4 验证试验
为了验证正交实验最优条件,在此工艺条件下进行
验证试验。经测定,杨梅叶在此条件下的提取量为
    表2 L9(34)正交实验结果分析
试验号
A超声波
温度/℃
B料液比
/g·mL-1
C超声波功率
/W
D超声波时间
/min
杨梅叶多糖含量
/mg·g-1
1  1(55) 1(1∶40) 1(200) 1(10) 0.528
2  1  2(1∶50) 2(250) 2(15) 0.281
3  1  3(1∶60) 3(300) 3(20) 0.873
4  2(60) 1  2  3  0.946
5  2  2  3  1  0.625
6  2  3  1  2  0.916
7  3(65) 1  3  2  0.789
8  3  2  1  3  1.771
9  3  3  2  1  2.237
K1 0.754  0.561  1.072  1.130
K2 0.892  0.829  1.155  0.662
K3 1.342  1.599  0.762  1.196
R  0.588  1.038  0.393  0.535
最优水平 A3 B3 C2 D3
影响因素 超声波温度>超声波时间>超声波功率>料液比
2.344mg/g,多糖含量高于正交实验组合中的任何1组,
由此说明正交实验中确定的最优提取工艺是合理的。
2.5 抗氧化性的测定结果
2.5.1 杨梅叶多糖清除羟自由基(·OH)的能力 由
图7可知,杨梅叶多糖对·OH有明显的清除作用,随着
多糖浓度的增加,清除·OH的能力增强,浓度达到
0.20mg/mL后清除能力开始下降并趋于平缓。
图7 不同多糖浓度对羟自由基清除率的影响
2.5.2 杨梅叶多糖清除超氧阴离子自由基(O·2 )的能力
 由图8可知,杨梅叶多糖对超氧阴离子自由基(O·2 )具
有一定的抑制作用,并且随着多糖浓度的增大,清除O·2
的能力逐渐增强。并且杨梅叶多糖清除O·2 的能力比
清除·OH的强。
图8 不同多糖浓度对超氧阴离子自由基清除率的影响
221
北方园艺2014(07):119~123 ·贮藏保鲜加工·
2.5.3 还原能力 吸光度越大,则表明样品的还原能力
越强,由图9可知,在该浓度范围内杨梅叶多糖的还原
能力随着多糖浓度的增加而逐步增强。
图9 不同多糖浓度对还原能力的影响
3 结论与讨论
该试验结果表明,超声波辅助提取杨梅叶多糖的最
优工艺为超声波功率250W,超声波处理20min,超声波
温度65℃,料液比1∶60g/mL。其中,影响杨梅叶多糖
提取的主次因素依次为超声波温度>超声波时间>超
声波功率>料液比。另外,杨梅叶中的多糖对·OH和
O·2 都有明显的清除作用,且具有一定的还原能力,即杨
梅叶多糖具有抗氧化活性。
在生命活动的氧化代谢过程中,会不断产生各种自
由基。超氧阴离子自由基和羟自由基是最具代表性的
活性氧自由基。在机体的氧化反应中,超氧阴离子自由
基通常最先形成,可通过形成其它多种有破坏作用的自
由基而使其功能放大。羟自由基毒性最强,几乎能与所
有功能性生物大分子起反应,造成生物体的巨大伤
害[16]。该研究证明了杨梅叶多糖具有较好的清除羟自
由基和超氧阴离子自由基的能力,有望进一步开发杨梅
叶多糖,使之成为新型天然抗氧化及自由基清除剂。
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Study on the Extraction and Antioxidant Activity of Polysaccharides From Bayberry Leaf
LI Fen-ling,CAI Han-quan,LIN Min
(Hanshan Normal University,Chaozhou,Guangdong 521041)
Abstract:Taking bayberry leaf as material,the ultrasonic assisted extraction technology of bayberry leaf crude
polysaccharide optimum extraction conditions and bayberry leaf antioxidant activity of polysaccharide were studied.The
results showed that the ultrasonic assisted extraction of the better programs bayberry leaves polysaccharide;ultrasonic
power was 250W,ultrasonic time was 20min,ultrasonic temperature was 65℃,the solid to liquid ratio was 1∶60g/mL;
the ultrasonic temperature had the greatest influence on extraction rate.In addition,the of bayberry leaves in the
polysaccharide·OH and O·2 had significant scavenging efect,the reduction ability,bayberry leaves polysaccharides had
antioxidant activity.
Key words:bayberry leaves;polysaccharide;ultrasonic;extraction rate;antioxidant activity;optimum technolgy
321