全 文 ：西北农业学报　2009 , 18(3):263-267
Acta A griculturae Boreali-occidentalis Sinica
淡紫拟青霉PL04菌株抗逆性及其对香蕉根结线虫的寄生作用＊
汪　军 ,黄俊生＊ ,邓国平 ,赵培静 ,杨腊英 ,陈希德
(中国热带农业科学院 环境与植物保护研究所 ,海南儋州　571737)
摘　要:抗逆性测定结果表明 , 淡紫拟青霉 PL04 菌株有较强的抗逆性和对化学农药的兼容性。 PL04 菌株在
PSA 培养基上菌落生长和产孢的适温为 5 ～ 40℃(最适温度为 29℃)。PL04 菌株在 pH4 ～ 13(最适 pH 为 7)
范围内的培养基上均可生长;PL04 菌株在 40℃和 50℃条件下的 LT50 分别为 78.8 min 和 40.8 min。 PL04
菌株有较强的耐盐碱能力;PL04 菌株对氯霉素有较强的耐受性;PL04 菌株对杀菌剂多菌灵 、百菌清 、苯醚甲
环唑 、除草剂百草枯以及消毒防腐剂福尔马林较敏感 , 其 EC50分别为 0.021、0.013 、0.006 、0.016 和0.120
mg/ mL , PL04 菌株对杀线虫剂阿维菌素和辛硫磷 , 杀菌剂三唑酮不敏感 , 其 EC50分别为 0.175 、0.338 和
0.337 mg/ mL 。采用双温测定法 ,室内测定淡紫拟青霉 PL04 菌株对香蕉根结线虫的寄生作用 ,不同处理具
有显著性差异 , PL04菌株孢子悬浮液处理 18 d 后对香蕉根结线虫卵的相对寄生率为 94.3%。
关键词:淡紫拟青霉;抗逆性;香蕉根结线虫;寄生作用
中图分类号:S436.67　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1004-1389(2009)03-0263-05
Stress Resistance Characteristics of the PL04 Strain of Paecilomyces
lilacinus and Parasitism Effect of It on Meloidog yne spp.
WANG Jun , HUANG Junsheng＊ , DENG Guoping ,
ZHAO Peijing , YANG Laying and CHEN Xide
(E nvi ronment and Plant Protect ion Research Ins titute , Chinese Academy of T ropical
Agricu ltu ral S cien ces , Danzhou Hainan　571737 , China)
Abstract:Stress resistance characterist ics tests show ed that the st rain PL04 st rain of Paeci lomyces li-
lacinus had strong resistance abili ty and w as compat ibility w ith chemist ry pest icide.For the grow th
and spo re production of PL04 st rain , the suitable temperature w as 5 ～ 40 ℃(the optimum temperature
w as 29℃).The PL04 st rain could grow on potato sugar agar w ith pH range from 4 to13(the optimum
pH was 7).Tests show ed that the LT 50 at 40℃was 78.8 min and at 50℃was 45.3 min o f the PL04
st rain.The PL04 st rain w as able to endure higher concentration saline-alkali and chloramphenico l.
Tests show ed that the PL04 st rain w as sensitive to fungicide carbendazo l , chloror thalonil , difenocon-
azole , herbicide paraquat and fo rmalin , EC50 of them were 0.021 mg/mL , 0.013 mg/mL , 0.006mg
mg/mL , 0.016 mg/mL and 0.120 mg/mL respectively.But the PL04 st rain w as consistent to the
nemacicide avermecti , phoxim and fungicide t razodone , EC50 of them were 0.175 mg/mL , 0.338 mg/
mL and 0.337 mg/mL respectively .The PL04 st rain w as demonst rated as a highly ef fective st rain to
control Meloidog yne spp.There w as signif icantly difference among the different t rea tment.Results of
the pet ridish test show ed 94.3% o f the egg s w ere parasi tized by the fungus 18 d(7 days at 18℃plus
11 days at 25℃)af ter inoculation.
＊收稿日期:2008-09-22　　修回日期:2008-11-04
基金项目:国家科技支撑计划项目(2007BAD48B02);中央级公益性科研 m 院所基本科研业务费专项(2007HZS1J007);科技部“国
家科技基础条件平台工作”(2005DKA21201)和农业科技成果转化项目(2007GB23260410)资助。
作者简介:汪　军 ,男 ,硕士研究生 ,研究方向:分子植物病理学。 E-mail:eryeww@163.com
＊通讯作者:黄俊生。
Key words:Paeci lomyces l ilacinus;S tress resistance;Meloidogyne spp;Parasi tism ef fect
　　随着香蕉组培苗工厂化生产的迅速发展 ,田
间复种指数增高 ,由香蕉根结线虫(Meloidogyne
spp.)侵染引起的香蕉根结线虫病成为中国香蕉
种植区重要病害之一 ,该病普遍发生 ,逐年加重 ,
发病率高达 60 %以上[ 1] 。香蕉根结线虫(Meloi-
dog yne spp.)优势种为南方根结线虫(M.incog-
ni ta)和爪哇根结线虫(M.javanica),其次为花
生根结线虫(M.arenaria)、高弓根结线虫(M.
acri ta)和巨大根结线虫(M.megadora)[ 2] ,同
时香蕉根结线虫的侵染与香蕉束顶病(Banana
Bunchy Top Virus , BBTV)的发生密切相关[ 3] ,
对香蕉生产造成严重威胁 。传统的药剂防治虽有
较好的效果 ,但化学农药对环境的污染 、人畜的毒
害以及在香蕉上的残留等已成为全社会关注的问
题 ,寻找生物制剂对该病进行防治已十分紧迫。
淡紫拟青霉(Paeci lomyces li lacinus(Thom.)
S amson)作为一种重要的生防真菌 ,不仅能够寄
生包括根结线虫 、胞囊线虫在内的多种植物病原
线虫的卵 、幼虫及成虫 ,而且在代谢过程中能够产
生具有杀线虫活性的物质 ,抑制线虫卵的孵化 ,并
强烈抑杀二龄幼虫[ 4-5] ,从而控制作物线虫病害。
笔者对淡紫拟青霉 PL04 菌株耐热性 、耐酸碱性 、
耐盐性及耐化学药物特性作了研究 ,同时还测定
了该菌对香蕉根结线虫的寄生作用 ,旨在为淡紫
拟青霉菌剂的研制和应用提供科学依据 。
1　材料与方法
1.1　供试材料
供试菌种:淡紫拟青霉 PL04菌株由中国热
带农业科学院环境与植物保护研究所微生物农药
资源课题组提供 ,分离自海南乐东香蕉根际土壤。
供试香蕉根结线虫卵悬液:卵悬液的制备参
照文献[ 6]的方法。
供试培养基:① PDA 培养基;②PSA 培养
基;③几丁质培养基:胶体几丁质 10 g ,蛋白胨 5
g ,N aCl 3 g ,K 2HPO 4 1 g ,琼脂18 g ,蒸馏水 1 000
mL ;④明胶琼脂培养基:明胶 10 g ,MgSO 4 ,NaCI
和 K 2HPO3 各 0.3 g ,琼脂 18 g , 蒸馏水 1 000
mL 。
供试药剂:50%多菌灵WP(天门易普乐农化
有限公司)、75%百菌清 WP(江阴市苏利精细化
工有限公司)、15%三唑酮WP(上海升联化工有
限公司)、10%苯醚甲环唑 WG(先正达苏州作物
保护有限公司)、1.8%阿维菌素 EC(浙江海正股
份有限公司)、40%辛硫磷 EC(湖北仙隆化工有限
公司)、20%百草枯水剂 SL(济南绿霸公司)、36%
～ 40%甲醛溶液(广州化学试剂厂)。
1.2　PL04菌株的抗逆性测定
1.2.1　PL04菌株菌落生长速度的测定　PL04
菌株在 PDA 培养基上生长 5 d[ 7] ,在菌落边缘打
出 Υ4 mm 的菌饼 ,接种于不同的培养基上 28℃
恒温培养 , 从形成菌落开始 ,每隔 2 d观测 1次 ,
培养 15 d或生长最快的处理将要长满平板时结
束 ,用十字交叉法测定各处理的菌落生长直径 ,重
复 5次 ,计算菌落日平均生长速度(mm/d)。
生长速度=(nd 菌落直径-sd 菌落直径)/
(n-s)。
1.2.2　温度对 PL04菌株菌落生长的影响　将
PL04菌株接种到 PSA 平板中央 , 分别置于 5 、
10 、15 、20 、25 、30 、35和 40℃等 8个不同温度梯度
下培养培养 ,重复 5次 ,计算菌落生长速度。
1.2.3　PL04菌株耐酸碱性的测定　当 PSA 、明
胶培养基 、几丁质培养基灭菌后冷却至 60℃左右
时 ,用1 mol/ L 的HCl和1 mol/ L 的NaOH 溶液
分别将 PSA 培养基 pH 值调节成 4 、5 、7 、9 、11和
13 ,并制成平板 ,接种 、培养和观察 ,重复 5次 ,计
算菌落生长速度。
1.2.4　PL04菌株耐高温的测定　取 PDA 培养
基上培养 5 d的 PL04菌株分生孢子 ,用 2%壳聚
糖+1%的蛋白胨溶液配置成浓度较低的孢子悬
浮液 ,取 PL04菌株孢子悬浮液 1 mL 置 2 mL 容
积的离心管中 ,分别于 40℃和 50℃的恒温水浴锅
中水浴 ,处理 10 、20 、30 、40 、50 和 60 min ,处理过
程中缓慢摇动离心管。采用凹玻片悬滴法 ,将经
过水浴处理的孢子悬浮液置于 29℃保湿培养 ,12
h后镜检分生孢子萌发率 ,设无水浴处理的孢子
悬浮液为对照 ,每次镜检 50个孢子 ,重复 5次。
1.2.5　PL04菌株耐盐性的测定　配制含 NaCI
终浓度为 0.05 、0.10 、0.15 、0.20和 0.25 mo l/L
的 PSA 培养基 ,并制成平板 ,接种 、培养和观察 ,
选用初筛获得的淡紫拟青霉菌株 PL01菌株作为
对照菌株 ,重复 5次 ,计算菌落生长速度 。
1.2.6　PL04菌株对氯霉素的耐受性测定　配制
含氯霉素浓度为 0.125 、0.25 、0.50 、1.00和 2.00
·264· 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　18 卷
mg/mL 的 PSA培养基 ,设不加氯霉素的 PSA 培
养基为对照 ,灭菌后 ,制成平板 ,然后接种 、培养和
观察 ,重复 5次 ,计算菌落生长速度 。
1.2.7　PL04菌株与化学农药的兼容性测定　采
用菌丝生长速度法测定 PL04菌株对化学农药的
兼容性。将直径 4 mm PL04 菌株菌饼接种到含
有不同药剂浓度的培养基平板上 ,每皿一片 ,置于
28℃恒温箱内黑暗培养 3 ～ 4 d ,用十字交叉法测
定各处理的菌落生长直径 ,以无菌水为对照 。每
浓度处理重复 5次。按照公式求出各个药剂浓度
对菌落生长抑制率(%),求出毒力回归方程式及
EC50 。
菌落生长抑制率=[ 1 -(处理菌落直径-
菌饼直径)/ (对照菌落直径 -菌饼直径)] ×
100%。
1.3　PL04菌株对香蕉根结线虫卵寄生作用的测
定
每个培养皿(半径 3 cm)中移入 3个经表面
消毒的卵囊 ,并分别加入 5 mL 浓度为 7×105 、7
×106 、7×107 、7×108 和 7×109个/mL 的孢子悬
浮液 ,加入 5 mL 无菌水作对照 ,重复 5次 。利用
双温测定法[ 6] , 18℃下培养 7 d后 ,再于 25℃下培
养 11 d ,在 8 、10 、12 、14 、16和 18 d分别镜检各皿
中卵的孵化数量 ,计算卵的相对寄生率 。
卵相对寄生率=(对照孵化的卵数量-处理
孵化的卵数量)/对照孵化的卵数量×100%。
1.4　数据处理
利用 SAS软件和 Excel XP 进行数据处理和
统计分析 。
2　结果与分析
2.1　温度对 PL04菌株菌落生长的影响
适合菌落生长的温度范围大约为 5 ～ 40 ℃,
菌落生长的最适温度为 29℃, 生长速度为 5.1
mm/d ,25℃条件下次之 ,在 10 和 35℃条件下生
长较为缓慢 ,平均生长速度为 1.9 mm/d , 40℃条
件未见有菌落形成(图 1)。
2.2　PL04菌株对酸碱的耐受性
PL04菌株在 pH4 ～ 13 的范围内均可以生
长 ,在 pH 为 5 的 PSA 培养基上生长最快;PL04
在 pH 为 7的几丁质培养基上生长最快 ,说明中
性条件下有利于 PL04以几丁质为营养;PL04菌
株在 pH 为 5的明胶培养基上生长最快 ,说明弱
酸性条件下有利于 PL04菌株以明胶为 C 源和 N
源 ,在酸性条件下产蛋白酶能力较强(图 2)。
图 1　温度对 PL04 菌落生长速度的影响
Fig.1　The ef fect of temperature on colony growth velocity
of PL04 strain of Paecilomyces lilacinus
图 2　PL04 菌株对酸碱性的耐受性
Fig.2　The tolerance of PL04 strain of Paecilomyces
lilacinus to acid and alkali
　　上述结果表明 , PL04菌株对酸碱性的适合度
较高 ,PL04菌株对不同类型营养的利用能力 ,在
不同 pH 下是不同的 ,在中性条下件菌株最适合
在 PSA 和几丁质培养基上生长 ,而在酸性条件下
菌株在明胶培养基上更有利于生长 。田间土壤
pH 在 5.5 ～ 8.5 之间 ,因此 , PL04菌株可以适应
不同酸碱度类型的土壤。
2.3　PL04菌株对高温的耐受性
在 40和 50℃条件下分别处理 20 min以内 ,
PL04菌株萌发率受到的影响不显著 ,处理时间分
别超过 30 min后 ,萌发率显著降低。回归分析结
果表明 ,40℃条件下处理的相关系数 R=0.9632 ,
F>F0.05 , PL04 菌株的 LT50 为 78.8 min;50℃
条件下处理的相关系数 R =0.9773 , F >F0.05 ,
PL04菌株的 LT50为 40.8 min ,说明处理时间和
萌发率存在显著相关性(表 1)。
2.4　PL04菌株的耐盐性
在不同NaCl浓度 PSA平板上的处理除了菌
落直径大小不同外 ,没有明显的差异 ,菌落颜色
·265·3 期　　　　　　　　汪　军等:淡紫拟青霉 PL04 菌株抗逆性及其对香蕉根结线虫的寄生作用
表 1　淡紫拟青霉 PL04 菌株对高温的耐受性
Table 1　The tolerance of PL04 strain of Paecilomyces
lilacinus to high temperature
处理时间/min
T reatment tim e
分生孢子萌发率 /%
Rate of conidiospore germination
40℃ 50℃
10.000 99.3aA±0.21 99.2aA±0.28
20.000 98.0aA±0.82 98.0aA±0.00
30.000 93.3bB±1.25 92.5bB±0.75
40.000 90.3 cB±1.70 63.4cC±2.95
50.000 75.7dC±1.25 19.7dD±1.25
60.000 62.3eD±2.05 14.0eE±0.82
0.000 99.6aA±0.33 99.6aA±0.33
回归分析结果
Regression
analy sis result
y =117.82-0.86 x
R= 0.9632 ,
L T50=78.8 ,
F= 38.52,
F 0.05 =10.13
y=118.44-1.6756 x
R=0.9773 ,
L T50 =40.8 ,
F=41.45 ,
F0.05 =10.13
注:数字后字母为 Duncan s新复极差测验结果 ,不同大 、小写英
文字母分别表示差异极显著(P≤0.01)和差异显著(P≤0.05),
字母相同者为差异不显著。Note:Means in a colnnm follow ed
b y the sam e letter are not signifi can tly di ff erent according to the
Duncan s mu ltiple range test.
均为粉红色 ,菌丝较稀薄 ,颜色较浅 ,产生同心轮
纹。NaCl浓度≤0.250 mo1·L-1 ,对 PL04 菌株
的生长有一定的促进作用;NaCl浓度 ≤0.1500
mo1·L -1 ,对 PL01菌株的生长有一定的促进作
用。而一般盐碱地的 NaCl 质量百分含量约为
0.7%,说明盐碱地条件对淡紫拟青霉 PL04菌株
的生长影响不大(图 3)。
图 3　 PL04 菌株对 NaCI的耐受性
Fig.3　The tolerance of PL04 strain of
Paecilomyces lilacinus to NaCI
2.5　PL04菌株对氯霉素的耐受性
在不同氯霉素浓度 PSA 平板上处理除了菌
落直径大小不同外 ,没有明显的差异 ,菌落颜色均
为粉红色 ,菌丝较稀薄 ,颜色较浅 ,产生同心轮纹。
氯霉素浓度≥2.00 mg/mL 时 PL04 菌株生长才
受到一定程度的抑制 ,其中氯霉素浓度为 0.500
mg/mL 的处理 , PL04菌株生长速度为4.4 mm/
d ,显著高于对照 ,表明 PL04 菌株对氯霉素的耐
受性较高(图 4)。
图 4　PL04 菌株对氯霉素的耐受性
Fig.4　The tolerance of PL04 strain of Paecilomyces
lilacinus to chloramphenicol
2.6　PL04菌株与化学农药的兼容性
PL04对杀菌剂多菌灵 、百菌清和苯醚甲环
唑 、除草剂百草枯以及土壤常用消毒剂福尔马林
较敏感 , 其 EC50分别为 0.021 、0.013 、0.006 、
0.016和 0.120 mg/mL ,其 EC50稀释倍数均远高
于田间使用推荐稀释倍数 ,但是对多菌灵的抗感
性常以菌株在含多菌灵 5 μg/mL 的平板上是否
能生长来进行初步判别 ,然后测定其 EC50值来判
定是否抗感 , 多菌灵对 PL04 菌株的 EC50为 21
μg/mL ,因此认为 PL04菌株属于较抗多菌灵菌
株。PL04菌株对杀虫剂阿维菌素和辛硫磷则不
很敏感 ,其 EC50分别为 0.175和 0.338 mg/mL ,
EC50稀释倍数略高于辛硫磷的田间使用推荐稀释
最低倍数 。PL04菌株对杀菌剂 15%三唑酮不敏
感 , EC50为 0.337 mg/mL ,其 EC50稀释倍数低于
田间使用推荐稀释倍数(表 2)。
2.7　PL04菌株对香蕉根结线虫卵的寄生作用
显微镜观察表明 ,在 18℃下 ,处理和对照的
卵发育均较慢 ,处理中卵囊上逐渐长出菌丝 。当
培养 7 d后转入 25℃时 , PL04菌株对香蕉根结线
虫卵的寄生作用逐渐增强 ,与对照差异显著 。对
照中的卵和处理中未被寄生的卵发育和孵化也相
应加快 ,18 d后显微镜再次观察表明 ,对照中孵
化出的线虫 ,经 PL04 菌株处理过的卵囊表面长
有菌丝。浓度为 7×105 、7×106 、7×107 、7×108
和 7×109 个/mL 的孢子悬浮液对卵的相对寄生
率分别为 72.5%、80.7%、83.1%、90.2%和
94.3%(图 5)。
·266· 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　18 卷
表 2　PL04 菌株与化学农药的兼容性
Table 2　Compatibility between PL04 strain of Paecilomyces lilacinus and several pesticides
农药
Pest icide
回归方程
Reg ression
equation
相关系数
Coeff icient
correlat ion
EC50/(mg/mL)
EC 50稀释倍数
EC50
dilut mul tiple
田间推荐稀释倍数
Field recomm endat ion
di lut mu ltiple
50%多菌灵 y=41.974+386.743 x 0.9712 0.021 23809.5 600～ 800
75%百菌清 y=14.86+2606 x 0.9582 0.013 57692.3 600～ 800
15%三唑酮 y=-15.4+193.951 x 0.9868 0.337 445.1 1000～ 2000
10%苯醚甲环唑 y=2.4044+7948.715 x 0.9475 0.006 16666.7 1500～ 7000
1.8%阿维菌素 y=6.525+248.045 x 0.9508 0.175 10285.7 9000～ 12000
40%辛硫磷 y=33.689+48.203 x 0.9513 0.338 1183.4 1000～ 2000
20%百草枯水剂 y=51.524+94.369 x 0.9889 0.016 1250 100～ 200
36%～ 40%甲醛 y=7.611+352.013 x 0.9878 0.120 3166.7 100～ 200
图 5　不同稀释倍数的 PL04 菌株孢子悬浮液对
香蕉根结线虫卵的相对寄生率
Fig.5　 Egg relative parasitism rate of banana root-
knot nematode by PL04 strain of
Paecilomyces lilacinus
3　讨论
研究表明 ,淡紫拟青霉菌株 PL04 菌株可以
耐受较大范围的高温 、酸碱度 ,并具有较高的耐盐
碱和氯霉素能力 ,而且对一些农药的耐受性也较
好 ,所以可以根据这个特性配制所需的选择性培
养基 ,以方便研究 。本研究证实淡紫拟青霉与杀
线虫剂阿维菌素有一定的相容性 ,这种相容性在
混配剂的研究中很有价值 ,在线虫发生很严重确
实需要迅速降低虫口数量时 ,可以考虑将 PL04
菌株制剂与化学杀线虫剂混用 。应用淡紫拟青霉
制剂防治香蕉等作物的根结线虫病害时 ,除要考
虑常用土壤杀虫剂和杀菌剂对该菌的影响外 ,还
要考虑到该菌对一些广谱性的化学杀菌剂较敏
感 ,常用除草剂百草枯使用浓度范围内对PL04
菌株也有抑制作用 ,使用过程中不得将其混配。
淡紫拟青霉在世界上分布很广 ,是土壤中植
物线虫的一种兼性寄生菌 ,除寄生根结线虫外 ,还
能寄生球胞囊线虫(Globodera rostochiensis)、穿
刺线虫(Ty lenchulus semipenetrans)和珍珠线虫
(Nacobbus aberrans)等植物寄生线虫[ 8] 。本研究
测定了淡紫拟青霉 PL04菌株的抗逆性对香蕉根
结线虫的寄生作用 ,表明淡紫拟青霉 PL04菌株
是一个优良的生防菌株 ,具有开发利用潜力 ,为香
蕉等作物根结线虫病的生物防治开辟了一条新的
途径 。
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·267·3 期　　　　　　　　汪　军等:淡紫拟青霉 PL04 菌株抗逆性及其对香蕉根结线虫的寄生作用