全 文 ：资源开发与利用
饲料研究 ＦＥＥＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＮＯ． １４，２０１６ ５１
收稿日期：２０１６ － ０４ － ０７
基金项目：２０１４年辽宁省大学生创新创业训练计划资助项目
（２０１４１０１６００３８）
第一作者：李丽，硕士，教授，研究方向为兽医药理毒理与新
兽药研发。
杨树花超声波提取物的抗氧化作用
李 丽 周平和 王金莉
锦州医科大学畜牧兽医学院，辽宁锦州 １２１００１
摘 要 以杨树花超声波提取物为研究对象，探讨其抗氧化活性。采用二苯代苦味酰基（ＤＰＰＨ）法、邻
苯三酚法和甲基紫－ Ｆｅ２ ＋ － Ｈ２Ｏ２ 反应体系联合分光光度计法对杨树花３种提取物的抗氧化活性进行测定。３
种杨树花提取物均对ＤＰＰＨ自由基、羟基自由基（·ＯＨ）和超氧阴离子自由基（·Ｏ２ －）具有一定的清除作用，
并且呈现出一定的剂量效应，杨树花超声波提取物的抗氧化活性高于维生素Ｅ，低于维生素Ｃ，杨树花超声
波提取物的抗氧化能力高于杨树花水提物和醇提物。杨树花黄酮类提取物具有很强的抗氧化活性，且在各种
提取方法中，超声波提取物抗氧化能力最强。
关键词 杨树花；黄酮类化合物；超声波提取；抗氧化
中图分类号：Ｓ ８１６ ３２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２ － ２８１３ （２０１６）１４ － ００５１ － ０５
ＤＯＩ编号：１０ １３５５７ ／ ｊ ｃｎｋｉ ｉｓｓｎ１００２ － ２８１３ ２０１６ １４ ０１２
杨树花为杨柳科植物毛白杨、加拿大杨或同属
种植物的干燥雄花序。从杨树花中提取出黄酮类化
合物、多糖类化合物、有机酸类、多种氨基酸和生
物碱等成分。除此之外，杨树花还含有丰富的维生
素、无机盐、多种矿物质和微量元素，这些物质都
具有很高的营养及药用价值［１］。杨树花黄酮类化合
物的药理作用包括调脂、抗氧化、清除自由基、抗
菌、抗肿瘤及对中枢神经系统等的作用［２］。试验对
杨树花超声波提取物抗氧化作用进行研究，为杨树
花及其制剂在动物生产中合理应用提供理论依据。
１ 材料与方法
１１ 试验材料
１１１ 主要药品及试剂
杨树花雄花序，２０１４年５月采集于辽宁省锦州
市锦州医科大学校园。
无水乙醇、二苯代苦味酰基（ＤＰＰＨ）、Ｔｒｉｓ －
ＨＣｌ缓冲液（ｐＨ ＝ ８ ２）、邻苯三酚、铁氰化钾、三
氯乙酸、氯化铁和氯化亚铁（所有试剂均为分析纯）
由锦州医科大学畜牧兽医学院动物药学实验室
提供。
１１２ 主要试验仪器
１００ ｍＬ量筒瓶、１００ ｍＬ量筒、１００ ｍＬ及５００ ｍＬ
烧杯、平皿、试管、酒精灯、接菌环、玻璃棒、
０ ～ ２００ μＬ及０ ～ １００ μＬ微量移液枪、０ ４５ μｍ滤
膜、ＦＡ２００４Ｎ型电子天平、ＤＨＧ － ９２４５Ａ型电热恒
温鼓风干燥箱、ＫＱ － ３００Ｂ型超声波清洗器、ＹＸ －
４００Ｂ不锈钢双层立式蒸发压力消毒器及７５７紫外分
光光度计，由锦州医科大学畜牧兽医学院动物药学
实验室提供。
１２ 试验方法
１２１ 杨树花提取物的制备
采用文献［３］中方法，制备杨树花超声波提取
物，备用。
１２２ ＤＰＰＨ自由基的清除试验
分别配制不同质量浓度的３种杨树花提取物及
对照组维生素Ｃ和维生素Ｅ溶液。准确称取１２ ｍｇ
ＤＰＰＨ粉末于棕色瓶中加入１８０ ｍＬ无水乙醇，超声
资源开发与利用
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震荡５ ｍｉｎ后５１９ ｎｍ处测定吸光度Ａ（Ａ ＝ １ ２ ～
１ ３）。取６支具塞试管，分别加入２ ｍＬ ＤＰＰＨ溶
液，再向其中分别加入０、２、４、６、８和１０ μＬ的
杨树花提取物，用无水乙醇定容至３ ｍＬ，混合均
匀，避光反应３０ ｍｉｎ 后，５１９ ｎｍ 处测定吸光度。
其中加样量为０的溶液吸光度为Ａ０，其余样液吸光
度为Ａ，二者均以无水乙醇为参比溶液。清除率公
式Ｓ ／ ％ ＝（Ａ０ －Ａ）÷Ａ０ ×１００，以样品溶液质量浓度为
横坐标，清除率为纵坐标，绘制清除率曲线［４ －６］。
１２３ 羟基自由基（·ＯＨ）清除试验
分别配制不同质量浓度的３种提取物及对照组
维生素Ｃ和维生素Ｅ溶液，分别取各浓度样品溶液
１ ｍＬ加入１０ ｍＬ试管中，向各试管中依次分别加入
相同体积甲基紫溶液０ １４ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 和Ｆｅ２ ＋ 溶液
０ ０１ ｍｏｌ ／ Ｌ和Ｈ２Ｏ２（１％）溶液１ ００ ｍＬ，调节ｐＨ ＝
４ ７，加蒸馏水定容，摇匀，常温放置３０ ｍｉｎ，５７８ ｎｍ
处测定吸光度为ＡＳ，以蒸馏水代替样品溶液测定吸
光度Ａ０，取１ ｍＬ甲基紫溶液加入试管中，加入蒸
馏水定容至１０ ｍＬ，５７８ ｎｍ测定吸光度Ａ。清除率
公式Ｓ ／ ％ ＝（Ａｓ － Ａ０）÷（Ａ 5 Ａ０）× １００，以样品溶
液质量浓度为横坐标，清除率为纵坐标，绘制清除
率曲线［７ － ９］。
１２４ 超氧阴离子（·Ｏ２ －）的清除试验
分别配制不同质量浓度的３种黄酮溶液及对照组
维生素Ｃ和维生素Ｅ溶液，配制浓度为０ ０５ ｍｏｌ ／ ｍＬ
的Ｔｒｉｓ － ＨＣｌ缓冲溶液（ｐＨ ＝ ８ ２），分别取４ ５ ｍＬ
加入５个具塞刻度试管中，置于２５ ℃水浴锅中放
置２０ ｍｉｎ。再取样品溶液１、２、３、４和５ ｍＬ于５
支试管中，加蒸馏水至５ ｍＬ。配制３０ ｍｍｏｌ ／ ｍＬ的
邻苯三酚溶液和１０ ｍｍｏｌ ／ ｍＬ的ＨＣｌ溶液［２２］。向５
个具塞试管中分别加入不同浓度的样品溶液和
０ ４ ｍＬ的邻苯三酚溶液，摇匀，置于２５ ℃水浴锅
中３ ｍｉｎ后，取出，向各个试管加入１ ｍＬ的稀盐酸
溶液终止反应，３２０ ｎｍ处测定吸光度Ａ１，以蒸馏水代替样品溶液测定对照组吸光度Ａ０。清除率公式
Ｓ ／ ％ ＝（Ａ０ － Ａ１）÷ Ａ０ × １００，以样品溶液质量浓度
为横坐标，清除率为纵坐标，绘制清除率曲线［１０］。
２ 结果与分析
２１ ＤＰＰＨ自由基的清除试验
ＤＰＰＨ自由基是一种能在有机溶剂中稳定存在
的有机自由基。在避光条件下，其乙醇溶液呈现紫
色，５１７ ｎｍ处有最大吸收峰。向溶液中加入抗氧化
剂，可与自由基中的孤电子对结合而中和掉溶液中
的ＤＰＰＨ，从而使溶液的吸光度降低甚至消失。试
验以杨树花提取物对ＤＰＰＨ自由基的清除率来评价
其抗氧化活性的能力。
从图１可见：杨树花３种提取物及维生素Ｃ和
维生素Ｅ均可明显地清除ＤＰＰＨ自由基。维生素Ｃ
的清除能力最强，杨树花超声波提取物次之，约为
杨树花水提物的４倍。随着样品质量浓度的升高，
清除率也升高。从表１可见：ＩＣ５０值的排列顺序为
维生素Ｃ ＜杨树花超声波提取物＜维生素Ｅ ＜杨树
花醇提物＜杨树花水提物。ＩＣ５０值越小则代表样品
的抗氧化能力越大，因此，除了维生素Ｃ以外，杨
树花超声波提取物的抗氧化活性最强。
图１ ＤＰＰＨ自由基清除试验
２２ 羟基自由基（·ＯＨ）清除试验
杨树花提取物对芬顿（Ｆｅｎｔｏｎ）反应过程中产生
的羟基自由基（·ＯＨ）的清除率，研究杨树花提取
物的抗氧化活性。Ｆｅｎｔｏｎ反应是指在酸性条件下，
Ｈ２Ｏ２ 和Ｆｅ２ ＋反应生成羟基自由基（·ＯＨ），羟自由
表１ ３种杨树花提取物及维生素Ｃ和维生素Ｅ的ＩＣ５０ μｇ ／ ｍＬ
样品 维生素Ｅ 维生素Ｃ 超声波提取物 水提物 醇提物
ＩＣ５０ ０ ６１０ ± ０ ００７ｂ ０ ３４０ ± ０ ０２２ｃ ０ ４５０ ± ０ ０１８ｂ １ ９４０ ± ０ ０２９ａ １ ３１０ ± ０ ０１４ａ
注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（Ｐ ＜ ０ ０５），肩标不同大写字母表示差异极显著（Ｐ ＜ ０ ０１），肩标相同小写字母或无肩标表示差异不
显著（Ｐ ＞ ０ ０５）。
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饲料研究 ＦＥＥＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＮＯ． １４，２０１６ ５３
基（·ＯＨ）具有强氧化活性，与甲紫中高电子云密
度－ Ｃ ＝ Ｃ －基团发生加成反应，进而使甲基紫褪
色。向溶液中加入抗氧化物质可反应掉相应的羟基
自由基（·ＯＨ），通过溶液吸光度的变化来间接测
定抗氧化活性物质的羟基自由基（·ＯＨ）清除率。
从图２可见：以维生素Ｃ和维生素Ｅ为对照，
杨树花超声波提取物、醇提物和水提物均有一定的
清除羟基自由基（·ＯＨ）的能力，且均低于维生素
Ｃ的抑制效果，证明维生素Ｃ具有极强的抗氧化活
性。维生素Ｃ和杨树花超声波提取物虽具备一定清
除作用，但作用不强，维生素Ｅ、杨树花水提物和
醇提物几乎没有清除作用。当质量浓度为０ ５０ ｍｇ ／ ｍＬ
时，维生素Ｅ表现出一定的清除作用，但清除作用
仍然较弱，而杨树花水提物和醇提物仍无清除作
用。当质量浓度提高到１ ００和２ ００ ｍｇ ／ ｍＬ时，清
除率变化十分明显，并且清除率随着样品剂量的加
大而升高。除维生素Ｃ以外，当样品的质量浓度为
４ ００ ｍｇ ／ ｍｌ 时，杨树花超声波提取物的清除率
（８５ ２７％ ± １ １５％）显著高于维生素Ｅ（５８ ３７％ ±
１ ０６ ％）、杨树花醇提物（３７ ６６％ ± ０ ９６％）和水
提物（１４ ５４％ ± ０ １８％）的消除率（Ｐ ＜ ０ ０５）。各
质量浓度间的统计学分析结果见表２。
图２ 羟基自由基（·ＯＨ）清除试验
２３ 超氧阴离子（·Ｏ２ －）的清除试验
邻苯三酚法是清除超氧阴离子（·Ｏ２ －）试验方
法中最常见的一种。邻苯三酚溶液无色透明，向溶
液中加入碱性缓冲液（ｐＨ ＝ ８ ２），邻苯三酚发生自
氧反应释放超氧阴离子自由基（·Ｏ２ －），反应过程
中不断产生有色中间产物使溶液颜色变黄，３２５ ｎｍ
处有特征吸收峰。溶液中如存在抑制剂可清除掉超
氧阴离子自由基（·Ｏ２ －），从而抑制中间产物的积
累使溶液的吸光度降低，在一定时间内向溶液中加
入稀盐酸终止反应。试验根据杨树花提取物对邻苯
三酚自氧反应的抑制效果来评价其抗氧化性，以杨
树花提取物对超氧阴离子自由基（·Ｏ２ －）的清除率
来评价其抗氧化活性的能力。
从表３和图３可见：５个样品均有抑制超氧阴
离子自由基（·Ｏ２ －）的作用，均低于维生素Ｃ的抑
制效果。当杨树花质量浓度为０ ２５ ｍｇ ／ ｍＬ时，维
生素Ｃ、维生素Ｅ和杨树花超声波提取物虽具备一
定清除超氧阴离子自由基作用，但作用不强，杨树
花水提物和醇提物几乎没有清除作用。当质量浓度
为０ ５０ ｍｇ ／ ｍＬ时，醇提物表现出了一定的清除作
用，但清除作用仍然较弱。当质量浓度提高到
１ ００ ｍｇ ／ ｍＬ时，清除率变化比较明显，并且清除率
随着样品剂量的加大而升高。除维生素Ｃ以外，在
质量浓度提高为２ ００ ｍｇ ／ ｍＬ时，杨树花超声波提
取物的抑制率达到（７８ ３３％ ± １ １１％），接下来依
次是维生素Ｅ（６７ ７０％ ± １ ０８％），杨树花醇提物
（２６ ８８％ ±０ ８４％）和水提物（１７ ３５％ ±０ ７１％）。当质
量浓度为４ ００ ｍｇ ／ ｍＬ时，各组超氧阴离子自由基（·
Ｏ２ －）清除率又有了很大的提高。结果表明，除维生素
Ｃ之外，杨树花超声波提取物的抗氧化活性仍然是最
强的。各质量浓度间的统计学分析结果见表３。
表２ 羟基自由基（·ＯＨ）清除率 ％
质量浓度／
（ｍｇ·ｍＬ －１） 维生素Ｃ 维生素Ｅ
杨树花超声波提取物 杨树花水提物 杨树花醇提物
０ ２５ ２４ ４４ ± ０ ０７ ０ ８ ５４ ± ０ ７２ ０ ０
０ ５０ ３７ １５ ± ０ １１ ３ ７８ ± ０ ０１ ９ ９９ ± ０ ３８ ０ ０
１ ００ ９７ ３２ ± ０ ４５Ａ １１ ６５ ± ０ ０４Ｂａ １５ １２ ± ０ ０８Ｂａ ３ ７５ ± ０ １１Ｂｂ ８ ７７ ± ０ ７４Ｂｂ
２ ００ ９７ ６３ ± ０ ０７Ａ ２７ ２７ ± ０ ０７Ｂａ ３３ ３８ ± ０ ０７Ｂａ ７ ５７ ± ０ ２０Ｃ １８ ６８ ± ０ ７７Ｂｂ
４ ００ ９８ ２８ ± ０ １９Ａａ ５８ ３７ ± １ ０６Ｃ ８５ ２７ ± １ １５ＡＢｂ １４ ５４ ± ０ １８Ｅ ３７ ６６ ± ０ ９６Ｄ
注同表１。
资源开发与利用
５４ 饲料研究 ＦＥＥＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＮＯ． １４，２０１６
表３ 超氧阴离子自由基（·Ｏ２ －）清除率 ％
质量浓度／（ｍｇ·ｍＬ －１） 维生素Ｃ 维生素Ｅ 杨树花超声波提取物 杨树花水提物 杨树花醇提物
０ ２５ ７５ ２４ ± ０ ９５ １ ９１ ± ０ ２１ ９ ５０ ± ０ ３２ ０ ０
０ ５０ ９８ ２８ ± １ ５２ １１ ８８ ± １ ０８ １９ １２ ± １ ０８ ０ ５ ９１ ± ０ ８１
１ ００ ９８ ６５ ± ０ ８５Ａ ３２ ３２ ± １ ０６Ｂ ３７ ６６ ± １ ４４Ｂ ３ ４８ ± ０ ３６Ｃｂ １１ ６３ ± ０ ７２Ｃａ
２ ００ ９８ ２５ ± ０ ７２Ａａ ６７ ７０ ± １ ０８Ｃ ７８ ３３ ± １ １１Ｂ １７ ３５ ± ０ ７１Ｅ ２６ ８８ ± ０ ８４Ｄ
４ ００ ９８ ９８ ± ０ ２３Ａａ ８３ ６５ ± １ ００Ａｂ ８９ １８ ± ０ ８５Ａｂ ３６ ６７ ± ２ ００Ｃｄ ４４ ２７ ± １ ４３Ｃｃ
注同表１。
图３ 超氧阴离子自由基（·Ｏ２ －）清除试验
３ 讨论
研究采用不同的自由基体系对杨树花总黄酮类
提取物的体外抗氧化性进行较为全面的研究，从试
验结果可看出，杨树花总黄酮类提取物对超氧阴离
子自由基（·Ｏ２ －）及羟基自由基（·ＯＨ）均有不同
程度的清除作用，其机制还需进一步研究［１１］。杨
树花总黄酮类提取物对自由基的清除效果显著，但
抗氧化作用不及维生素Ｃ，其原因可能与杨树花黄
酮提取物质量浓度有关，黄酮质量浓度越大，其抗
氧化能力就越强。杨树花黄酮提取物做为一种天然
抗氧化剂可应用于养殖业，维护畜禽的机体抗氧化
能力，但需要进一步探索将杨树花黄酮类提取物应
用到饲料和养殖业适宜的剂量。杨树花黄酮类提取
物可能是通过清除反应生成的自由基，抑制自由基
的生成来起到抗氧化作用的。
４ 结论
杨树花总黄酮对ＤＰＰＨ 自由基、羟基自由基
（·ＯＨ）及超氧阴离子自由基（·Ｏ２ －）均有一定的
清除作用，并且呈现出一定的剂量效应，杨树花超
声波萃取物的抗氧化活性高于维生素Ｅ但是与维生
素Ｃ相比，清除能力稍弱。杨树花超声波提取物的
抗氧化能力高于杨树花水提物和醇提物。
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ｖｏｎｏｉｄｓ［Ｊ］． Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１４，２４（１０）：２３１５ － ２３１８．
通信地址：辽宁省锦州市古塔区人民街五段４８
号锦州医科大学畜牧兽医学院
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
１２１００１
（上接第５０页）
高，为４１ ８０％，３种毒素交叉污染率为１１ ０９％，
远远低于全国水平［３ － ４］。表明山东省粮油作物主要
受镰刀菌的侵染而产生ＤＯＮ和ＺＥＮ等代谢产物。
在小麦、大麦、高粱和饼粕类饲料中ＡＦＢ１污染为
０，ＺＥＮ污染率为８ ８２％ ～ ２８ ５７％，超标率为０。
ＤＯＮ污染率为２０ ００％ ～ １００ ００％，较为突出的为
小麦和豆粕，小麦污染率为４１ １８％，超标率为
３５ ７１％，豆粕１００ ００％，但不超标。
季海霞等［３］对全国２０１５年１—６月饲料霉菌毒
素分析结果表明，玉米饲料中ＡＦＢ１ 检出率为
７６ １９％，最高含量为１０ ２７ μｇ ／ ｋｇ，超标率为０。
ＺＥＮ和ＤＯＮ检出率均为１００ ００％，最高含量分别
为１ ４４２ ５４ 和３ ６２５ ３０ μｇ ／ ｋｇ，超标率分别为
１１ １１％和５３ ９７％；玉米副产物饲料中ＡＦＢ１、
ＺＥＮ和ＤＯＮ检出率均为１００ ００％，最高含量分别
为１４ ４２、１ ５１８ １８和４ ４０２ ６９ μｇ ／ ｋｇ，超标率分
别为０、３７ ２９％和９３ ２２％。试验显示，玉米饲料
中ＡＦＢ１检出率为５ １３％，最高含量为７４ ２６ μｇ ／ ｋｇ，
超标率为２０ ００％，污染率轻于全国水平，但污染
程度重于全国水平；ＺＥＮ 和ＤＯＮ 检出率分别为
４８ ７２％和６５ ６４％，超标率１５ ７９％和２８ １３％明
显低于全国水平；玉米副产物饲料中ＡＦＢ１检出率
为２９ ６３ ％，超标率为０。ＺＥＮ和ＤＯＮ检出率分别
为８８ ８９ ％和９５ ５６ ％，最高含量分别为（玉米胚
芽饼粕）３ ５２２ ６１和（ＤＤＧＳ）１１ ８７５ ５３ μｇ ／ ｋｇ，分别超
出限量标准７倍和１１倍之多，超标率为４２ ５０％和
６８ ２２ ％ ，污染率低于全国水平，但污染程度较全
国严重。糟糠类饲料中ＡＦＢ１ 污染率较轻，为
９ ５４％，超标率均为０，其他２种毒素有较高的检
出率，酱油糟检出率为１００ ００％，但都不超标。值
得关注的是米糠类饲料，其ＤＯＮ 最高含量为
１ １２０ ００ μｇ ／ ｋｇ，超标率为２１ ０５％。
综上所述，山东省饲料原料主要受ＤＯＮ 和
ＺＥＮ污染，表明镰刀菌是粮油作物主要的侵染源，
受不同类型的镰刀菌侵染而造成各种病害，进而产
生毒素污染饲料原料，应从污染源头抓起，从种
子、田间管理、收获及饲料加工储存各个环节严把
质量关，尽量减少霉菌污染，同时在饲料中添加适
量脱霉剂。
４ 结论
山东省饲料原料ＡＦＢ１ 污染较轻，除玉米有
１ ００％超标外其余均不超标。ＤＯＮ和ＺＥＮ污较为
普遍，需要重点关注玉米及副产物饲料中ＤＯＮ和
ＺＥＮ的含量及米糠饲料中ＤＯＮ的污染。
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青岛农业大学动物科技学院
２６６１０９