全 文 ：新疆紫草快繁技术研究
郝爱花1 ,芦韦华1 ,陈永芳2 ,程琼浩1 ,孙新华1 ,王 芳1
(1.新疆农业大学 ,乌鲁木齐　830052 , ;2.山东省邹城第四中学 ,山东邹城　255000)
摘　要:【目的】建立新疆紫草组培快繁技术体系。【方法】以新疆紫草无菌苗的茎尖为外植体 , 筛选适合茎尖
萌发 、增殖 、生根的激素组合。【结果】茎尖最佳萌发培养基为MS+TDZ 1.0 mg/L , 其萌发率为 100%。芽增殖
培养基为 MS+TDZ 1.0 mg/ L , 芽增殖倍数为 13.50 倍 ,继代壮苗培养基为MS+NAA 0.3 mg/ L +6-BA 0.5
mg/ L ,生根培养基为 MS+NAA 0.1 mg/L ,生根率为84%。降低6-BA 浓度到 0.05 mg/ L可大幅降低玻璃化发
生率。经过此培养基继代后 ,再在原生根配方中生根 , 生根率提高到 95.32%。【结论】茎尖是新疆紫草快繁的
最佳外植体。
关键词:新疆紫草;离体快繁;玻璃化
中图分类号:S567.239.048　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-4330(2010)04-0726-05
Rapid Propagation of Arnebia euchroma(Royle.)
HAO Ai-hua1 ,LU Wei-hua1 ,CHEN Yong-fang2 ,CHENG Qiong-hao1 ,SUN Xin-hua1 ,WANG Fang1
(1.Xinjiang Agricultural University , Urumqi 830052 , China;2.Middle School No.4 in Zoucheng , Zouheng
Shandong ,255000 China)
Abstract:【Objective】The aim of the study was to establish rapid propagation system of Arnebia euchroma
(Royle.)Johnst.【Method】The proper combination of growth regulator was screened by using the stem -tip of
Arnebia euchroma(Royle)as a explant , proliferate and root-age.【Result】The results showed that the optimal
germination medium was MS +TDZ 1.0 mg/L , whose germination rate was 100% and the bud multiplication
medium was MS+TDZ 1.0 mg/L with 13.50 folds and successive healthy seedling medium was MS +NAA 0.3
mg/L+6-BA 0.5 mg/L , the best rooting medium was MS+NAA 0.1mg/L , the rate of rooting was 84%.Where
the consentration of 6-BA decreased by 0.05 , the rate of vitrification could be largely decreased and when cultured
in this medium , the rooting rate could increased to 95.32%.【Conclusion】Stem tip is the best explant of Arnebia
euchroma(Royle.)Johnst rapid propagation
Key words:Arnebia euchroma(Royle.)Johnst;rapid propagation in vitro ;vitrification
0　引言
【研究意义】新疆紫草(Arnebia Eeuchroma(Royle.)Johnst)习称软紫草 ,为紫草科药用多年生草本植
物 ,是我国传统药用紫草类植物临床药效最好的一种 ,其主要成分为紫草素 ,具有杀菌 、护肝 、抗肿瘤 、抗
生育等药理作用[ 1] 。紫草素在临床上用于治疗肝炎 、静脉炎 、血管性紫癜 、银屑病 、烧伤等多种疾病 ,同
时还是世界上常用的天然植物红色素中性能最好的一种 ,已被联合国食品添加剂法典委员会列入食品 、
化妆品 、药品添加剂范围[ 2] 。但随着需求量的大幅提高 ,近年来新疆紫草遭受疯狂采挖 ,生态环境被严
重破坏。因此保护新疆紫草种质资源 、提供稳定 、可持续利用的药材资源刻不容缓。对新疆紫草进行人
工快速繁殖是解决资源缺乏的重要途径之一 。【前人研究进展】关于新疆紫草的快速繁殖早已见报道 ,
但前人主要是利用根 、下胚轴 、子叶 、真叶等作为外植体诱导愈伤组织 ,再诱导其分化产生不定芽 ,继而
诱导生根获得再生植株[ 3 ,4] 。该途径繁殖周期较长 、植株再生率较低 ,且体细胞变异几率较高 ,如来自
愈伤组织的试管苗根尖细胞染色体为非 14 条的占2.9 %[ 5] ,不易保持原品种的典型一致性。而利用
收稿日期:2009-09-10
基金项目:国家自然科学基金项目(30560059);新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(200821170)
作者简介:郝爱花(1982-),女 ,山东人 ,硕士研究生 ,研究方向为细胞工程
通讯作者:王芳(1962-),女 ,甘肃人 ,教授 ,硕士生导师 ,研究方向为植物细胞工程及种子生理生态 ,(E-mail)wangfanghao@126.com
新疆农业科学　2010 ,47(4):726-730
Xinjiang Agricultural Sciences
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
茎尖诱导直接产生芽簇具有省时 、增殖倍数高 、遗传稳定性强等特点 ,常被用于花卉 、经济作物的快速繁
殖。【本研究切入点】目前未见以茎尖为外植体对新疆紫草进行离体快繁的报道 。【拟解决的关键问题】
以新疆紫草茎尖为外植体 ,研究不同激素组合对其形成丛生芽 、芽的增殖 、生根的影响 。旨在建立增殖
倍数高 、重复性好 、再生率高 、遗传稳定性强的快繁技术体系 ,从而为生产提供大量离体苗 、进行多倍体
育种及遗传转化奠定基础 。
1　材料与方法
1.1　材 料
新疆紫草种子由实验室提供。
1.2　方 法
1.2.1　无菌苗制备
种子去种壳后 ,经 75%的酒精浸泡 1 min ,放入 15%双氧水中浸摇 20 min ,再放入 500 mg/L 的抗生
素中浸摇 1 h ,无菌水冲洗 3 ～ 5次 ,接种于 MS培养基上 。
1.2.2　茎尖萌发及分化
取苗龄15 d左右的无菌苗 ,切去子叶和根及下胚轴的茎尖 ,接种到 MS附加 6-BA 0.5 ～ 2.0 、NAA
0.1 ～ 0.3 、TDZ 0.25 ～ 1.0 mg/L 不同激素组合的分化培养基中 。每个处理 30块外植体 ,培养 25 d后统
计下列各项指标 。
萌发率=(伸长茎尖数/接种总茎尖数)×100%.
褐化率=(褐化茎尖数/接种总茎尖数)×100%.
分化率=(芽簇分化数/接种总茎尖数)×100%.
1.2.3　丛生芽继代增殖
将上述培养基中已萌发的芽基部愈伤及子叶部分剪去 ,继续在原培养基中培养 ,每个处理 4瓶 ,每
瓶接种3棵单芽 。20 d后统计茎尖分化后芽增殖倍数及芽的生长状况 。
增殖倍数=(总芽数/接种单芽块数)×100%.
1.2.4　诱导生根
将增殖后的芽丛一部分可继续在筛选出的增殖培养基中继代增殖 ,一部分分成单芽 ,并转入继代壮
苗培养基MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L+AC 1.0中 ,继代周期为 20 d。生根培养基为 3/4 MS
附加NAA 0.1 ～ 0.5 mg/L、IBA 0.25 ～ 1.0 mg/L。培养 30 d后统计生根率 、根数及根长。
1.2.5　玻璃苗的控制
对于长期在继代增殖培养基TDZ 1.0中培养的芽 ,叶子有些玻璃化 ,但其基部没有完全玻璃化的芽
簇 ,将其分成单芽分别放到 BA 0.1 , 6-BA 0.5+NAA 0.1及 6-BA 0.5+NAA 0.3mg/L 培养基中 ,最后
观察出现玻璃化情况 。
玻璃化芽率=(玻璃化芽/繁殖总苗数)×100%.
1.2.6　培养条件
培养基中均添加水解酪蛋白(CH)0.5 g/L 、活性碳(AC)1.0 g/L ,pH 5.8 ,培养温度为 25℃±2℃,光
照时间16 h/d ,光强 2 500 lx 。
2　结果与分析
2.1　激素组合对起始培养阶段茎尖萌发的影响
将无菌苗茎尖接种于各种激素组合的培养基上 ,研究表明 ,在所试激素组合范围内 ,茎尖的萌发率
均较高 ,达 81%～ 100%,尤其以 TDZ的萌发率最高 ,为 95%～ 100%,表明 TDZ 对茎尖萌发的诱导效应
强于 6-BA与NAA的激素组合。表 1 ,图 1
当 BA浓度达到 2.0 mg/L 时 ,超出茎尖萌发时的耐受范围 ,此时 ,褐化率较高 ,萌发率较低 。TDZ 与
其相比表现较好 。在 6-BA 0.5+NAA 0.2 mg/L 及 6-BA 1.0+NAA 0.3 mg/L 两个组合中分化率最
高 ,分别达到 37%、38%,高浓度的 TDZ 也表现出一定的分化水平 ,但是与 6-BA与 NAA激素组合相比
其分化率稍低 ,表明芽簇分化所需求的激素种类及含量是影响芽簇分化的主要因子 。
·727·4期　　　　　　　　　　　郝爱花等:新疆紫草快繁技术研究　　　　　　　　　　　　　　　
表 1　激素组合对茎尖萌发及分化的影响
Table 1　Effects of hormonal combination on germunation and differentiation of shoot tip
激素组合(mg/ L)
Hormonal combination
萌发率(%)
Germination rate
褐化率(%)
Rate of browning
分化率(%)
Rate of diff erentiation
6-BA 0.5+NAA 0.1 90 10 14
6-BA 0.5+NAA 0.2 93 7 37
6-BA 0.5+NAA 0.3 100 0 30
6-BA 1.0+NAA 0.1 94 6 35
6-BA 1.0+NAA 0.2 92 8 33
6-BA 1.0+NAA 0.3 94 6 38
6-BA 2.0+NAA 0.1 92 8 23
6-BA 2.0+NAA 0.2 90 10 15
6-BA 2.0+NAA 0.3 81 19 0
TDZ 0.25 100 0 0
TDZ 0.5 100 0 0
TDZ 0.75 100 0 4.2
TDZ 1.0 100 0 11.2
TDZ 2.0 80 20 12
2.2　激素组合对芽簇形成及芽生长的影响
单独使用 TDZ 时 ,芽簇的增殖倍数较高为 8.5 ～ 13.5倍 ,而 6-BA与 NAA激素组合最高的增殖倍
数为 4.75倍。表明在继代增殖过程中 TDZ 更有利于芽簇的形成 。在所试浓度范围内 ,随着 TDZ 浓度
的升高 ,芽的增殖倍数逐渐增大 ,当 TDZ为 1.0 mg/L 时 ,芽的增殖倍数达峰值为 13.5倍 ,且无玻璃化现
象 ,叶片长 ,叶色浓绿 。当 TDZ浓度为 2.0 mg/L 时 ,芽的增殖倍数开始下降为 9.42倍 ,芽变得弱小 ,且
玻璃化现象趋于严重 ,表明 TDZ 过高过低都不利于芽增殖 ,因此诱导芽簇形成的最佳激素组合是 TDZ
1.0 mg/L ,这与江波[ 6]在诱导新疆紫草直接器官发生中激素 TDZ的浓度一致 。图 2 ,图 3
研究表明 ,当6-BA浓度低于 1.0时 ,芽的生长较快 ,芽高为1.5 ～ 2.2 cm ,且健壮 ,而含TDZ的芽高
均在 0.5 cm 以下 ,表明 6-BA 与NAA 组合有利于芽的生长。单独使用 TDZ 较 BA 明显促进芽簇的形
成 ,但芽不伸长 ,能用于生根的有效苗数相对较少 。因此 ,要经过壮苗培养后再对其生根 ,生根获得的有
效苗会增多。这与师校欣等研究一致[ 7] 。TDZ 是一种苯基脲衍生物 ,已广泛应用于植物的离体再生研
究[ 8] 。表 2
表 2　激素组合对芽增殖的影响
Table 2　Effects of hormonal combination on bud multiplication
激素组合(mg/ L)
Hormonal combination
接种块数
Inoculated plantlets
总芽数
Total number
of bud
增殖倍数
Multiplication
芽的高度(cm)
Height of bud
丛生芽的生长情况
Growth of crowd buds
6-BA 0.5+NAA 0.1 12 36 3.00 2 苗壮 ,叶浓绿
6-BA 0.5+NAA 0.2 13 29 2.23 2 苗壮 ,叶绿
6-BA 0.5+NAA 0.3 12 18 1.50 2.2 苗壮 ,叶茂
6-BA 1.0+NAA 0.1 12 57 4.75 2 苗壮 ,叶浓绿
6-BA 1.0+NAA 0.2 12 36 3.00 1.5 苗壮 ,叶浓绿
6-BA 1.0+NAA 0.3 12 30 2.50 1.5 苗壮 ,叶绿
6-BA 2.0+NAA 0.1 12 40 3.33 0.5 叶片部分卷曲
6-BA 2.0+NAA 0.2 12 26 2.58 <0.5 叶片卷曲
6-BA 2.0+NAA 0.3 9 22 1.78 <0.5 部分芽有玻璃化倾向
TDZ 0.25 12 102 8.50 <0.5 紧凑的芽丛块
TDZ 0.5 12 117 9.75 <0.5 紧凑的芽丛块
TDZ 0.75 12 129 10.75 <0.5 部分分化出壮苗
TDZ 1.0 12 162 13.50 >0.5 大量分化出壮苗
TDZ 2.0 12 113 9.42 <0.5 紧凑芽丛块及部分玻璃化
2.3　诱导芽生根
将生长较为健壮的芽转入壮苗培养基中继代两次后 ,对于完全独立的苗可以转入生根培养基 ,单独
使用NAA的生根效应明显较 IBA强 。当NAA为 0.1 mg/L时生根率达最高为 84.21%,随着NAA浓度
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的升高 ,其生根率及根长呈下降趋势 ,根数呈上升趋势 。图 4 ,图 5 ,表 3
表 3　激素组合对芽生根的影响
Table 3　Effects of hormonal combination of on buds rooting
激素组合(mg/ L)
Hormonal combination
生根率(%)
Rate of rooting
根数
No.of roots
根长(cm)
length
NAA 0.1 84.21 11.56 1.5
NAA 0.25 64.00 12.25 1.1
NAA 0.5 23.33 13.29 0.8
IBA 0.25 35.14 11.23 1.1
IBA 0.5 29.17 12.29 1.2
IBA 1.0 53.33 14.67 1.5
2.4　玻璃化苗的控制
当6-BA降至 0.05 mg/L时 ,玻璃化率大幅下降为 5.66%,有效地防止了玻璃化现象的发生 ,且不
影响其增殖 。其增殖倍数为 2.65 ,原因可能是因为经过连续两次在 6-BA 0.05 mg/L培养基中培养 ,玻
璃化现象明显得到改善 ,并且在之后的诱导生根中 ,其生根率(95.32%),较继代壮苗后直接生根率(生
根率为84.21%)高 ,且继代壮苗培养基对玻璃化现象无防治能力 ,因此继代壮苗后 ,可降低其 BA到 0.
05 ,即达到防止玻璃化又可以提高其生根率 。表 4 ,图 6
表 4　激素浓度对玻璃化苗的影响
Table 4　Effect of different hormonal concentrations on vitrification seeding
培养基(mg/ L)
Medium
接种芽数
Inoculated
bud number
增殖总芽数
Total bud of
multiplication
增殖倍数
Multiplying
folds
玻璃化芽数
Vitrifi cation
bud number
玻璃化率(%)
Rate of vitrification
plantlets
6-BA 0.05 40 106 2.65 6 5.66
6-BA 0.5+NAA 0.1 40 135 3.38 126 93.33
6-BA 0.5+NAA 0.3 40 110 2.75 110 100
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3　讨论
离体快繁需经历茎尖的起始培养 、芽的分化与增殖 、生根等阶段 ,由于各环节培养对象的生理状态 、
内源激素水平均有差异 ,所以外源激素组合也有所不同 。外源激素的种类及其配比与培养对象的存活 、
生长和发育程度密切相关 ,适宜的激素组合不仅能够提高繁殖效率 ,缩短培养时间 ,还能减少玻璃化几
率 ,降低成本等 ,因此摸索各环节的激素种类及其配比是离体快繁成功的关键。
许多研究表明 ,试管苗玻璃化是内部生理失调的外在表现。增强透气性及光照 、降低渗透势(增加
蔗糖浓度)及激素等均有利于防止玻璃化产生[ 9 ,10] 。研究发现 ,在长期继代增殖过程中 ,芽的玻璃化现
象较易发生 ,这与陈龙清等[ 11]研究结果一致 ,其主要原因是继代增殖中细胞分裂素不断积累所致。因
此 ,在继代过程中不要连续在增殖培养基中培养超过 3代 ,连续培养两代后转入 6-BA 0.05 mg/L 的培
养基中培养1 ～ 2代 ,再转入增殖培养基中继续增殖 ,可有效防止因激素积累过多造成的玻璃化现象。
4　结论
研究使用 TDZ 及 6-BA与NAA两种激素组合进行起始培养 、增殖和壮苗及玻璃化的防治 ,结果表
明 ,在起始培养阶段经25 d的培养 ,TDZ的茎尖萌发率达 95%～ 100%,当 TDZ 1.0 mg/L时其分化率稍
低为 11.2%,但芽的增殖倍数明显较高为 13.5倍 。此外 ,6-BA与 NAA激素组合表现出促进芽的健壮
生长 。长期增殖继代容易导致玻璃化 ,可以降低 6-BA到 0.05 mg/L继代 ,起到防止玻璃化的产生 ,其
玻璃化率仅为 5.66%,与用 6-BA 0.5 mg/L及 NAA 0.3 mg/L相比玻璃化发生率明显降低 ,另外经此培
养基继代后再去生根 ,生根率为95.32%。比壮苗后直接生根生根率为84.21%要高出许多。
因此 ,新疆紫草快繁技术路线为:利用 TDZ 诱导茎尖萌发及分化※利用 TDZ 诱导芽簇的形成及增
殖※6-BA与NAA激素组合培养壮苗(如果苗的高度达到 2 cm此环节可省)※低浓度 6-BA中培养 ,
防止玻璃化发生※NAA促进芽的生根 。从而建立了新疆紫草重复性好 ,增殖倍数高 ,培养时间短的高
效快繁体系 ,为生产提供组培苗 、进行多倍体育种及遗传转化奠定了理论和技术基础 。
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