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第14卷第1期
2012年2月
安顺学院学报
JOURNAL OF ANSHUN UNIVERSITY
Vol.14 No.1
Feb.2012
收稿日期:2011-06-28
基金项目:国家自然科学基金 (81102796);贵州省教育厅自然科学研究项目 (黔教科2005224)。
作者简介:张来 (1977.07~),安顺学院化学与生物农学系副教授,博士。研究方向:药用植物基因工程与代谢。
贵州矮杨梅叶总黄酮的提取工艺和测定方法
张 来1 杨碧昌2 刘 宁3
(1.安顺学院化学与生物农学系,贵州 安顺561000)
(2.安顺学院附属中学,贵州 安顺561000)
(3.贵州师范大学,贵州 贵阳550001)
摘 要:目的:建立矮杨梅叶总黄酮的提取工艺和含量测定方法。方法:利用L9 (34)进行
矮杨梅叶总黄酮提取影响因素即乙醇浓度、提取时间、料液比的优化组合;应用分光光度计考
察其含量测定方法。结果:矮杨梅叶总黄酮的提取工艺为提取时间为1.5h,乙醇浓度为
50%,材液比为1:35,提取率为4.88%;总黄酮提取液在0-60min内测定,线性关系良好
(0.9996),仪器较为稳定,测定结果准确、重现性好,回收率高。结论:矮杨梅叶总黄酮的提
取工艺可行、测定方法可信。这一研究结果对于杨梅属植物中总黄酮的提取和测定具有可操作
性和推广应用价值。
关键词:矮杨梅叶;总黄酮;提取工艺;测定方法
中图分类号:R283.6 文献标识码:A 文章编号:1673-9507(2012)01-0125-04
矮杨梅 (Myrica nana Cheval.)隶属杨梅科杨梅
属植物[1],自然分布于我国西部部分省区,生长于
海拔1500-3500m的山坡、林缘及灌木丛中。矮杨
梅是生态幅狭窄物种,为我国特有,经济价值极高
的植物,特别在药用方面具有较大的开发应用价值。
矮杨梅根皮、茎皮、叶和果实在民间早为药用,有
治疗痢疾、腹泻、消化不良、直肠出血、脱肛、风
湿痛等疗效[2-4]。近些年有不少关于矮杨梅综合开
发利用的研究报道[5-13],其中涉及该物种黄酮类化
合物的研究主要有[14-20]:刘昆云、陈善信在对矮杨
梅根的生药学理化实验中发现,其内含有丰富的黄
酮类化合物;文旭从矮杨梅根中分离出多种黄酮类
化合物,经鉴定含量最高的一类为黄酮醇类的杨梅
素甙;刘宁、乙引、陈蓉蓉等通过高效液相色谱法,
测定了矮杨梅叶中黄酮醇类的芦丁和槲皮素含量;
并通过抑菌实验证实,矮杨梅叶有很强的抗金黄色
葡萄球菌、志贺氏痢疾的作用;周志宏、杨崇仁从
矮杨梅鲜叶中分离出10种酚性化合物,指出黄酮类
化合物为其主要成分,其中以黄酮醇类的杨梅素为
其代表性物质;孙文基、绳金房[21]在所著书中记载
了杨梅素有抗菌、抗癌、抑酶等作用。这些资料表
明,矮杨梅植物具有可开发利用的黄酮类化合物,
值得深入研究;但同时也指出,矮杨梅植物叶中黄
酮类化合物的提取工艺未见报道。因此,研究拟通
过对野生矮杨梅叶中总黄酮的提取工艺进行研究,
同时建立其含量测定方法,旨为发掘黄酮类物质新
的植物资源、为矮杨梅生理生化研究及药用资源开
发利用提供理论依据和新资料。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
UV755B型紫外可见光分光光度计 (北京普析
通用器设备有限公司),AR-201型电子分析天平,
DK-98-I型电子恒温水浴加热器,德国eppendorf
Research移液器,瑞士BUCHIR-200旋转蒸发仪,
粉碎机,恒温鼓风干燥箱。芦丁对照品 (0080-
9705) (中国药品检验所),乙醇,盐酸、硝酸铝、
氢氧化钠、亚硝酸钠等试剂均为分析纯。
1.2 实验材料
实验材料来至贵州省六盘水市水城县杨梅杨乡
法尔村。随机选取株高1m、冠幅1m×1.5m左右的
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矮杨梅5株。分别于当年9月下旬 (营养期)、当年
12月下旬 (孕花期)、次年3月中旬 (盛花期)、次
年6月下旬 (果期)4个不同生育期进行采集。茎
取自植株东、南、西、北四个方位的上、中、下三
个部位;叶取自所取枝条的4-7位功能叶。样品用
水清洗,用蒸溜水漂洗2-3次,晾干后于105℃的
烘箱中15~20分钟,再在65℃条件下烘干至恒重。
将样品粉碎过40目细筛,保存备用。
1.3 实验方法
1.3.1 总黄酮的提取 根据笔者的单因素预试
验结果,得出影响矮杨梅叶总黄酮提取率的主要因
素有材液比 (g/mL)、时间 (h)、乙醇浓度 (%)。
因此,以L9 (34)正交表进行正交试验,其中以矮
杨梅叶粉碎样品4.000g、提取次数2次为固定因
素,以乙醇浓度、提取时间、料液比为可变因素作
正交试验设计。提取液方法采用超声波提取[22]。
1.3.2 对照品与供试品溶液的配制 精确称取
105℃干燥的芦丁对照品10.000mg,用95%乙醇溶
解,摇匀,定容至10mL,配制成1mg/mL的芦丁
对照品溶液。取矮杨梅叶总黄酮提取物,用相同乙
醇浓度定容于100mL容量瓶中,再精密量取0.5mL
于10mL的容量瓶中,定容至刻度获得供试样品液。
1.3.3 总黄酮的含量测定和计算 取制备好的
供试样品液,分别置分光光度计510nm波长处测定
吸光度值。以芦丁回归方程计算供试液中总黄酮的
浓度,用公式 M (%)= [(V×N×X)/ (W×
1000)]×100%[23]计算其百分含量。式中,M-样
品总黄酮百分含量,V-原提取液体积 (mL),N-
稀释倍数,X-提取液中总黄酮浓度 (mg/mL),W
-矮杨梅叶粉末质量 (g)。
2 结果与讨论
2.1 线性关系考察
精密量取芦丁对照品溶液0、0.1、0.2、0.3、
0.4、0.5、0.6mL分别于10mL容量瓶中,分别加
蒸馏水2.5mL,加5% NaNO2溶液0.5mL后,再
加10% Al(NO3)3溶液0.5mL,混合均匀后放置
5min,加入5% NaOH 溶液2.5mL,摇匀,放置
5min后,用蒸馏水定容至刻度。在波长510nm处测
吸光度值。以波长为横坐标、吸光度值为纵坐标作
曲线。线性回归方程Y=8.5257X-0.0184,Y吸光
度值,X为芦丁含量 (mg),相关系数R=0.9996。
2.2 稳定性考察
精密量取0.5mL的芦丁对照品溶液和矮杨梅测
试样品 (叶)溶液各1份,按2.1方法加入显色试
剂,在 0,10min,20min,30min,40min,50min,
60min时测定吸光度值,计算平均值、SD和RSD。
结果显示,芦丁标准样品与矮杨梅叶供试样品溶液
加显色剂后,在0~60min范围内测定,吸光度基本
不变,标准偏差和相对标准偏差分别是1.73×10-3
(1.9×10-3)和0.43 (0.60),均较小,说明芦丁
对照样品与矮杨梅测试样品显色较稳定。
2.3 精密度考察
精密量取芦丁标样溶液0.5mL,按2.1方法加
入显色试剂。连续测定5次,计算平均值、标准偏
差 (SD)、相对标准偏差 (RSD)。结果显示,吸光
度值在0.230-0.232之间波动,平均值为0.232,
标准偏差 (SD=8.36×10-4)和相对标准偏差
(RSD=0.36)较小,表明仪器精密度良好。
2.4 重复性考察
精密量取0.5mL芦丁溶液5份,每份分别按
2.1方法加入显色试剂。用分光光度计,在波长
510nm处测吸光度值,计算平均值、SD、RSD。结
果显示,芦丁吸光度的SD为1.402×10-3,RSD为
0.34,二者均较小,说明该仪器测定结果重现性好,
所得数据精确。
2.5 加样回收率考察
精密量取5份供试样品预实验含量为0.029mg/
mL的提取液,各加入芦丁对照品溶液,按2.1方法
加入显色试剂,置分光光度计波长510nm处测吸光
度值 (A),计算RSD值和平均回收率。结果 (1)
显示,供试样品平均加样回收率为100.3%,RSD为
2.13%,说明该方法偏差小,回收率高。
表1 加样回收率试验
样品号
(No)
总黄酮
含量
(mg)
芦丁加
入量
(mg)
测定量
(mg)
回收率
(%)
平均回
收率
(%)
RSD
(%)
1 0.029 2.5 2.511 99.28
2 0.029 2.0 2.033 100.20
3 0.029 1.5 1.535 100.40 100.30 2.13
4 0.029 1.0 1.032 100.30
5 0.029 0.5 0.536 101.40
2.6 总黄酮的提取工艺
表2的极差R值可以看出,三个因素对叶中总
黄酮提取效果的主次顺序依次为材液比>提取时间
>乙醇浓度;提取时间所对应的K值最大为K2=
11.8,乙醇浓度所对应的 K值最大为 K1=11.62,
材液比所对应的K值最大为K3=11.7。因此,矮杨
梅叶中总黄酮的提取条件为A2B1C3,即提取时间为
1.5h,乙醇浓度为50% ,材液比为1:35。矮杨梅
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安顺学院学报 2012年第1期
叶中总黄酮提取工艺结果方差分析 (表3)指出,
提取时间、乙醇浓度、材液比对矮杨梅叶中总黄酮
提取率的影响均达到极显著水平 (F﹥F0.01 (2,
9)=8.02);从F值也可以看出,影响矮杨梅叶总
黄酮提取的主次因数依次是材液比、提取时间和乙
醇浓度,这一结果与极差值 (R)的分析完全吻合。
根据所筛选出来的最佳工艺参数,按照提取方法进
行工艺验证,即材液比为1:35,乙醇浓度为50%,
提取时间为1.5h,结果矮杨梅叶中总黄酮的提取率
为4.88%,高于正交试验中的任何一个试验组合,
从而验证了该工艺的合理性和科学系性。
表2 矮杨梅叶中总黄酮提取正交试验结果分析
实验号 (No) A (时间/h)B (浓度/%)
C (材液比
/g/mL)
D (误差)
吸光度
(OD)
浓度 (mg/mL)提取率 (%)
1 1 50 1:20 1 0.299 0.037 2.96
2 1 75 1:30 2 0.231 0.0293.48
3 1 95 1:35 3 0.177 0.023 3.22
4 1.5 50 1:30 3 0.287 0.036 4.32
5 1.5 75 1:35 1 0.237 0.030 4.20
6 1.5 95 1:20 2 0.328 0.041 3.28
7 2 50 1:35 2 0.248 0.031 4.34
8 2 75 1:20 3 0.343 0.042 3.36
9 2 95 1:30 1 0.238 0.030 3.60
K1 9.66 11.62 9.60 10.7
K2 11.80 11.04 11.40 11.10
K3 11.30 10.10 11.76 10.90
R 0.713 0.507 0.720 0.113
表3 正交试验结果方差分析
方差来源 离均差平方和 自由度 均 方 F F0.01 F0.05
提取时间 0.8355 2 0.4178 30.72
乙醇浓度 0.4643 2 0.2322 17.07 8.02 4.26
材 液 比 0.8928 2 0.4464 32.82
误 差 0.0271 2 0.0136
3 结论
采用超声波乙醇提取矮杨梅叶中总黄酮。正交
试验得出影响总黄酮提取效果诸因素的主次关系依
次为材液比、提取时间、乙醇浓度;矮杨梅叶中总
黄酮优化提取条件是A2B1C3,即提取时间为1.5h,
乙醇浓度为50% ,材液比为1:35。根据此提取工
艺得出矮杨梅叶中总黄酮的提取率为4.88%。用分
光光度法对矮杨梅叶总黄酮提取液进行测定,其线
性回归方程为Y=8.5257X-0.0184,相关系数R=
0.9996,在0-60min内测定,测定结果准确、重现
性好,回收率高。与目前行内公认,植物中只要含
有1.5%的黄酮类化合物就有开发利用价值一说,
笔者认为矮杨梅应属于具有开发利用该类物质的新
植物资源。同时矮杨梅叶中总黄酮的提取工艺和测
定方法对于杨梅属植物总黄酮物质的提取和含量测
定具有一定的可操作性和推广应用价值。
参考文献:
[1]中国高等植物图鉴编委·中国高等植物图鉴[M].北
京:科技出版社.1972:374.
[2]江苏新医学院·中药大辞典(下册)[M].上海:上海
人民出版社,2490.
[3]贵州省中医研究所·贵州中草药名录[M].贵阳:贵
州人民出版社,1988:78-79.
[4]贵州省中药普查办公室,贵州省中医研究所·贵州
中药资源[M].北京:中国医药科技出版社,1996:637.
[5]张喜焕,刘宁·种类型矮杨梅花粉形态扫描电镜观
察[J].贵州师范大学学报(自然科学版),2005(2):6-9.
[6]刘娅·矮杨梅的光合作用及耐荫性研究[J].贵阳学
·721·
安顺学院学报 2012年第1期
院学报(自然科学版)(季刊),2008(2):26-31.
[7]刘宁,林铁·矮杨梅叶挥发油GC-MS分析[J].中
国实验方剂学杂志,2004(6):14-16.
[8]刘宁,李正芬·贵州野生植物矮杨梅种质资源研究
[J].种子,2004(8):80-82.
[9]谢小波,求盈盈等·杨梅种间杂交及杂种F1的胚培
养[J].果树学报2009(4):507-510.
[10]刘宁,李正芬·矮杨梅茎的生药学研究[J].贵州师
范大学学报(自然科学版),2004(2):10-12.
[11]张喜焕,刘宁等·杨梅属两种植物光合特性对CO2
浓度升高响应的比较研究[J].贵州科学,2006(2):71-75.
[12]董丽萍,杨宗金等·大理州野生矮杨梅生物学特性
及驯化栽培研究[J].林业调查规划,2004(3):116-119.
[13]张来,刘宁等·贵州西部杨梅属植物的民族植物学
研究[J].安顺学院学报2006(3):97-100.
[14]刘昆云,陈善信·民族药杨梅根的生药鉴定[J].中
国民族民间医药杂志,1999(20):35-38.
[15]文旭·云南民间药矮杨梅根的化学成分研究[J].中
国民族民间医药志,1997(26):39-41.
[16]刘宁,陈蓉蓉·矮杨梅叶中的芦丁含量[J].贵阳中
医学院学报,1997(4):57.
[17]刘宁,乙引·矮杨梅槲皮素的种内差异[J].贵州师
范大学学报,2000(4):37-38.
[18]乙引,刘宁·不同类型矮杨梅叶中槲皮素含量比较
[J].资源与环境学报,2000(3):59-60.
[19]周志宏,杨崇仁·矮杨梅叶的酚性化学成分[J].云
南植物研究,2000(2):219-224.
[20]刘宁,陈蓉蓉等·矮杨梅叶的抑菌作用研究[J].贵
州师范大学学报,1998(1):1-3.
[21]孙文基,绳金房·天然活性成分简明手册[M].北
京:中国医药科技出版社,1996:894.
[22]史艳财,韦记青等·战骨总黄酮提取工艺及不同部
位含量测定研究[J].广西师范大学学报(自然科学版),2010
(2):57-60.
[23]姜秀娟,唐金成等·可见分光光度法测定刺山柑花
蕾中总黄酮含量[J].2010(18):252-254.
Extrating Crafts and Assay Method of Total Flavonoids in the Leaf of
Myrica Nana in Guizhou
Zhang Lai 1 Yang Bichang2 Liu Ning3
(1.Department of Chemistry Biology and Agrical ture,Department,Anshun University,Anshun561000,Guizhou,
China)
(2.Afiliated middle school,Anshun University,Anshun561000,Guizhou,China)
(3.Guizhou Normal University,Guiyang550001,Guizhou,China)
Abstract:Objective:Establish the extrating crafts and assay method of total flavonoids in the leaf about M.
nana.Method:Optimized the factors of total flavonoids extrating crafts that ethanol concentration,extracting
time and solid-liquid ratio by L9(34)orthogonal table.Examined its method of determination by spectrophotome-
ter.Result:the extrating crafts as folows:ratio of material to solvent was 1:35,extracting time was 1.5h,eth-
anol concentration was 50%;extracting rate was 4.88%.In the course of 0-60min,the linear relationship of assay
method was good(0.9996),the instrument was more stable,the result was accurate,the reproducibility and re-
covery was high.Conclusion:The extracting technology was feasible and operable,it was important application
value for the extraction of total flavonoids in Myrica plants.
Key words:leaf of M.nana;total flavonoids;extrating crafts;assay method
(责任编辑:王德红)
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