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饲料研究 FEED ＲESEAＲCH NO． 23，2015 55
收稿日期:2015 － 07 － 29
第一作者:周平和，E － mail:1397271900@ qq. com
通信作者:李丽，E － mail:rainbow1992@ 163. com
杨树花超声波萃取物的制备和抑菌作用研究
周平和 李 丽 唐 毓 刘 哲 刘晓静 郭 健
辽宁医学院畜牧兽医学院，锦州 121001
摘 要 试验以杨树花黄酮类提取物具有明显的抑菌作用为依据，设计以浸提温度、浸提时间、料液比
和浸提液浓度为四因素的三水平 L9(3
4)正交试验，采用超声波萃取技术优化杨树花中黄酮类化合物的提取
工艺。通过 2 倍稀释法测定其最小抑菌浓度(MIC)。试验结果表明，杨树花提取液对大肠杆菌的 MIC为16 ～
64 mg /mL，对沙门菌的 MIC为 64 ～ 128 mg /mL，故其对 2 种细菌均有一定的抑制作用，但对大肠杆菌的抑
制效果优于沙门菌。
关键词 黄酮类化合物;正交试验;超声波萃取;最小抑菌浓度
中图分类号:S 816 文献标志码:A 文章编号:1002 － 2813 (2015)23 － 0055 － 04
DOI编号:10. 13557 / j. cnki. issn1002 － 2813. 2015. 23. 015
杨树花为杨柳科植物毛白杨和加拿大杨或同属
树种植物的干燥雄花序，具有清热解毒和化湿止痢
的功效。临床上主要用于治疗湿热下痢，及幼畜泄
泻。杨树花中含有丰富的黄酮类化合物，其来源广
泛，成本低，使用后无残留，对生产环境无污染，
病原体不产生耐药性，符合现代动物生产的生态化
健康养殖的需要(李伟福，2005;房春林，2010)。试
验研究杨树花超声波萃取物对大肠杆菌的抗菌活
性，旨在为杨树花的综合开发利用提供理论依据和
应用基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料
杨树花，2014 年新产，产地河北，购于安国市
京源中药饮片有限公司。菌株，菌种为大肠杆菌和
沙门菌，由鸡肠道内容物分离纯化培养制备。
1.1.2 药品
无水乙醇、普通营养、伊红美蓝琼脂、麦康凯
琼脂、阿米卡星、链霉素和氯化钠注射液等，由辽
宁医学院畜牧兽医学院动物药学实验室提供。
1.1.3 仪器与设备
0 ～ 200 和 0 ～ 100 μL 微量移液枪，0. 45μm 滤
膜，FA2004N型电子天平，DHG － 9245A 型电热恒
温鼓风干燥箱，KQ － 300B 型超声波清洗器，YX －
400B不锈钢双层立式蒸发压力消毒器，DHP － 9082
型电热恒温培养箱，SW － CJ － 1F 型单人双面净化
工作台和 757 紫外可见分光光度计。
1.2 试验内容
1.2.1 杨树花黄酮类化合物的提取方法
杨树花中除含有黄酮类和酚甙类及萜烯类等活
性成分外，还含有油脂类和水杨酸等物质。杨树花
经干燥粉碎后，经乙醇浸泡后采用超声波萃取技术
进行提取，可获得具有一定药用价值的黄酮类化合
物，其提取工艺如下。
1.2.1.1 样品处理
样品采用蒸馏水清洗 2 ～ 3 次，除去泥沙、灰
尘和腐败物等杂质，置于烘箱中干燥至恒质量，于
干燥避光处保存备用。
1.2.1.2 超声波提取
称取 10. 0 g 杨树花，加入 200 mL70%乙醇浸
泡 30 min，超声波处理 150 min，将提取液浓缩保
存备用(孙波等，1999)。
1.2.2 杨树花黄酮的提取工艺优化
1.2.2.1 单因素试验
称取 10. 0 g杨树花粉末，静置浸泡 30 min，在
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超声波处理器作用下分别以不同浓度的乙醇、超声
时间、液料比和提取温度 4 个因素，按照以上提取
方法进行单因素试验，将提取液定容于 10 mL 容量
瓶中(郭孝武，2005)。
1.2.2.2 正交试验
根据单因素试验结果设计 L9(3
4)正交试验。
1.2.2.3 总黄酮含量测定
称取适量的芦丁标准品，加 75%的乙醇溶液配
制成一定浓度的芦丁标准液。吸取标准液各 0、
1. 0、2. 0、4. 0、6. 0 和 8. 0 mL 置于 25 mL 的容量
瓶中，依次加入 75%的乙醇溶液 10、9、8、6、4
和 2 mL。加入质量分数为 5%的 NaNO2溶液 1 mL，
静置 6 min;向每个容量瓶中再次分别加入 1 mL 质
量分数为 10% 的硝酸铝溶液，静置 6 min;加入
1 mol /L的 NaOH溶液 10 mL，再用 75%的乙醇溶液
定容至 25 mL 刻度，充分混合后放置 15 min，在
510 nm波长处测定吸光度。做线性回归方程，绘制标
准曲线，以吸光度 A为纵坐标，质量浓度 C(mg /mL)
为横坐标。得到标准曲线线性方程式:Y = 11. 069X +
0. 063(Ｒ2 = 0. 9958)。用 75%的乙醇溶液配制杨树
花提取物待测溶液，按 1. 2. 3 中操作进行测定，并
按照标准曲线，计算总黄酮含量(mg /g)。
1.2.3 杨树花黄酮类化合物抑菌作用的研究
1.2.3.1 培养基的制备
普通琼脂培养基:蛋白胨 10、牛肉膏 5、氯化
钠 5 和琼脂粉 15 g，蒸馏水 1 000 mL，置于烧杯中
混合并加热溶解，用 0. 1 mol /LNaOH 溶液校正 pH
至 7. 2 ～ 7. 4，加热 10 min 后过滤，将滤液分装于
三角瓶中并包装，于 121 ℃高压蒸汽灭菌 15 min，
冷却备用。
伊红美兰琼脂培养基:将蛋白胨、磷酸盐和琼
脂充分溶解于蒸馏水中，校正 pH，分装于烧瓶内
并高压蒸汽灭菌 15 min，冷却至 60 ℃，在无菌条
件下倾注于灭菌平皿中，保存备用。
麦康凯琼脂培养基:将蛋白胨、胆盐和氯化钠
溶解于 400 mL 蒸馏水中，校正 pH7. 2。琼脂 600 mL
加热溶解。将 2 液合并后分装于烧瓶内，高压蒸汽
灭菌 15 min，然后加热时溶化琼脂并趁热加入乳
糖，冷却至 50 ～ 55 ℃时加入结晶紫和中性红水溶
液，摇匀后倾注平板。
1.2.3.2 菌悬液的制备
将供试大肠杆菌和沙门菌菌种接种于营养琼脂
斜面培养基上进行活化，挑取单个菌落，接种于新
鲜营养肉汤培养基中，37 ℃培养 18 ～ 24 h 后，采
用平板菌落计数法，用肉汤稀释菌悬液质量浓度至
含菌体约 1 × 105 ～ 1 × 106 CFU / mL，于 4 ℃冰箱保
存，备用(房春林，2010)。
1.2.4 最小抑菌浓度(MIC值)的测定
1.2.4.1 药液的稀释
将 7 支试管编号，按照顺序依次放在试管架
上，向 2、3、4、5、6 和 7 号试管中分别加入 5 mL
蒸馏水。取 5 mL药液加入 1 号试管中，再取 5 mL
药液加入 2 号试管中，混匀静置。从 2 号试管中取
出 5 mL溶液放入第 3 号试管中，混匀静置，并依
次类推，直到从第 7 号试管取出 5 mL 药液后，弃
去，使各管药液质量浓度分别为原药液的 1、1 /2、
1 /4、1 /8、1 /16、1 /32 和 1 /64 备用(李笑春等，
2006;李金良等，2012)。
1.2.4.2 药液与培养基的混合及接种
在三角瓶内将不同质量浓度(1，1 /2，1 /4，1 /8，
1 /16，1 /32，1 /64)的药液与普通培养基按 1∶9 混匀，
使培养基内药液浓度分别为 1∶10，1∶20，1∶40，…，
1∶640，高压灭菌后冷却至 45 ～ 50 ℃，倾注于无菌
平皿中，待其凝固后，把 100 μL 菌液接种在琼脂
平板上，以无菌玻璃棒涂布均匀，放在 37 ℃恒温
箱中培养 24 h。观察细菌的生长情况同时作阳性和
阴性对照，每一质量浓度药液做 2 个平行并计算平
均值做为最终结果，以无细菌生长的最小药液质量
浓度作为该药物对该菌株的 MIC(王艳萍等，2012;
孙志良等，2003)。
1.3 统计学方法
用 SPASS13. 0 软件单因素方差分析 One － way
ANOVA进行组间差异的比较。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 提取时间对提取率的影响
在不改变其他提取条件的情况下，以时间为单
因素变量考察对象，观察其对杨树花总黄酮提取率
的影响。从图 1 可见:在 90 min后，曲线基本进入
平稳阶段，总黄酮提取率变化不明显。所以，试验
选择 90 ～ 150 min作为最佳提取时间。
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图 1 提取时间与黄酮得率的关系
2.1.2 提取液质量浓度与提取率的关系
从图 2 可见:控制其他提取条件不变，仅以乙
醇的质量分数为考察变量时，乙醇的质量分数越
高，杨树花总黄酮提取率越低。这也许是由于杨树
花中所含的的各黄酮类化合物在不同质量分数的乙
醇溶液中的溶解度不同而造成的总黄酮提取率间的
差异。因此，选择体积分数为 50% ～ 80%的乙醇溶
液作为最佳提取溶剂。
图 2 乙醇浓度与黄酮得率的关系
2.1.3 料液比与提取率的关系
溶剂的用量是直接影响杨树花中黄酮类化合物
提取率的重要因素之一，料液比要在确定乙醇可以
浸没原料的基础上进行筛选。从图 3 可见:黄酮得
率曲线先呈上升趋势，当原料占总溶液的比例小于
5%时，黄酮得率基本呈现变化不大的稳定趋势。
因此，试验确定取 20 倍原料到 35 倍原料的的溶
剂量。
图 3 料液比与黄酮得率的关系
2.1.4 提取温度与提取率的关系
温度可影响分子运动的频率，温度升高，分子
运动加剧，渗透、扩散和溶解速度也随之加快。同
时，高温时引起的细胞膜结构的变化，使黄酮类化
合物很容易转移到溶剂中。从图 4 可见:当温度超
过 50 ℃时，总黄酮提取率不断提高。但是，当温
度超过一定范围时，也会由于温度过高而引起提取
物的变性。因此，试验选用 60 ～ 80 ℃为最佳提取
时间。
图 4 提取温度与黄酮得率的关系
2.2 正交试验
根据单因素试验结果，制定试验因素水平表见
表 1，设计 L9(3
4)正交试验见表 2。
表 1 因素水平
水平 A温度 /℃ B时间 /min C料液比 D乙醇质量分数 /%
1
2
3
60
70
80
90
120
150
1∶20
1∶25
1∶30
50
70
80
从表 2 可见:获得 A3B3C1D1为最优组合，即温
度 70 ℃，乙醇质量分数 70%，液料比 1∶20，提取
时间 150 min。并在此条件下提取 3 次平行试验。
计算其平均黄酮得率，结果见表 3。
表 2 L9(3
4)正交试验
试验号 A B C D
吸光度
(A)
得率 /
%
提取
率 /%
吸光度
1 1 1 1 1 0. 668 2. 73 14. 23
2 1 2 2 2 0. 673 2. 75 71. 25
3 1 3 3 3 0. 513 2 35. 54
4 2 1 2 3 0. 551 2. 2 18. 46
5 2 2 3 1 0. 632 2. 57 43. 98
6 2 3 1 2 0. 712 1. 17 11. 09
7 3 1 3 2 0. 726 2. 99 31. 92
8 3 2 1 3 0. 584 2. 35 9. 95
9 3 3 2 1 0. 708 2. 91 20. 96
得率
K1 1. 854 1. 945 1. 964 2. 008
K2 1. 895 1. 889 1. 932 2. 111
K3 2. 018 1. 933 1. 871 1. 648
Ｒ 0. 164 0. 056 0. 093 0. 463
K1 7. 48 7. 92 6. 25 8. 21
K2 5. 94 7. 67 7. 86 6. 91
K3 8. 25 6. 08 7. 56 6. 55
Ｒ 2. 31 1. 84 1. 61 1. 66
提取率
K1 121. 02 64. 61 35. 27 79. 17
K2 73. 53 125. 18 110. 67 114. 26
K3 62. 83 67. 59 111. 44 63. 95
Ｒ 58. 19 60. 57 76. 17 50. 31
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2.3 杨树花黄酮类化合物 MIC的测定
杨树花提取液对于大肠杆菌和沙门菌有明显的
抑菌作用，MIC值分别为大肠杆菌 16 ～ 64 mg /mL，
沙门菌 64 ～ 128 mg /mL。试验表明，杨树花提取液
对于沙门菌的抑制效果相对较弱，对大肠杆菌抑菌
效果更佳。
表 3 A3B3C1D1下黄酮得率
试验 1 2 3 平均值
黄酮得率 /% 2. 60 2. 59 2. 62 2. 60
为进一步确定优化条件，试验选择极差分析得
到最优配合条件进行提取黄酮类化合物的提取，经
检测其提取物的黄酮得率为 2. 65%，将此提取物于
－ 4 ℃冰箱中保存，留作杨树花黄酮类化合物 MIC
的测定试验应用。
3 讨论
3.1 关于杨树花超声波萃取工艺的优化
试验经单因素试验结果，设计正交试验对杨树
花的超声波萃取技术进行优化，有效地提高杨树花
黄酮的提取率，快速省时，精确，对活性成分的生
理活性影响较小，可将其用于杨树花黄酮类成分的
提取之中，并加以推广应用。
3.2 关于杨树花超声波提取物的抑菌作用
采用 MIC测定法研究杨树花提取液对大肠杆菌
和沙门菌的体外抑菌作用。试验结果表明杨树花总
黄酮对大肠杆菌和沙门菌均有一定的抑制作用，其
中对大肠杆菌的抑制作用更为明显，对沙门菌的抑
制作用相对较弱。王艳萍等(2011)研究表明，杨树
花作为传统中药的一种，且在很多实践工作中已经
为人们所认识，杨树花除本身的抑菌效果以外还能
对动物机体的免疫系统产生促进和增强的作用，因
此试验为杨树花的开发利用提供了新的试验数据。
试验采用超声波技术萃取后，在测定 MIC 时，药液
均需要加热，故导致其部分蒸发。试验中进行高压
灭菌，但高压可能会使某些黄酮成分的药理活性降
低，加热煮沸也可能造成其药物有效成分被破坏，
从而导致药物的 MIC值偏高，这些原因可能会造成
一定的试验误差，在今后的研究中有待于进一步
改进。
3.3 关于杨树花超声波萃取物的研究展望
试验的体外抑菌试验效果没有预计的理想，可
能由于试验条件不完善导致。董发明等(2007)及房
春林等(2010)研究表明，杨树花除了本身的抑菌效
果以外，还具有很好的抗氧化作用和对动物机体免
疫系统的促进和增强作用，要对此进一步验证还需
要更加深入的研究。
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通信地址:辽宁省锦州市古塔区人民街五段 48
号 121001