全 文 ：第 33卷第 3期
2 0 1 0年 5月
河 北 农 业 大 学 学 报
JOURNA L OF AGRICULT URAL UNIVERS IT Y OF HEBEI
　 　 Vol.33 No.3
May .2 0 1 0
文章编号:1000-1573(2010)03-0092-05
新疆紫草毛状根提取物的抑菌活性研究
李翠芳1 , 　王　芳1 , 　麻　浩2 , 　罗　明1 , 　于月华1
① (1.新疆农业大学 农学院 , 新疆 乌鲁木齐 830052;2.南京农业大学 农学院 , 江苏 南京 210095)
摘要:为了研究新疆紫草毛状根的抑菌活性与新疆紫草根的抑菌活性是否相似 , 以甜瓜叶斑病 、大肠杆菌 、金黄
色葡萄球菌 、棉花枯萎病菌和棉花黄萎病菌 5 种菌为供试菌 ,采用滤纸片法和菌丝生长速率法 , 对新疆紫草毛状
根紫草素粗提物及多糖进行抑菌活性研究。结果表明:乙醇提取物对 3 种细菌均具有抑制作用 , 其中对金黄色
葡萄球菌的抑菌作用最强。丙酮提取物仅对甜瓜叶斑病菌有抑制作用 , 其抑制作用较乙醇提取物高 26.5%。
乙酸乙酯和石油醚提取物对 3 种细菌均无抑制作用;4 种溶剂提取物对 2 种真菌均有抑制作用 ,且对棉花黄萎病
菌的抑制率均高于枯萎病菌;乙醇提取物对金黄色葡萄球菌 、丙酮提取物对甜瓜叶斑病菌的 M IC 均为 0.1 mg/
mL ,乙醇提取物对大肠杆菌的 M IC 为 6.25 mg/ mL;毛状根多糖对 2 种真菌均具有抑制作用 , 且对棉花黄萎病
的抑制作用较棉花枯萎病高 26.14%,而对 3 种细菌均无抑制作用。
关　键　词:新疆紫草;毛状根;抑菌作用
中图分类号:Q 946.3 文献标志码:A
Study on antibacterial activity of Arnebia euchroma
(Royle)Johnst hairy roots extract
LI Cui-fang1 , WANG Fang1 , MA Hao2 , LUO Ming1 , YU Yue-hua1
(1.Colleg e of Ag ronomy , Xinjiang Ag ricultural Univ ersity , Urumqi 830052 , China;
2.Co llege of Ag ronomy;Nanjing Ag ricultura l Unive rsity , Nanjing 210095 , China)
Abstract:The Pseudomonas sy ringae pv.melonis , Escherichia col i , Staphy lococcus aureus ,
Fusarium oxysporum f.sp.vasin fectum and Vert icil l ium dahl iae were chosen in bacteriostasis
experiments.By f ilte r paper method and mycelium g row th rate method , inhibitive activities of
crude ex tract and polysaccharides f rom Arnebia euchroma (Roy le)Johnst Hairy Roots w ere ex-
perimented.T his show s that ethano l ex t ract had signi ficant antibacte rial act ion on three kinds
of bacteria , and the best inhibi to ry ef fect on S.aureus.Acetone ex t ract had bacte rio static ac-
tio n on P.syringae pv.Melonis ,whose inhibi to ry ef fect w as g reater than the ethano l ex t ract of
26.5%.Ethy l ace tate and pe tro leum e ther ex t ract had no inhibit ion effects on three species of
bacteria.Four kinds o f different so lvent ex t racts had inhibition ef fects on two species of fungi ,
whose inhibition rate of V.dahl iae was highe r than F .oxy sporum f.sp.vasin fectum.Ethano l
ext ract fo r S.aureus and ace tone ex t ract for P.sy ringae pv.melonis the M IC w as 0.1 mg/
mL.Ethanol ex t ract the M IC w as 6.25 mg/mL fo r E.coli.Po lysaccharides of hairy roots had
inhibi tion effects on tw o species of fungi , w ith inhibition o f V.dah liae 26.14%higher than F.
oxy sporum f.sp.vasin fectum , but had no inhibition ef fects on three species of bacteria.
Key words:Arnebia euchroma (Roy le)Johnst;hairy roots;bacterio stasis
①收稿日期:2009-11-20
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30560059);自治区自然科学基金资助项目(200821170).
作者简介:李翠芳(1980-),女 , 河北省邢台人 , 硕士生 ,研究方向为细胞工程.
通讯作者:王　芳(1962-),女 , 教授 ,硕士生导师 ,主要从事植物细胞工程方面的研究.E-mail:Wang fang1hao@126.com.
　第 3期　 李翠芳等:新疆紫草毛状根提取物的抑菌活性研究
　　新疆紫草(Arnebia euchroma (Royle)Johnst)
的主要成分为萘醌类色素 ,具有抗生育 、抗炎 、抗肿
瘤 、杀菌抗病毒和免疫调节等药理作用 ,被广泛用于
医药 、保健 、食品等行业[ 1] 。紫草能够抑制许多植物
病原菌[ 2-7] ,因此作为植物源杀菌剂其应用前景十分
广阔 。毛状根是利用发根农杆菌(Agrobacterium
rhizogenes)Ri质粒诱发的结果 ,具有激素自主 、生
长迅速 、有效成分含量高且稳定等特点[ 8] ,是大量生
产植物有效成分的新途径 。紫草毛状根抑菌活性的
研究目前国内外报道很少 , Fukui 等发现硬紫草
(Li thospermum ery throrhizon)毛状根中的无色苯
醌色素具有很强的抗真菌作用[ 9] ,本试验以新疆紫
草毛状根为试材 ,研究毛状根不同溶剂提取物对甜
瓜叶斑病 、大肠杆菌 、金黄色葡萄球菌 、棉花枯萎病
菌和棉花黄萎病菌等 5 种菌株的抑菌作用 ,探讨新
疆紫草毛状根作为抑菌剂的可能性 ,为新疆紫草毛
状根的开发利用提供理论依据 。
1　材料与方法
1.1　材料
新疆紫草毛状根由本课题组提供。
供试菌种 。甜瓜叶斑病(Pseuodomonas syrin-
gae pv.melonis);大肠杆菌(Escherichia coli);金黄
色葡萄球菌(S taphy lococcus aureus);棉花枯萎病
菌(Fusarium oxy sporum f.sp.vasin f ectum);棉花
黄萎病菌(Vert ici ll ium dahliae),由新疆农业大学
农学院微生物实验室提供 。
细菌培养基:普通牛肉膏蛋白胨固体培养基 ,其
成分为牛肉浸膏5 g/L ,蛋白胨 10 g/ L ,酵母膏 1 g/
L ,蔗糖 10 g/L ,琼脂 15 g/L ,pH 值 6.8 ～ 7.0;液体
培养基除了不加琼脂外 ,其它组成与固体培养基相
同。
真菌培养基:马铃薯葡萄糖培养基(PDA),马
铃薯 200 g/ L ,蔗糖 20 g/ L ,琼脂 10 g/L , pH6.5。
试剂:乙醇 、乙酸乙酯 、丙酮和石油醚 ,均为分析
纯(天津市化学试剂三厂)。
1.2　方法
1.2.1　毛状根不同溶剂紫草素粗提物的制备　称
取 30 g 干燥毛状根粉末 4 份 ,分别置于 4 个 500
mL 锥形瓶中 ,分别加入乙醇 、丙酮 、乙酸乙酯 、石油
醚 4种不同提取溶剂 150 mL ,在室温条件下进行振
荡 ,每振荡 2 h 更换一次溶剂 ,依此反复 ,直至溶剂
无色为止 ,合并滤液并过滤 ,滤液旋转蒸发的浓缩
液 ,干燥后即分别得到乙醇提取物 、丙酮提取物 、乙
酸乙酯提取物 、石油醚提取物等总紫草素粗粉 ,待
用 。
1.2.2　毛状根粗多糖的提取　称取干燥毛状根粉
末 10 g ,置于 500 mL 烧杯中 ,加蒸馏水 150 mL ,于
80 ℃超声处理 25 min ,间歇 10 min ,再超声处理 25
min 后室温静置 30 min ,使用双层纱布过滤除去滤
渣 ,取滤液冷冻离心 10 min(3 000 r/min)。取上清
液分别减压浓缩至原液体积的 1/3 ,过滤除去滤渣 ,
滤液分别加入无水乙醇 208.0 ,228.0和 280.0 mL ,
使溶液中乙醇含量达 80%,置 4 ℃冰箱静置过夜 ,
再过滤 ,滤渣用无水乙醇反复洗涤得多糖水溶液 ,用
真空干燥器干燥 ,即得毛状根多糖粗粉。
1.2.3　毛状根提取物抑菌活性测定
①菌悬液的制备 。分别将受试细菌接种到牛肉
膏蛋白胨固体平板培养基上 ,置于 37 ℃培养 18 ～ 24
h ,使其活化 ,再挑取单菌落接种到牛肉膏蛋白胨液
体培养基中 ,置于摇床(150 r/min , 25 ℃)上振荡 ,
待菌落达到对数生长期时(约 10 h),再用液体培养
基分别将各菌液调至 OD600约为 0.5 ,待用 。
将供试真菌接于马铃薯蔗糖固体平板培养基上
培养产生孢子 ,待用。
②毛状根提取物稀释液的制备。毛状根各溶剂
紫草素粗提取物用相应溶剂依次稀释成 50 、25 、12.
5 、6.25 、3.125 mg/mL 系列浓度稀释液备用 。
毛状根粗多糖用蒸馏水配制成 50 、25 、12.5 、
6.25 、3.125 mg/mL 系列浓度稀释液备用。
③毛状根提取物抑制细菌活性测定。采用滤纸
片法[ 10]测定抑菌圈大小:选用优质滤纸用打孔器制
成直径为 6 mm 的圆形滤纸片 ,放入干净培养皿内 ,
121 ℃高压灭菌 30 m in ,备用。按菌悬液与培养基
为 1∶100(体积比 ,即 100 mL 牛肉膏蛋白胨培养基
中加入 1 mL 菌悬液)的比例 ,准确量取菌悬液加入
已融化并冷却至 45 ℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基 ,
倒入培养皿中 ,冷凝成带菌平板 ,以相应溶剂做对
照 。将灭菌滤纸片放入平板上 ,每皿 3片 ,摆成三角
形状。然后再用移液枪吸取不同溶剂提取物稀释液
5 μL 滴在滤纸片上 ,37 ℃恒温培养 24 h ,观察其生
长情况 ,测定抑菌圈直径。
④毛状根提取物抑制真菌作用测定。采用菌丝
生长速率法[ 11] 测定:分别吸取不同溶剂紫草素粗提
取物稀释液 1 mL 加入 9 mL 马铃薯蔗糖培养基混
匀后制成平板 ,以相应溶剂作对照。用打孔器取直
径 6 mm 的菌块 ,菌面朝下置于平板上 , 28 ℃恒温
培养 72 h ,用十字交叉法测定菌落直径(mm)。用
93
　　　　　 河 北 农 业 大 学 学 报 第 33卷
下列公式计算真菌抑制率:
抑制率=[(W 1 -W 2)/W 1] ×100%
W 1 为对照菌落净生长直径;W2 为处理菌落净
生长直径 。
⑤最小抑菌浓度(M IC)测定 。在无菌操作条件
下 ,将毛状根不同溶剂紫草素粗提取物分别稀释成
50 、25 、12.5 、6.25 、3.125 、0.1 、0.05 mg/mL 等 7个
浓度梯度 ,分别取 10 mL 放入 7个灭过菌的锥形瓶
中。按前面的试验方法测定抑菌圈直径 ,以抑菌圈
直径最小的浓度为毛状根提取物的最小抑菌浓度
(M IC)。
试验均重复 3次 ,所有测定值均取平均值 。
2　结果与分析
2.1　毛状根不同溶剂紫草素粗提取物对细菌的抑
制效果
将含有毛状根不同溶剂紫草素粗提取物的滤纸
片放在供试病原菌带菌平板上培养 24 h后 ,表 1结
果显示 , 4种溶剂提取物对 3种植物病原细菌表现
出不同的抑菌活性 ,其中乙醇紫草素粗提取物对 3
种病原细菌均具有抑制作用 ,丙酮提取物仅对甜瓜
叶斑病菌有抑制作用 ,乙酸乙酯和石油醚提取物对
所试 3种细菌均无抑制作用 ,说明不同溶剂提取物
的化学组分存在差异。
当溶剂为乙醇时 ,抑菌作用随着提取物浓度的
升高均逐渐增强 。当浓度为 50 mg/mL 时 ,乙醇提
取物对 3 种细菌的抑制程度有明显差异(P <
0.05),其中对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径最大 ,
为 17.23 mm ,抑制作用最强 ,其次是大肠杆菌和甜
瓜叶斑病菌 。
在所试浓度范围内 ,丙酮提取物对甜瓜叶斑病
菌均有抑制作用 ,当浓度为 50 mg/mL 时 ,抑菌圈直
径最大为 13.86 mm , 抑制作用强于乙醇提取物
26.5%。说明丙酮紫草素粗提物对甜瓜叶斑病菌抑
制作用最强 。
表 1　毛状根不同溶剂紫草素粗提物对病原细菌的抑菌效果
Table 1　Inhibit ion results of hairy roots shikonin crude extracts using different solvents against pathogenic bacteria mm
溶剂
Solvent
细菌
Bacteria
紫草素粗提物浓度/(mg·m L-1)
Concentra tion of shikonin crude ex trac ts
50 25 12.5 6.25 3.125
乙醇
甜瓜叶斑病菌　 10.96 0 0 0 0
金黄色葡萄球菌 17.23 15.17 14.83 14.40 13.03
大肠杆菌　　　 11.87 11.04 10.71 9.26 0
丙酮
甜瓜叶斑病菌　 13.86 12.46 12.17 11.59 10.38
大肠杆菌　　　 0 0 0 0 0
金黄色葡萄球菌 0 0 0 0 0
乙酸乙酯
甜瓜叶斑病菌　 0 0 0 0 0
大肠杆菌　　　 0 0 0 0 0
金黄色葡萄球菌 0 0 0 0 0
石油醚
甜瓜叶斑病菌　 0 0 0 0 0
大肠杆菌　　　 0 0 0 0 0
金黄色葡萄球菌 0 0 0 0 0
　　注:表中数据均为 3次重复的平均值.
2.2　毛状根不同溶剂紫草素粗提物对真菌的抑制
效果
表 2结果显示 , 4种溶剂提取物对 2种真菌均
有抑制作用 ,均表现随提取物浓度的升高逐渐增强
的趋势 ,当浓度为 50 mg/mL 时 ,4种溶剂提取物对
2种真菌抑菌率均达最大值。其中乙醇提取物对 2
种真菌的抑制率分别为 84.24%和 100%,抑菌性最
强。其余依次为乙酸乙酯提取物 、石油醚提取物 、丙
酮提取物 。
4种溶剂紫草素粗提物对棉花黄萎病菌的抑制
率均高于枯萎病菌 ,分别高出 15.76%、20.28%、
38.47%、9.07%,由此可见 ,棉花黄萎病菌对 4种溶
剂提取物较敏感 。此外 ,乙醇提取物在所试浓度范
围内对黄萎病菌的抑菌率均为 100%,表明黄萎病
菌对乙醇提取物高度敏感 ,说明乙醇紫草素粗提物
更适于抑制棉花黄萎病菌。
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　第 3期　 李翠芳等:新疆紫草毛状根提取物的抑菌活性研究
表 2　毛状根不同溶剂紫草素粗提物对
植物病原真菌的抑菌作用
Table 2　Inhibition results of hairy roots shikonin crude
extracts using different solvents against pathogenic fungi%
溶剂
Solv ent
真菌
Fungi
紫草素粗提物浓度/(mg·m L-1)
Concentr ation of shikonin crude ex tr acts
50 25 12.5 6.25 3.125
乙醇　　 枯萎病 84.24 78.26 58.70 47.83 45.11黄萎病 100 100 100 100 100
丙酮　　 枯萎病 27.97 26.69 25.40 21.86 13.18黄萎病 37.04 30.56 26.85 22.22 12.04
乙酸乙酯 枯萎病 63.64 50.69 42.42 39.67 38.84黄萎病 83.92 73.43 70.63 68.53 50.35
石油醚　 枯萎病 39.89 33.43 25.56 20.51 19.38黄萎病 78.36 44.03 42.54 41.04 17.91
　　注:表中数据均为 3次重复的平均值。
2.3　毛状根多糖对病菌的抑制效果
表 3结果显示 ,多糖对 2 种真菌均具有较强的
抑制作用 ,抑菌率均随多糖浓度的升高呈增强趋势 。
当浓度为 50 mg/mL 时 ,抑菌率均达最大值 ,表明毛
状根多糖对棉花黄萎病的抑制作用高于棉花枯萎病
26.14%。此外试验结果显示 ,多糖对所试 3种细菌
的抑菌圈直径均为 0 ,表明毛状根多糖对所试 3 种
细菌均没有抑制作用 。
表 3　毛状根多糖对病原真菌的抑菌率
Table 3　Inhibition results of hairy roots
polysaccharides against pathogenic fungi %
真菌
Fung i
多糖浓度/(mg·m L-1)
Concentra tion of polysaccha rides
50 25 12.5 6.25 3.125
棉花枯萎病菌 53.96 43.88 39.21 37.41 32.01
棉花黄萎病菌 80.00 76.84 69.47 55.79 51.58
　　注:表中数据均为 3次重复的平均值。
2.4 　毛状根紫草素粗提物对细菌的最低抑制
浓度(M IC)
将含有提取物的滤纸片放在供试病原菌带菌平
板上培养 24 h 后 ,考察不同溶剂提取物 、不同浓度
提取物的抑菌圈最小直径的浓度值 。表 4结果显
示 ,毛状根不同溶剂紫草素粗提物对所试 3种细菌
的最低抑菌浓度(M IC)明显不同 。丙酮提取物对甜
瓜叶斑病菌的最低抑制浓度及乙醇提取物对金黄色
葡萄球菌的最低抑制浓度均为 0.1 mg/mL ,乙醇提
取物对大肠杆菌的最低抑制浓度为 6.25 mg/mL ,
表明甜瓜叶斑病菌对丙酮提取物 、金黄色葡萄球菌
对乙醇提取物最敏感 。
表 4　毛状根不同溶剂紫草素粗提物提取物对细菌的 MIC
Table 4　Minimal inhibitory concentration of of hairy roots
shikonin crude extracts using different
solvents against pathogenic bacteria
细菌种类
Bacterial species
对细菌的 MIC/(mg·mL -1)
Minim al inhibitory concen t rat ion of bacteria
乙醇 丙酮 乙酸乙酯 石油醚
甜瓜叶斑病　　 50 0.1 - -
大肠杆菌　　　 6.25 - - -
金黄色葡萄球菌 0.1 - - -
　　注:表中数据均为 3次重复的平均值。
3　讨论
多年来由于紫草的药理作用已经明确 ,因而临
床使用十分普遍 ,如紫纱条用于消炎 、伤口愈合等 ,
尤其保肝护肝疗效十分显著[ 1] ,因此市场需求量很
大 。新疆紫草对大肠杆菌 、金黄色葡萄球菌以及一
些危害农作物的病原细菌均具有不同程度的抑制作
用[ 2-6] 。本研究对新疆紫草毛状根不同溶剂紫草素
粗提物的抑菌活性进行了研究 ,结果表明 ,新疆紫草
毛状根紫草素粗提物提取物对大肠杆菌 、金黄色葡
萄球菌 、甜瓜叶斑病菌棉花枯黄萎病菌均具有较强
的抑制作用 ,表明毛状根提取物的成分类似于原植
物根。因此 ,新疆紫草毛状根可望用于临床抗感染
治疗及生产天然抑菌剂 ,此结果为防治甜瓜叶斑病
害 、棉花枯黄萎病等提供了理论依据 。
萘醌类色素是脂溶性成分 ,采用乙醇 、丙酮 、乙
酸乙酯 、石油醚等有机溶剂提取即可获得 。目前己
从不同种属紫草科植物的根中分离出 30 多种萘醌
类物质[ 12] , 如紫草所含萘醌类成分有紫草素
(Shikonin)、乙酰紫草素(A cety lshikonin)、β -羟基
异戊酰紫草素(Hydaroxyisovaleryl shikonin)、β , β-
二甲基丙烯酰紫草素(Dimethy lacry lshikonin)、2 , 3-
二甲基戊烯酰紫草素(Teracry lshikonin)、异丁酰紫
草素(Isobutylshikonin)、异戊酰紫草素 (Isovaler-
ylshikonin)、α-甲基-正丁酰紫草素(α-Methy lnbu-
tylshikonin)、去氢阿卡宁(Dehydroalkannin)、去氢
异紫草素 、去氧紫草素(Deoxy shikonin)等 。一般
经有机溶剂提取的是混合物 ,成分较多 、较复杂 ,同
时由于有机溶剂不同 ,通过提取所获得的萘醌类色
素的成分及其含量就有差异 ,因而提取率不同 ,抑
菌 、抗氧化等生物学活性强弱也不同。赵雪梅等[ 13]
认为用乙醇 、氯仿 、乙酸乙酯 、石油醚 4 种溶剂提取
紫草素 ,提取率最高的是乙醇 ,而乙醇提取物的抗炎
95
　　　　　 河 北 农 业 大 学 学 报 第 33卷
作用好于水提物。本研究中 ,新疆紫草毛状根乙醇
提取物对棉花枯 、黄萎病 2种真菌及甜瓜叶斑病 、大
肠杆菌 、金黄色葡萄球菌等 3 种细菌均表现出了较
强的抑制活性 ,因此 ,乙醇是获得毛状根抑菌成分的
较合适的提取溶剂 ,此结果与赵雪梅等[ 13] 的一致 。
而丙酮提取物的抑菌活性却表现有差异 ,它对 2 种
真菌的抑菌率最低 ,对甜瓜叶斑病菌具有较强的抑
制作用 ,推测由于抑制不同细菌生长的活性物质不
同 ,并且存在浓度效应 ,因而丙酮提取物中很可能存
在一种与乙醇提取物不同的组分或化学组分相同但
浓度很高的物质 ,从而抑制了甜瓜叶斑病菌 ,却不能
抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的现象 。此外 ,根
据对新疆紫草毛状根化学成分的初步分析 ,与原植
物相比 ,新疆紫草毛状根紫草素粗提取物中不含紫
草素(Shikonin),但乙酰紫草素的含量较高 ,远远高
于β ,β-二甲基丙烯酰紫草素(文章待发表),因此 ,本
试验认为新疆紫草毛状根抑菌活性很可能主要来自
于乙酰紫草素 ,但不排除有其他成分 ,尚待研究。
目前临床上紫草的水煎剂使用较普遍 ,而水煎
剂中的主要成分是多糖 ,研究表明紫草多糖具有增
强特异性和非特异性抗炎 、抗病毒等生物学活
性[ 14] 。本研究对新疆紫草毛状根生物学活性研究
表明 ,在相同提取工艺条件下 ,毛状根多糖对棉花枯
萎病菌和黄萎病菌表现出了相对较高的抑制作用 ,
对所试细菌则没有抑制作用 ,推测毛状根中多糖的
组分及其含量可能是其抑制作用的主要因子 。毛状
根中多糖的组分及其含量有待进一步研究。
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(编辑:李　川)
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